Name: Yalıtım, karakterizasyonu ve yüksek işlem hacmi ekstraselüler akı analiz fare birincil Renal tübüler epitel hücresi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Öğrenin fare primer renal tübüler epitel hücrelerinin yalıtımı ve karakterizasyonu için yüksek işlem hacmi ekstraselüler akı analizi yöntemini. Bu teknik mitokondriyal biyoenerjik ve renal metabolizma çalışmalarında kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu eser Lina A. Shehadeh için aşağıdaki hibe tarafından desteklenmiştir: Ulusal Sağlık Enstitüsü (R56HL132209 ve 1R01HL140468) ve Miami kalp Araştırma Enstitüsü.

Tüm deney hayvanları içeren kurumsal hayvan bakım ve kullanım NIH yönergelere uygun Komitesi Miami Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. levha kaplama ve reaktifler hazırlanması
<ol><li>Kollajen kaplama hazırlayın:<ol>
<li>Kollajen 35 μL ekleyin ben 2 mL tek 60mm Petri kabına üzerine önceden filtre uygulanmış 20 mM asetik asit çözeltisi için. 1s için oda sıcaklığında kuluçkaya, bu kurumasına ve UV için maruz kalmaktadır.</li>
		<li>Kaplama yıkama herhangi bir asit artıklarını çıkarın ve 37 ° C CO2' kaydetmek için PBS ile 3 x-kadar hücreleri tohum için hazır boş hücreye kültür kuluçka makinesi. Kollajen kaplama son konsantrasyonu 5 μg/cm2' dir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Perfüzyon arabellek hazırlamak: PBS için 30 mL penisilin-streptomisin (P/S) 300 μL ekleyin ve yalıtım başlayana kadar bir 37 ° C su banyosunda karışımı sıcak.</li>
	<li>Sindirim arabellek hazırlamak: 3,9 mg, collagenase tip 2 30 mL içine PBS çözülür, çözüm 0,2 mikron şişe-ilk filtre ile filtre ve yalıtım başlayana kadar 37 ° C'de bir su banyosunda sıcak.</li>
	<li>Hücre kültür ortamı hazırlayın:<ol>
<li>Takviyeleri oda sıcaklığına getirmek. Filtrasyon, ek (0.05 mL fetal buzağı serum, epidermal büyüme faktörü, insülin, epinefrin, 36 ng/mL hidrokortizon, transferrin 5 μg/mL ve triiodo-L-thyronine 4 pg/mL 0.5 μg/mL 5 μg/mL 10 ng/mL) 500 mL için böbrek ekleyin epitel hücre büyüme bazal Orta 2.</li>
		<li>Medya kullanmaya hazır olana bir 37 ° C su banyosunda ısıtın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bileşikler hazırlamak: 50 mM FCCP hazırlamak, 10 mM rotenon, 10 mM oligomycin, 10 mM antimycin A, 50 mM L-karnitin ve 50 mM etomoxir DMSO, aliquot tüm çözümlerinde onları stok ve -20 ° C'de bileşikleri depolamasını</li>
	<li>2.5 mM sodyum palmiat 220 mL 150 mM NaCl çözeltisi hazırlamak ve palmiat tamamen eriyene kadar bir 75 ° C su banyosunda çözüm ısın.</li>
	<li>Sığır serum albumin (BSA) hazırlamak: 0,34 mM BSA 150 mM NaCl 250 ml yağsız hazırlamak. Denetim BSA takip adım 1.8 hazırlanabilir palm-BSA çözüm için bir negatif kontrol olarak hizmet vermektedir.</li>
	<li>BSA (Palm-BSA) için palmiat eşlenik:<ol>
<li>Hala sıcakken palmiat çözüm BSA çözüm içine yavaş yavaş ekleyin. O zaman, pH 7.4 için ayarlamak ve bunları konjugasyon tamamlamak en az 1 h için 37 ° C'de karıştırın.</li>
		<li>Konjugasyon tamamlandığında, başka bir 150 mL 150 mm NaCl ekleyin, iyice karıştırın ve aliquots-20 ° C'de kaydetme Nihai çözüm ve yağ asidi substrat hücreleri ekstrasellüler akı yağ asidi tabanlı tahlil için kullanılan 1 mM sodyum palmiat ve 0.17 mM BSA içerir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücre dışı akı tahlil bazal medya hazırlayın:<ol>
<li>1 DMEM toz torba ve 200 mm L-glutamin (4 mM son) 20 mL 1 litre autoclaved dH2O ve onları hafifçe karıştırın.</li>
		<li>Bioenergetics deneme günü, 100 µM sodyum pyruvate glikoz - veya yağ asidi - tabanlı solunum assay olarak kullanılmak üzere hücre dışı akı tahlil medya sonraki hazırlıkları için hazırlanan bazal medya ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Glikoz tabanlı medya hazırlayın:<ol>
<li>Hücresel solunum kapasitesi glikoliz yoluyla ölçmek için yukarıda açıklanan adım 1.9 bazal medya 17.5 mM glikoz toz, 100 µM kontrol BSA (adım 1.7 açıklandığı gibi) ve 20 µM etomoxir (yağ asidi oksidasyon etkisizleştirmek için) ekleyin.</li>
		<li>Medya 37 ° C'de ısınmak, pH 7.4 için ayarlamak ve bir hücre dışı akı tahlil kullanılana kadar 37 ° C su banyosu içinde saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yağ asidi tabanlı medya hazırlayın:<ol>
<li>Hücresel solunum kapasitesi yağ asidi oksidasyon yoluyla ölçmek için eklemek 10 mM 2D-glikoz toz (glikoz glikoliz etkisizleştirmek için analog), 100 µM Palm-BSA (olarak açıklandığı adım 1.8) ve 100 µM L-karnitin bazal medya için yukarıda açıklanan adım 1.9.</li>
		<li>Medya 37 ° C'de ısınmak, pH 7.4 için ayarlamak ve ekstraselüler akı tahlil kullanılana kadar 37 ° C su banyosu içinde saklayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. perfüzyon, sindirim ve hasat böbrekler üzerinden fareler
<ol><li>Fare bir isoflurane akışı ile anestezi ve sırtüstü pozisyonda düzeltebilirim. Yalıtım sadece hayvan iyileştiren onun refleksleri kaybeder ve anestezik derinlik çimdik değerlendirmeler öncesi ve sırasında yordamı22atravmatik forseps kullanarak tarafından izlenen sonra başlar emin olun.</li>
	<li>Kürk, fare göğüs, karın bölgesi için depilatory bir krem kullanarak çıkarın, iyot ile dezenfekte ve iyot kalıntısı silin.</li>
	<li>Göğsünden bir kesi yapmak, bütün karın bölgesi açmak için deriyi kesme ve kalp ve böbrekler bulaşmasına neden.</li>
	<li>Herhangi bir kabarcıklar perfüzyon başlamadan önce boru kaldırmak ve perfüzyon pompa 32 mL/dk ayarlayın.</li>
	<li>En kısa zamanda arabellek kalbini doldurur ve kalp tepe ile sol ventrikül 27-G iğne yerleştirin ve perfüzyon arabellek kalp pompa dolaşır ve sonunda sağ atrium çıkışından kaldırılır bir çıkış oluşturmak için sağ atrium poke.</li>
	<li>Perfüzyon sonra pompa hızı 30 mL/dk sindirim için geçiş yapın.</li>
	<li>Sindirim arabelleği 20 mL ile apex periosteum sonra her iki böbrek tübüler hücre izolasyon için kaldırın.</li>
</ol>3. doku işleme ve birincil tübüler hücreler yalıtım
<ol><li>Çıkarmak belgili tanımlık renal kapsül ve medulla, küçük parçalar halinde her iki böbrek kıyma ve onları bir sindirim arabellek 5 min için nazik döndürme 37 ° C fırında 10 ml kuluçkaya.</li>
	<li>Herhangi bir sindirilmemiş böbrek doku arabellek 70 mikron filtreden geçirerek kaldırın. Sindirim durdurmak için kültür ortamının 10 mL ekleyin.</li>
	<li>Borulu hücreleri toplamak için filtre uygulanan hücre süspansiyon 50 x g ilk Pelet toplamak 5 min için de santrifüj kapasitesi. Yeni bir tüp süpernatant aktarmak ve kültür ortamı, 50 x g tüm tübüler hücreler sağlamak 5 min için de ikinci Pelet toplanır santrifüj 5 mL ekleyin. Santrifüjü öncelikle ağır tübüllerin cips için daha düşük bir hızda olduğunu. Daha sonra hücrelerin izolasyonu iyileştikten sonra saf borulu kültür alt kültürler sırasında daha yüksek bir hızda centrifuged.</li>
	<li>İlk Pelet kültür ortamının 20 mL resuspend ve 50 x g üçüncü Pelet toplamak 5 min için de santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>İkinci ve üçüncü granül 1 mL kültür ortamının resuspend. Trypan mavi, 10 µL ile hücre süspansiyon Mix 10 µL karışımı bir sayım slayt ve odası kaydı ( Tablo malzemelerigörmek) hücre canlılığı otomatik sayaç hücre A yük.</li>
	<li>Tohum 107 hücreleri (türdeş olmayan nüfus) tek bir 60 mm çanak üzerine kadar kollajen ile ön kaplamalı ve geceleme eklemek tübüler hücreler izin.</li>
</ol>4. alt kültür ve karakterizasyonu birincil tübüler hücreler
<ol><li>Gün 1'den sonra izolasyon, Kültür medya toplamak ve 50 x g herhangi bir kayan tübüllerin cips 5 min için de santrifüj kapasitesi. Süpernatant kaldırmak ve hücre Pelet 4 ml taze Kültür Medya ve aynı kültür yemek için geri plaka resuspend.</li>
	<li>Gün 4'den sonra izolasyon, eski kültür ortamını çıkarın ve taze medya ekleyin.</li>
	<li>Gün 7 yalıtım sonra onları 2 ml % 0.25 tripsin-EDTA 5 dk. Ekle 3 mL tepki durdurmak ve 5 min için 250 x g de Santrifüjü tarafından hücreleri toplamak için kültür ortamının için 37 ° C'de kuluçka hücreleri bağlantısını kesin.</li>
	<li>Alt kültür ve P0 hücrelerden P1 için karakterize etmek için iyi bir 24-şey plaka üzerine başına tohum 5000 hücre kaplı kollajen ile ben yukarıda açıklandığı gibi.</li>
	<li>Adım 4.4, sonra 24 saat tamir % 4, P1 hücrelerle PFA 10 dk, permeabilize onları %0,2 ile Triton X-100 3 dk ve oda sıcaklığında 1 h için % 10 eşek serum (DS) ile engellemek.</li>
	<li>Seyreltik, 1: %100 10 için DS, her biri aşağıdaki proteinler: proksimal tübüler işaretleri angiotensinogen (AGT) ve aquaporin 1 (AQP1); distal borulu işaret E-cadherin; mesangial işaret CD90/Thy1; ve makrofaj işaretleri EGF benzeri modülü içeren müsin gibi hormon reseptör-1 (F4/80) ve küme farklılaşma 68 (CD68) gibi ve onları gecede 4 ° C'de hücrelerle kuluçkaya</li>
	<li>Ertesi gün, herhangi bir boyama kullanarak tespit 1: 200 Anti-tavşan da anti-fare Anti-sıçan floresan ikincil antikorlar 45 dk için. Ifade veri işaretleyicilerini, onaylamak için confocal mikroskobu altında görüntü Şekil 2Agösterildiği gibi al.</li>
	<li>Gün 3 sonra P1 alt kültür, bir alt kültür ve P2, karakterizasyonu için hücreleri boyama bir 4.5 adımda açıklanan borulu, mesangial ve makrofaj işaretleri bağlantısını kesin. Ifade veri işaretleyicilerini, onaylamak için confocal mikroskobu altında Şekil 2Agösterildiği gibi boyama görüntü.</li>
	<li>Gün 3 sonra P2 alt kültür, alt kültür ve karakterizasyonu, P3 için hücreleri 4.5 adımda açıklanan borulu, mesangial ve makrofaj işaretleri boyama tarafından bağlantısını kesin. Ifade veri işaretleyicilerini, onaylamak için confocal mikroskobu altında Şekil 2Agösterildiği gibi boyama görüntü.</li>
	<li>Doku boyama hazırlayın:<ol>
<li>Dondurulmuş yaban tipi ve oda sıcaklığında 1 h Col4a3- / - böbrek slaytlarını kurumasına ve bunları düzeltmek %4 ile 10 dakika süreyle PFA ile % 0,2 onları Permeabilize Triton X-100 10 dk için ve % 10 eşek serum (DS) Oda sıcaklığında 1 h ile engellemek. 1: 200, 4.5. adımda açıklanan marker proteinler karşı antikor ekleyin ve onları gecede 4 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>Ertesi gün, herhangi bir 1: 200 Anti-tavşan da anti-fare Anti-sıçan floresan ikincil antikorlar için 45 dk ile boyama algılamak. Görüntüler ifade işaretleri, onaylamak için confocal mikroskop altında rakamlar 2B ve 2 Cgösterildiği gibi tutar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. mitokondri Bioenergetics tahlil
<ol><li>Tohum P1 tübüler hücreler 20.000, 30.000 veya 100 μL 96-şey Mikroplaka üzerine kültür ortamının bir kuyu başına 40.000 hücreleri ön kaplamalı 5 μg/cm2 kollajen ile ben bir gün önce hücre dışı akı deneyleri.</li>
	<li>Sensör kartuş hidrasyon, sensör kartuşu kaldırın ve her doldurmak iyi bir kalibrasyon çözüm 200 μL plakalı. Dikkatle kartuş yük geri kalibrasyon çözüm sensörler daldırın. CO2 için en az 7 kullanılmadan önce s olmadan 37 ° C fırında kartuşu yerleştirin. En iyi sonuçlar için gecede kartuş hidrasyon önerilir.</li>
	<li>Bileşikleri hazırlamak: 8 µM oligomycin, 9 µM FCCP ve 20 µM Rotenon/antimycin A karışımı (1,10 adımda anlatılan) glikoz ve yağ asidi (açıklandığı adım 1.11) hücre dışı akı tahlil ortam hazırlamak.</li>
	<li>Medya değiştirme: hücre kültürü medya Aspire edin, 175 µL glikoz veya yağ asidi tahlil medya ekleyin (bağımlı olan bileşik, çalışmış olmak görmek adım 5.3) ve onları 37 ° C CO21 h için kuluçkaya-özgür kuluçka makinesi.</li>
	<li>Aşağıdaki bileşiklerin 25 µL kartuş çıkışıyla yük: 1 µM son bir konsantrasyon elde etmek bağlantı noktası A için 8 mikron oligomycin (Not: her şey medya 175 µL içerir gibi bileşik seyreltilmiş 8 alırsınız x), 9 mikron 1 son bir konsantrasyon elde etmek için FCCP bağlantı noktası B µM (Not: her de içeren medya 175 µL artı 25 µL--dan A bağlantı noktası enjekte çözüm olarak bileşik seyreltilmiş 9 alırsınız x) ve 20 µM Rotenon/antimycin A 2 µM her bileşik (Not için son bir konsantrasyon ulaşmak için Port C : her de içeren medya 175 µL artı 50 µL A ve B noktalarından enjekte çözüm olarak bileşik seyreltilmiş 10 alırsınız x).</li>
	<li>Su D bağlantı tüm wells ve arka plan Wells (hücreler) diğer tüm bağlantı noktaları ekleyin. 37 ° C CO2kartuşta kuluçkaya-10 min için özgür kuluçka makinesi.</li>
	<li>Hücre dışı akı analyzer ve denetleyici açın.</li>
	<li>Analyzer yazılımı açın ve aşağıdaki protokol giriş:<ol>
<li>Standart tahlilseçin. Tahlil Sihirbazıtuşuna basın. Bileşikler sekmesini kullanarak, bileşik düzen atayabilir ve deneysel grupları etiketlemek için gruplar ve Etiketler sekmesini kullanın. Arka plan olarak boş wells (olmadan hücreleri) atamak unutmayın.</li>
		<li>İletişim kuralı sekmesi altında Tablo 1' de gösterildiği gibi kullanılabilir komutlar kullanarak aşağıdaki mix ve ölçü birimi çevrimleri ayarla: kalibre, mix 2 min için 2 dk bekleyin ve 3 dak için ölçü (tekrar bu döngü 2-3 x); bağlantı noktası A, 2 dk için karışımı enjekte, 2 dk, 3 dk için ölçü bekleyin (Bu döngü tekrar 2-3 x); B bağlantı noktası enjekte, karıştırmak için 2 dk, 2 dk, 3 dk için ölçü bekleyin (Bu döngü tekrar 2-3 x); bağlantı noktası C enjekte, karıştırmak için 2 dk, 2 dk, 3 dk için ölçü bekleyin (2-3 x bu döngüsünü tekrarlayın). Bitiş Sihirbazıtuşuna basın. İleride kullanmak için geçerli şablon kaydetmek mümkündür.</li>
		<li>Kalibrasyon başlatmak için Başlat tuşuna basın. Belgili tanımlık çözümlemek sonra otomatik olarak plaka sahibi çıkarır ve eklenecek kartuş plaka için sorar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kalibrasyon adım (genellikle 20-25 dk) tamamlandığında, prompt komutunu hücre plakasına kartuş plaka değiştirmek ve Çalıştır devam etmek için tuşuna basın.</li>
	<li>Çalıştır tamamlandığında, verileri aktarmak ve 96-şey plaka kaldırın. Her tahlil Wells Höchst (1:1, 000) ekleyin ve onları 37 ° C'de 5 min için kuluçkaya 355-nm uyarma ve 460-nm Emisyon okuma Höchst floresans ölçüsü tarafından hücre sayısı için OCR verileri normalleştirmek.</li>
</ol>

<ol><li>Bielesz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+notch+signaling+regulates+interstitial+fibrosis+development+in+the+kidneys+of+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Epithelial notch signaling regulates interstitial fibrosis development in the kidneys of mice and humans.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (11), 4040-4054 (2010).</li>
<li>Fabian, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog-Gli+pathway+activation+during+kidney+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Hedgehog-Gli pathway activation during kidney fibrosis.</a> American Journal of Pathology. 180 (4), 1441-1453 (2012).</li>
<li>Forbes, J. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27215468">Mitochondria-power players in kidney function.</a> Trends in Endocrinology & Metabolism. 27 (7), 441-442 (2016).</li>
<li>Suzuki, T., Furusato, M., Takasaki, S., Ishikawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+mitochondria+in+the+epithelial+cells+of+the+proximal+convoluted+tubules+of+diseased+human+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Giant mitochondria in the epithelial cells of the proximal convoluted tubules of diseased human kidneys.</a> Laboratory Investigation. 33 (6), 578-590 (1975).</li>
<li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+accounts+for+aldosterone-induced+epithelial-to-mesenchymal+transition+of+renal+proximal+tubular+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction accounts for aldosterone-induced epithelial-to-mesenchymal transition of renal proximal tubular epithelial cells.</a> Free Radical Biology & Medicine. 53 (1), 30-43 (2012).</li>
<li>Kang, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+fatty+acid+oxidation+in+renal+tubular+epithelial+cells+has+a+key+role+in+kidney+fibrosis+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Defective fatty acid oxidation in renal tubular epithelial cells has a key role in kidney fibrosis development.</a> Nature Medicine. 21 (1), 37-46 (2015).</li>
<li>Al-Awqati, Q., Oliver, J. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11849378">Stem cells in the kidney.</a> Kidney International. 61 (2), 387-395 (2002).</li>
<li>Rocca, C. J., Ur, S. N., Harrison, F., Cherqui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rAAV9+combined+with+renal+vein+injection+is+optimal+for+kidney-targeted+gene+delivery%3A+conclusion+of+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery: conclusion of a comparative study.</a> Gene Therapy. 21 (6), 618-628 (2014).</li>
<li>Kamiyama, M., Garner, M. K., Farragut, K. M., Kobori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+establishment+of+a+primary+culture+system+of+proximal+tubule+segments+using+specific+markers+from+normal+mouse+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">The establishment of a primary culture system of proximal tubule segments using specific markers from normal mouse kidneys.</a> International Journal of Molecular Sciences. 13 (4), 5098-5111 (2012).</li>
<li>Terryn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primary+culture+of+mouse+proximal+tubular+cells%2C+established+on+collagen-coated+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">A primary culture of mouse proximal tubular cells, established on collagen-coated membranes.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 293 (2), F476-F485 (2007).</li>
<li>Tang, M. J., Suresh, K. R., Tannen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbohydrate+metabolism+by+primary+cultures+of+rabbit+proximal+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Carbohydrate metabolism by primary cultures of rabbit proximal tubules.</a> American Journal of Physiology. 256, C532-C539 (1989).</li>
<li>Gesek, F. A., Wolff, D. W., Strandhoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+separation+method+for+rat+proximal+and+distal+renal+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Improved separation method for rat proximal and distal renal tubules.</a> American Journal of Physiology. 253, F358-F365 (1987).</li>
<li>Vinay, P., Gougoux, A., Lemieux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+pure+suspension+of+rat+proximal+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Isolation of a pure suspension of rat proximal tubules.</a> American Journal of Physiology. 241 (4), F403-F411 (1981).</li>
<li>Taub, M., Chuman, L., Saier, M. H., Sato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Madin-Darby+canine+kidney+epithelial+cell+%28MDCK%29+line+in+hormone-supplemented%2C+serum-free+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Growth of Madin-Darby canine kidney epithelial cell (MDCK) line in hormone-supplemented, serum-free medium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (7), 3338-3342 (1979).</li>
<li>Chung, S. D., Alavi, N., Livingston, D., Hiller, S., Taub, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+primary+rabbit+kidney+cultures+that+express+proximal+tubule+functions+in+a+hormonally+defined+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of primary rabbit kidney cultures that express proximal tubule functions in a hormonally defined medium.</a> Journal of Cell Biology. 95 (1), 118-126 (1982).</li>
<li>Rubera, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride+currents+in+primary+cultures+of+rabbit+proximal+and+distal+convoluted+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Chloride currents in primary cultures of rabbit proximal and distal convoluted tubules.</a> American Journal of Physiology. 275, F651-F663 (1998).</li>
<li>Inoue, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+cultured+tubular+cells+isolated+from+human+urine+for+investigation+of+renal+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Use of cultured tubular cells isolated from human urine for investigation of renal transporter.</a> Clinical Nephrology. 53 (2), 90-98 (2000).</li>
<li>Van der Hauwaert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+a+primary+proximal+tubular+epithelial+cell+model+from+human+kidney+by+CD10%2FCD13+double+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of a primary proximal tubular epithelial cell model from human kidney by CD10/CD13 double labeling.</a> PLoS One. 8 (6), e66750(2013).</li>
<li>Helbert, M. J., Dauwe, S. E., Van der Biest, I., Nouwen, E. J., De Broe, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunodissection+of+the+human+proximal+nephron%3A+flow+sorting+of+S1S2S3%2C+S1S2+and+S3+proximal+tubular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Immunodissection of the human proximal nephron: flow sorting of S1S2S3, S1S2 and S3 proximal tubular cells.</a> Kidney International. 52 (2), 414-428 (1997).</li>
<li>Wen Ding, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteopontin+deficiency+ameliorates+Alport+pathology+by+preventing+tubular+metabolic+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Osteopontin deficiency ameliorates Alport pathology by preventing tubular metabolic deficits.</a> JCI Insight. 3 (6), (2018).</li>
<li>Quadri, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluoride-associated+ultrastructural+changes+and+apoptosis+in+human+renal+tubule%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Human+%26+Experimental+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Fluoride-associated ultrastructural changes and apoptosis in human renal tubule: a pilot study.</a> Human & Experimental Toxicology. , (2018).</li>
<li>Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S., Kurosawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+three+types+of+mixed+anesthetic+agents+alternate+to+ketamine+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Animals%22%5BJournal%5D)">Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice.</a> Experimental Animals. 60 (5), 481-487 (2011).</li>
<li>Condorelli, L., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-642-03900-3_15">Effect of fluid shear stress on tubular kidney epithelial cell structure.</a> World Congress on Medical Physics and Biomedical Engineering. 25 (10), 50-52 (2009).</li>
<li>Aschauer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delineation+of+the+key+aspects+in+the+regulation+of+epithelial+monolayer+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Delineation of the key aspects in the regulation of epithelial monolayer formation.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (13), 2535-2550 (2013).</li>
<li>George, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+use+of+autologous+renal+cells+from+diseased+kidneys+for+the+treatment+of+renal+failure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Potential use of autologous renal cells from diseased kidneys for the treatment of renal failure.</a> PLoS One. 11 (10), e0164997(2016).</li>
<li>Elberg, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MKL1+mediates+TGF-beta1-induced+alpha-smooth+muscle+actin+expression+in+human+renal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">MKL1 mediates TGF-beta1-induced alpha-smooth muscle actin expression in human renal epithelial cells.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 294 (5), F1116-F1128 (2008).</li>
<li>Elberg, G., Guruswamy, S., Logan, C. J., Chen, L., Turman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+epithelial+cells+derived+from+human+normal+and+ADPKD+kidneys+in+primary+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Plasticity of epithelial cells derived from human normal and ADPKD kidneys in primary cultures.</a> Cell and Tissue Research. 331 (2), 495-508 (2008).</li>
<li>Cai, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+acetaminophen%2C+salicylic+acid%2C+and+caffeine+for+first-passage+rat+renal+inner+medullary+collecting+duct+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Toxicity of acetaminophen, salicylic acid, and caffeine for first-passage rat renal inner medullary collecting duct cells.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 306 (1), 35-42 (2003).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+epithelial+co-culture+of+mouse+renal+peritubular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and epithelial co-culture of mouse renal peritubular endothelial cells.</a> BMC Cell Biology. 15, 40(2014).</li>
<li>Barros, M. H., Hauck, F., Dreyer, J. H., Kempkes, B., Niedobitek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarisation%3A+An+immunohistochemical+approach+for+identifying+M1+and+M2+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarisation: An immunohistochemical approach for identifying M1 and M2 macrophages.</a> PLoS One. 8 (11), e80908(2013).</li>
<li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+Alport+kidney+disease+in+Col4a3+knock+out+mice+is+independent+of+sex+or+macrophage+depletion+by+clodronate+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Progression of Alport kidney disease in Col4a3 knock out mice is independent of sex or macrophage depletion by clodronate treatment.</a> PLoS One. 10 (11), e0141231(2015).</li>
<li>Linnett, P. E., Beechey, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+the+ATP+synthethase+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of the ATP synthethase system.</a> Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).</li>
<li>Bockenhauer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+phenotype+in+Lowe+Syndrome%3A+a+selective+proximal+tubular+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Renal phenotype in Lowe Syndrome: a selective proximal tubular dysfunction.</a> Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 3 (5), 1430-1436 (2008).</li>
<li>Ranawaka, R., Dayasiri, K., Gamage, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+child+with+distal+%28type+1%29+renal+tubular+acidosis+presenting+with+progressive+gross+motor+developmental+regression+and+acute+paralysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">A child with distal (type 1) renal tubular acidosis presenting with progressive gross motor developmental regression and acute paralysis.</a> BMC Research Notes. 10 (1), 618(2017).</li>
</ol>

Yazarlar bildirmek için bir şey yok.

Biz fare renal tübüler epitel hücreleri (TECs) verimli yalıtım için sağlayan bir protokol en iyi duruma getirilmiş ve hücreleri huzurunda yağ asidi - mitokondrial solunum değerlendirmek bir hücre dışı akı analiz için alt kültürlü olduğunu gösterdi ve/veya glikoz tabanlı yüzeylerde. Bu iletişim kuralı proksimal ve distal tübüler hücreler üzerinde odaklanan çalışmalar için tasarlanmıştır ve bir çerçeve ile hangi TEC patoloji ilişkili böbrek hastalıkları anlamak için daha karmaşık denemeler oluşturmak için hizmet vermektedir. Daha önce yayımlanmış protokolleri9,10,19' a göre bu yöntem uzun aralıklarla kez veya bir yeterli antikor kullanımı ile degrade renk ayrımları için sıralama gerektirmeyen ve, bu nedenle, bir daha sunuyor verimli ve en iyi duruma getirilmiş renal tübüler metabolik alanında çalışan araştırmacılar için Kılavuzu. Bu iletişim kuralı, sindirim, yeniden toplama ve kaplama yoğunluğu ve ekstraselüler akı tahlil için bileşik optimizasyon dahil olmak üzere çeşitli kritik adımlar vardır.
Collagenase ve en iyi konsantrasyon doğru türünü seçme başarılı sindirim ve ayrılma tübüler hücre böbrek doku üzerinden anahtarıdır. Collagenases, diğer türleri için karşılaştırıldığında, tip 2 collagenase proteaz aktivitesi, kompakt böbrek yapıları dissociating yetenekli nispeten yüksek düzeyde içerir. Kirlenme sonucu olarak uzun süreli perfüzyon ve sindirim zaman olasılığını en aza indirmek için %0,013 tip 2 collagenase 30 mL/dk derin. Her iki böbrek hayvan--dan hasat ve steril hücre kültür kukuIeta transfer sonra böbrek kapsülü sadece kaldırıldı. Böbrekler küçük parçalar halinde kıyılmış ve 10 mL ile onların kuluçka bir sindirim arabellek tam sindirim ve tübüler hücre maksimal serbest bırakmak için başka bir 5 min için devam etti.
Rağmen sindirim sonra doku süspansiyon çok büyük doku parçaları kaldırmak için 70 µm filtreden geçirilir, hala sindirilmemiş tübüllerin filtreden geçmek ve hücre süspansiyon içinde kalıp kültür çanak kaplama olacak. Tübüler hücreler serbest bırakmak ve sıkıca kültür yemek için eklemek bu tübüllerin için normalden daha uzun bir zaman alır. Bu nedenle, bu hücre süspansiyon toplamak ve bekâr tübüllerin ve hücreleri hücre kaplama sonra ikinci gün cips için santrifüj kapasitesi oldukça önemlidir. Bu düşük hızlı Santrifüjü adım daha fazla tübüler hücreler hafif olan diğer hücre tipleri kaldırır ve bekâr tübüllerin ve tübüler hücreler için yerleşmek izin verir.
Uygun hücre yoğunluğu başarılı ekstraselüler akı tahlil için ilk ve önemli adım tanımlamasıdır. Sonuçlar iyi bir XF96 Mikroplaka başına 40.000 hücreleri bir yağ asidi ve glikoz tabanlı solunum tahlil (Şekil 3 c) birincil tübüler hücreler için ideal olduğunu gösterdi. Bu protokol için izole tübüler hücreler pasajlar 1 ve 2, hücre dışı akı tahlil için kullanılmıştır. Her ne kadar borulu işaretleri (Şekil 2) ve bioenergetics deneyleri (Şekil 3A) iyi bir performans bir ifade muhafaza ve geçit 2 karşılaştırıldığında düşük bazal solunum düzeyleri gösterdi 3, geçiş için alt kültürlü hücreleri ( Şekil 3A Şekil 3 ciçin en sağdaki panelleri OCR karşılaştırarak gösterilmiştir). Bu düşüş önemli ölçüde sağlıklı tübüler hücreler (örneğin, olanlar genç vahşi tipi fareler izole) etkiler değil. Ancak, zaten azalmış mitokondrial solunum var CKD fare modellerden izole hücreleri üzerinde çalışmalar için hücrelerin daha yüksek pasajlar ekstraselüler akı tahlil sonuçlarını etkileyen bazal solunum daha da azalmasına neden olabilir. Burada, Bölüm 1 ve Bölüm 2 yüksek gösterdi bazal solunum düzeylerinin hücre yürütülen çalışmalar içinde. Bu nedenle, bu protokolü bu iki erken bölümler ile sağlıklı ve hastalıklı hayvanlardan izole hücre mitokondrial solunum çalışmaları için kullanmanızı öneririz. Eğer geçiş 1 alt kültür akı tahlil için yeterli hücre verim hücreleri geçiş 2 hala göz önüne alınmalıdır. Bioenergetics çalışmalar yanı sıra, önceki araştırma birincil TECs passage 3, ardından protein ve RNA çalışmalar (veri gösterilmez) bileşikleri ile tedavisi son derece yararlı olabileceğini gösterir. Bu söyleniyor, biz borulu hücreleri izole etmek için bu iletişim kuralını kullanan araştırmacılar farklı araştırma uygulamaları için en uygun geçiş dikkatle seçmeniz gerekir öneririz.
Hücre dışı akı analiz çalışma prensibi eklenen bileşikler ve solunum zinciri kompleksleri ve uncoupler etkisi arasındaki etkileşimler temel alır. Oligomycin bir inhibitörü karmaşık v (ATP sentaz) ve ATP bağlı oksijen tüketimi ve düzenli proton sızıntı mitokondriyal iç zar32arasında üstesinden gelmek için gerekli oksijen tüketimi ayırt etmek için kullanılır. FCCP oksijen tüketimi ATP üretimi mitokondri zar potansiyel kesintiye tarafından uncouples. Böylece, bir proton taşıma membran aracılığıyla izin vererek ATP sentaz tarafından bir proton iyon sızma kapasitesi sınırlı circumvents olarak maksimal solunum kapasitesinin bir ölçüm sağlar. Antimycin-A, karmaşık III inhibitörü ve rotenon, karmaşık bir ben engelleyici, birlikte mitokondrial vs arasında bir farklılaşma mitokondrial Sigara oksijen tüketimi sağlayan tüm mitokondrial solunum kapatmasına izin kullanılır hücreler. Bu bileşiklerin her zaman en iyi OCR eğrileri verim en uygun konsantrasyonlarda belirlemek belirli hücre için bir türü hücre dışı akı tahlil önce titre. Burada, oligomycin, FCCP, 1 µM ve Rotenon/antimycin A birincil TECs ekstraselüler akı tahlil için 2 µM 1 µM öneririz.
Sonuç olarak, bu iletişim kuralını mitokondriyal bioenergetics ex vivodeğerlendirmek için kullanılan böbrek birincil proksimal ve distal borulu epitel hücreleri izole etmek için basit ve maliyet-etkin bir şekilde sağlar. Bu iletişim kuralı renal tübüler epitel hücrelerinin biyolojik işlevi keşfetmek moleküler biyoloji çalışmaları geniş bir alanda yararlı olabileceği sınırlamaları saf distal veya proksimal tübüllerin gerektiren çalışmalar uygularken anıyoruz. Örneğin, çalışmalar Lowe sendromu, bir seçici proksimal tübüler fonksiyon bozukluğu33veya distal renal tübüler asidoz, distal borulu disfonksiyon34, derslerine daha sofistike bir protokol hücre izolasyon için gerektirecektir ve Arıtma. Ancak, tübüllerin vs glomeruli karşılaştırmak çalışmalar çoğunluğu için ve potansiyel mitokondrial solunum düzenleyiciler tübüler hücrelerde genel ekran etütler protokol bir uygun yüksek işlem hacmi yaklaşım sağlar. Bu nedenle, bu iletişim kuralını mitokondrial disfonksiyon uyuşturucu keşif ya da hedef doğrulama amaçlı böbrek bozuklukları ile ilişkili çalışmaya geniş uygulamalar olabilir.

Renal tübüler epitel hücreli (TEC) işlevi şiddetle böbrek genel sağlık durumu ile ilişkilidir. Patolojik sinyal böbrek böbrek fibrozis ve kronik böbrek hastalığı (CKD)1,2büyük bir rol oynayan dedifferentiation TECs, neden olur. Bir son derece enerjik, böbrek öncelikle mitokondriyal Oksidatif fosforilasyon3ile oksijen tüketimini kalbinde sadece ikinci organdır. Elektron Mikroskopisi çalışmaları mitokondrial morfolojik değişiklikler renal tübüllerin4patolojik olaylara pozitif bir korelasyon indirdik. Mitokondrial disfonksiyon TECs epitel mezenkimal için geçiş5 ve arızalı yağ asidi oksidasyon6böbrek fibrozis neden olur. Fibrozis CKD içinde sonuç ilerici bir böbrek patoloji olduğunu. Bu nedenle, böbrek TECs enerjik durumu hakkında bilgi CKD Patofizyoloji ortaya çıkarmak için bir zorunluluktur.
Yetişkin böbrek7' > 20 hücre türü vardır. TECs işlevinin çalışması için bir birincil kültür renal epitel hücrelerinin kimyasal tedaviler ve genetik manipülasyon gibi moleküler biyoloji uygulamaları için bir platform olarak gereklidir. Önemlisi, genetik manipülasyon vivo farelerde transgenesis üzerinden veya izole primer hücre zaten genetik olarak manipüle böylece AAV gen teslim teknikleri8 kullanarak yapılabilir. Fareler9,10, fareler11,12,13, köpek dişleri14, tavşan15,16ve insanlar17 birincil renal tübüler hücre izolasyon ,18 arıtma adımlarla saf proksimal tübüler hücreler vermeye bildirilmiştir. Proksimal tübüler hücreler yalıtım üzerinde odaklanmak Bu daha önce yayımlanan Protokoller'de degrade Santrifüjü ve deneyler sıralama arıtma amaçları19için yapıldı. Bu protokoller proksimal tübüllerin eğitimi için değerli olmakla birlikte, proksimal ve distal tübüllerin belirlenmesi için gerektiğinde onlar yeterli değildir. Örneğin, bizim çalışma Alport sendromu proksimal ve distal renal tübüllerin önemli roller içinde hastalık ilerleme20oynamak ve bu nedenle böbrek tübüllerin her iki tür kültürde araştırılmalıdır ortaya koymuştur. Böbrek florür zehirlenmesi üzerinde yapılan bir çalışmada da patolojik değişiklikler her iki proksimal ve distal tübüllerin21gerçekleşti gösterdi. Bu nedenle, bu yalıtım Protokolü tasarlanmış ve proksimal ve distal tübüler hücreler fare böbrekler reaktifler ve basit işlemleri en az maliyetle üzerinden için optimize edilmiş. Alternatif olarak, müfettişler yine protokol adım 3.1 kadar izleyin ve saf proksimal tübüler hücre izolasyon için bu aşamadan itibaren arıtma adımlar9 eklemek.
İzole hücreler enerjik düzeyi yüksek sunmak ve alt kültürler 4 pasajlar için sonra renal epitel özellikleri korumak. Yüksek işlem hacmi ekstraselüler akı çözümleyicisini kullanarak, doğrudan içinde daha fazla hücre yoğunluğu en iyi duruma getirme anlayışlar yol açar bir 96-şey plaka izole TECs mitokondrial solunum değerlendirmek. Bu gözlemler bu protokolü renal tübüler ex vivo çalışmalar tutarlı, iyi standart üretim olan böbrek TECs uygulanabilir öneririz. Bu protokole eklenen bir önemi onun uygun böbrek proksimal ve distal tübüler hücrelerde mitokondrial bioenergetics ex vivo karakterizasyonu için yüksek aktarım aracı olarak kullanılmasıdır. Bu nedenle, uyuşturucu ya da uyuşturucu karakterizasyonu böbrek bozuklukları amaçlarından için bir platform olarak hizmet verebilir.

<table><tbody><tr><td>Kollajen I Sıçan Proteini, Kuyruk</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1048301</td><td></td></tr><tr><td>Asetik Asit</td><td>J.T.Baker</td><td>9508</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz Tip II</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (%0.25)</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Renal Epitel Hücre Büyüme Ortamı 2 Kiti</td><td>PromoCell</td><td>C-26130</td><td></td></tr><tr><td>2-Deoksi glikoz</td><td>Sigma</td><td>D6134</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>L-Karnitin</td><td>Sigma</td><td>C0283</td><td></td></tr><tr><td>Etomoksir</td><td>Sigma</td><td>E-1905</td><td></td></tr><tr><td>Oligomisin</td><td>Sigma</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>Karbonil siyanür 4- (triflorometoksi) fenilhidrazon (FCCP)</td> <td>Sigma</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Antimisin-A</td><td>Sigma</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümini (BSA)</td> <td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum palmitat</td><td>Sigma</td><td>P9767</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum piruvat</td><td>Sigma</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin 200mM çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>DMEM tozu</td><td>Sigma</td><td>D5030-1L</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>LifeTechnologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavisi Boyama (%0,4)</td><td>LifeTechnologies</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Sayma Slaytları</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>Mikro Diseksiyon Forseps</td><td>Roboz</td><td>RS-5101</td><td></td></tr><tr><td>TC10 otomatik hücre sayacı</td><td>Bio-Rad</td><td>506BR2119</td><td></td></tr><tr><td>MINIPULS 3 Peristaltik Pompa</td><td>Gilson Inc.</td><td>GM3P</td><td></td></tr><tr><td>Denizatı XFe96 Analizörü</td><td>Denizatı Biyobilim</td><td>S7800A</td><td></td></tr><tr><td>Denizatı XFe96 FluxPack (sensör kartuşları, mikroplakalar ve kalibrasyon içerir)</td><td>Denizatı Biyobilimi</td><td>10260-100</td><td></td></tr></tbody></table>

yalıtım, karakterizasyonu ve yüksek işlem hacmi ekstraselüler akı analiz fare birincil renal tübüler epitel hücresi

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

Mitokondrial disfonksiyon renal tübüler epitel hücrelerinde (TECs) böbrek fibrozis, önemli bir nedeni, kronik böbrek hastalığı (CKD) yol açabilir. Bu nedenle, birincil TECs mitokondriyal işlevde değerlendirirken Biyo-enerjetik durumu CKD Patofizyoloji görmemizi sağlayan hücreler hakkında değerli bilgiler sağlayabilir. Yalıtım ve proksimal tübüllerin farklı türlerin arıtma için kullanılabilir bir dizi karmaşık Protokolü iken, alan tübüler hücre izolasyon ezelî belgili tanımlık lüzum için arıtma için en iyileştirilmiş düşük maliyetli bir yöntem yoktur. Burada, biz üzerinde ana odak çalışmaları proksimal ve distal renal TECs fare için izin veren bir yalıtım Protokolü sağlar. Düşük maliyetli reaktifler ve bu protokol için gerekli en az hayvan yordamlar, ek olarak izole hücreler yüksek enerji düzeyine sonra yalıtım korumak ve dört pasajlar, sürekli çalışmaları için izin kadar alt kültürlü olabilir. Ayrıca, bir yüksek işlem hacmi ekstraselüler akı Çözümleyicisi'ni kullanarak, biz doğrudan içinde izole TECs için hücre yoğunluğu ve bileşik toplama optimizasyonu için öneriler sağlayan bir 96-şey plaka mitokondrial solunum değerlendirmek. Bu gözlemler bu protokolü tutarlı, iyi standart üretim olan böbrek TECs renal tübüler ex vivo çalışmalar için kullanılabilir öneririz. Bu iletişim kuralı mitokondrial disfonksiyon uyuşturucu keşif ya da uyuşturucu karakterizasyonu amaçları için böbrek bozuklukları ile ilişkili eğitim için daha geniş gelecekteki uygulamalar olabilir.

Böbrek perfüzyon ve sindirim son derece borulu epitelyal hücrelerin verim: Fare renal tübüler epitel hücresi yukarıda açıklanan protokol 1-3 bölümlerinde anlatılan adımları izleyerek izole edildi.
Sonra sindirim, böbrek hücreleri, eksik olarak sindirilir tübüllerin ve 70 µm küçük olan diğer doku enkaz türdeş olmayan nüfusu kaplama kültür çanak yalıtım gününde. Yalnızca hücre eki yerine hücre büyüme görülecek yalıtım genellikle beklenen sonra 1 gün için gün 0 değişiklikleri. Kayan hànzú nüfus baktığımda, sadece birkaç tübüler hücreler gün 1 (Şekil 1A) bağlıydı. 1. gün, hücreler, bir Santrifüjü ve yeniden kaplama yeniden topluluğu ışık enkaz kaldırma ve tübüler hücre serbest bırakmak için küçük tübül adet yerleşmek için yardımcı oldu. Gün 1 gün 3, sadece daha iyi bir cep ekinde aynı zamanda bir üçe hücre yoğunluğu ile 1 gün ile karşılaştırıldığında (Şekil 1A) gözlenmiştir son derece gelişmiş hücre büyüme hızı değişiklikleri bekleniyordu. İlk büyüme aşamasında, hücreler sömürgeler kurdu ve koloniler doldurulur. Bu noktadan ileri, izole hücreler tamamen ele geçirildi ve sağlıklı bir yayılma görüntülenir. Gün 5, hücreleri hücre-hücre ve koloni-koloni arasında bir boşluk ile 60 mm Petri kabına bir % 80-90 confluency (Şekil 1A) vardı.
Alt kültür ve izole tübüler hücreler karakterizasyonu: İzole renal tübüler epitel hücreleri bölümünde 4 iletişim kuralı yukarıda açıklanan adımları sıraladı karakterizasyonu takip için alt kültürlü.
5 günden hücreler tam izolasyon kurtarıldı ve şiddetle çoğalırlar başladı. Bir hafta sonra soyutlanmak, hücreleri confluency 60 mm Petri kabına içinde büyüdü. Bir kültür geçit 0, 1 hafta sonra hücreleri 1 ve 2 daha fazla geçişleri için geçiş için alt kültürlü olmaya hazır. Benzer büyüme modeller Bölüm 1 ve Bölüm 2 tespit edildi. Genellikle, hücreleri 1 ve 2 confluency daha fazla alt kültürler (Şekil 1B) için büyümeye geçiş, daha az bir hafta sürer. Nerede onlar sıvı benzer atılır konfluent hücrelere geçiş 0 izole hücreler sağlıklı bir muhafaza düşündüren bir geniş kubbe oluşumu23,24 (Şekil 1B), gösterdi geçit 2 durumu sürekli kültür vivo durumuna. Bu hücrelere tabağını kaldırın ama sıkı kavşak bağlı kalmak monolayer neden oldu.
Kültür hücreleri ayırdetmek için immünfloresan geçiş 4 aracılığıyla geçiş 1 kültürlü hücrelerden, hem de bir kontrol hücre satırı-insan proksimal renal epitel HK-2 hücreleri boyama yapılır. Proksimal tübüler işaretleri, aquaporin 1 (AQP1)25 ve angiotensinogen (AGT)9, distal borulu işaret E-cadherin25, epitel marker düz kas aktin (SMA)26,27,28, makrofaj işaretleri F4/8029 ve CD6830ve mesangial işaret thymocyte farklılaşma antijen 1 (Thy1/CD90)9 karakterizasyon çalışmaları için kullanılmıştır. Her iki proksimal tübüler proteinler AQP1 ve AGT sürekli olarak yüksek geçiş 1 için geçiş 4 de olduğu gibi pozitif kontrol HK-2 proksimal epitel hücreleri (Şekil 2A) izole tübüler hücrelerde ifade edildi. Distal borulu protein E-cadherin geçiş 4 ile izole tübüler hücrelerde ifade edildi ve aynı zamanda HK-2 hücreleri (Şekil 2A) gözlenmiştir. SMA bol izole tübüler hücreler ve kontrol HK-2 hücreleri, yayımlanmış raporları26,27ile tutarlı ifade edildi. Öte yandan, mesangial protein Thy1 ve makrofaj protein F4/80 yoktun izole tübüler hücreler ve kontrol HK-2 hücreleri (Şekil 2A). CD68 en az bir ifade HK-2 hücreleri gösterdi ve geçiş 1 ve Bölüm 2, sonra onun ifade izole tübüler hücrelerde geçiş 3 4 (Şekil 2A) sıkışarak tespit edilemez oldu. Sonuçları bu protokol sonrası izole hücreler proksimal ve distal tübüler hücreler bir karışımı olduğunu göstermektedir. Bu marker proteinler vivo içindeifadeler karşılaştırmak için içinde donmuş böbrek doku boyama yapılır. Borulu işaretleri, AQP1, AGT ve E-cadherin ve mesangial protein Thy1 de dahil olmak üzere bulunmuştur son derece vahşi tipi sağlıklı fare (Şekil 2B)--dan hasat böbrekler ifade. F4/80 ve CD68 düşük ifadeler vahşi tipi böbrekler içinde gözlenen ama yoğun bir makrofaj infiltrasyonu20,31 ( ile böbrek yetmezliği geliştirilen bir Col4a3- / - fare--dan hasat böbrekler ifade Şekil 2C).
İzole birincil tübüler hücrelerde mitokondrial Bioenergetics tahlil: Mitokondrial solunum tahlil adımları yukarıda açıklanan protokol 5 bölümünde özetlenmiştir.
Mitokondrial solunum izole birincil tübüler hücre hücre dışı akı analizini farklı kaplama yoğunlukları oksijen tüketim hızı (OCR) ölçülür. Kaplama yoğunluğu titre için 20.000, 30.000 ve 40.000 birincil TECs iyi başına 96-şey XF96 Mikroplaka (yaklaşık 20 önce s) önceki gün numaralı seribaşı ekstraselüler akı tahlil (Şekil 3A). Hücre dışı akı analizi, OCR ölçümleri sonra Höchst boyama bir miktar tarafından hücre sayımları için normalleştirilmiş. 20.000 TECs kaplama, 30.000 veya 40.000 hücreleri/iyi içinde 25, 45 ve 50 pmol/dak, ortalama bir bazal OCR sırasıyla sonuçlandı (Şekil 3A). Ayrıca, kaplama hücrelerin mikroskobik görüntüleri 40.000 hücreleri/iyi diğer kaplama yoğunlukları (3B rakam) daha iyi Mikroplaka kuyu dibinde tüm yüzey kaplı ortaya koydu. Maksimal OCR 30.000 hücre yoğunluğuna göre 40.000 hücreleri kullanarak artmamıştır olsa bile, bir hücre yoğunluğu yaklaşık 40.000 hücreleri/iyi hücreler ve bileşikler arasındaki optimum etkileşimler için öneririz.
Bizim deneylerde, 1 µM oligomycin, 1 µM FCCP ve 2 µM Rotenon/antimycin-(hücre dışı akı tahlil ve bağlantı noktası enjeksiyonları protokollerin Tablo 1 listelenen A olduğu inhibitör/uncoupler bileşiklerin en iyi konsantrasyon Ayrıca, gösterilmiştir ; en iyi duruma getirme deneyler gösterilmez). Ancak, bu bileşiklerin, ideal olarak alt ve yayımlanmış değerleri daha yüksek çeşitli konsantrasyonları ile ön test çalıştırmak tüm kullanıcılar için en iyi sonuçları garanti için önerilir.
Bir hücre dışı akı tahlil böbrek TECs bioenergetics değerlendirmek için önemli parametreler verir. Yağ asidi oksidasyon TECs içinde özellikle arızalı olduğunu gösterildiği gibi örneğin, glikoliz (2 DG) inhibitörü ile birlikte yağ asidi substrat (palmiat) içeren medya kullanımı doğrudan yağ asidi oksidasyon TECs içinde değerlendirmek için yararlı bir araç olarak hizmet verebilir 1 ve 2 (Şekil 3 c) pasajlar. Böbrek fibrozis durumunda genel solunum kapasitesi hücrelerin glikoz tabanlı medya farklılık gösterebilir değil olsa bile sağlıklı böbreğini daha düşük olması bekleniyor.
Birlikte ele alındığında, özellikle yağ asidi oksidasyon kapasitesi değerlendirmek için hücre dışı akı tahlil hangi patolojik değişiklikleri bioenergetics profil oyun etkileyen böbrek TECs enerjik durumunu değerlendirmek için bilgilendirici bir tedbir olarak kullanılması gereken bir böbrek fibrozis ve böbrek yetmezliğine ilerleme büyük rol.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Adımları</td>
			<td>Süresi (dk)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kalibre</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Equilibrate:</td>
			<td>00:12:00</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ölçüm 1</td>
			<td>3 döngüler</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mix</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bekle</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ölçü birimi</td>
			<td>00:03:00</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mix</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bekle</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ölçü birimi</td>
			<td>00:03:00</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mix</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bekle</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ölçü birimi</td>
			<td>00:03:00</td>
		</tr>
<tr>
<td>Enjekte (1 mikron Oligomycin) bağlantı noktası</td>
			<td>2 döngüler</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mix</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bekle</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ölçü birimi</td>
			<td>00:03:00</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mix</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bekle</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ölçü birimi</td>
			<td>00:03:00</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bağlantı noktası B (1 mikron FCCP) enjekte</td>
			<td>2 döngüler</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mix</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bekle</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ölçü birimi</td>
			<td>00:03:00</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mix</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bekle</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ölçü birimi</td>
			<td>00:03:00</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bağlantı noktası C (2 mikron Rotenon/Antimycin) enjekte</td>
			<td>2 döngüler</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mix</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bekle</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ölçü birimi</td>
			<td>00:03:00</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mix</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bekle</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ölçü birimi</td>
			<td>00:03:00</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1. Hücre dışı akı Çözümleme Protokolü en iyi OCR ölçümleri için birincil tübüler hücrelerde çalıştıran standart.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57718/57718fig1.jpg"> Şekil 1. Hücre izole birincil tübüler hücre kültür. (A)izole birincil tübüler hücreler erken gün 1 eklemek ve sağlam 5 gün 3 gününden büyümek. Görüntüleri küçük 10 X ve 20 X hedefleri alınır. (B) Bu panel bir alt-kültür izole birincil tübüler hücre geçiş 0 passage 3 için gösterir. Görüntüleri küçük 10 X ve 20 X hedefleri için vizyonları hücre kubbeler ve pasajlar morfolojik değişimler vizyonu için 40 X amaç altında alınır. Scalebar = 100 µm. <a href="/files/ftp_upload/57718/57718fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57718/57718fig2.jpg"> Şekil 2. İzole birincil tübüler hücreler karakterizasyonu. (A)Immunostaining proksimal tübüler proteinleri (AQP1, AGT), distal borulu protein (E-cadherin), bir epitel protein (SMA), bir mesangial protein (Thy1) ve makrofaj proteinler (F4/80, CD68) karşı antikor ile gösteriyor ki izole İlköğretim tübüler hücreler ve sonraki alt kültürler saf proksimal ve distal tübüler hücreler vardır. (B) Bu panel bir proksimal tübül, distal tübül ve sağlıklı bir vahşi tipi fare dokulardan Böbrek mesangial proteinlerin bir pozitif ve bir Hayır birincil olumsuz denetimi boyama gösterir. (C) Bu panel bir Col4a3- / - fare pozitif kontrol olarak toplanan böbrek dokusunda makrofaj proteinlerin F4/80 ve CD68 boyama gösterir. Scalebar = 20 µm. DAPI mavi renkle gösterilir. Marker proteinler yeşille gösterilir. <a href="/files/ftp_upload/57718/57718fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57718/57718fig3.jpg"> Şekil 3. Farklı kaplama yoğunlukları, izole birincil tübüler hücrelerde hücre dışı akı tahlil. (A)artan yoğunluk kaplama hücresel passage 3 test birincil tübüler hücreler, bazal solunum düzeyleri artırır. (B) Bu panel mikroskobik görüntülerini birincil tübüler hücreler kültürlü bir XF96 Mikroplaka 20.000, 30.000 ve 40.000 hücreleri/iyi yoğunlukları seribaşı gösterir. Scalebar = 100 µm. (C) Bu panel gösterir bir yağ asidi veya glikoz göre ekstraselüler akı tahlil pasajlar 2 ve 1, birincil tübüler hücrelerde. Veridir ortalama ± SEM <a href="/files/ftp_upload/57718/57718fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Bu iletişim kuralı yalıtmak ve daha sonra böbrek biyolojik fonksiyonları ex vivomitokondriyal bioenergetics de dahil olmak üzere, değerlendirmek için alt kültürlü fare birincil renal tübüler hücreler karakterize için düşük maliyetli bir yaklaşım sağlar.

Yalıtım, karakterizasyonu ve yüksek işlem hacmi ekstraselüler akı analiz fare birincil Renal tübüler epitel hücresi

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Bu yöntem, renal fibroz ve diğer çeşitli nefropatilerin gelişimi ile yakından ilişkili olan yağ asidi oksidasyonu gibi böbrek metabolizması ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, renal tübüler epitel hücrelerinde mitokondriyal biyoenerjetik değerleri düzenleyen bileşikleri taramak için yüksek verimli bir platform kullanmaktır. Bu tekniğin etkileri, renal epitel hücrelerinde mitokondriyal metabolizmayı düzenleyen bileşiklerin yüksek kapsamlı taramasına izin verdiği için renal metabolik hastalığın tedavisine kadar uzanır.Kollajen kaplı 60 milimetrelik Petri kaplarını hazırlamak için, her bir kaba iki mililitre önceden filtrelenmiş 20 milimolar asetik asit ve ardından 35 mikrolitre kollajen I çözeltisi ekleyin. Ardından, plakayı oda sıcaklığında bir saat inkübe edin, havayla kurutun ve UV'ye maruz bırakın. Ardından, asetik asit kalıntılarını PBS kullanarak durulayın. Üç durulama yapın.Ardından, çanağı 37 santigrat derece karbondioksit içermeyen bir hücre kültürü inkübatöründe saklayın. Fareyi ameliyata hazırladıktan sonra, tüy dökücü bir krem kullanarak kürkü göğsünden ve karnından çıkarın. Ardından cildi iyotla dezenfekte edin ve iyot kalıntısını silin.Ardından, karın boşluğunu açmak için bir kesi yapın ve kalbi ve böbrekleri açığa çıkarın. Şimdi, dakikada 32 mililitrede bir perfüzyon pompası kurun ve perfüzyona başlamadan önce borudaki kabarcıkları temizleyin. Çizginin sonunda 27 gauge bir iğne kullanın.Devam etmek için, kalp tepesinden sol ventriküle bir iğne sokun. Tampon kalbi doldurur doldurmaz, perfüzyon tamponu için bir çıkış oluşturmak için sağ atriyumda bir delik açın. Ardından, sindirim tamponuna geçin ve sindirim için pompa hızını dakikada 30 mililitreye hafifçe düşürün.20 mililitre sindirim tamponu perfüze edildikten sonra, boru şeklindeki hücre izolasyonu için her iki böbreği de çıkarın. Hasat edilen böbrekleri işlemek için önce böbrek kapsüllerini ve medullayı çıkarın. Daha sonra, her iki böbreği de küçük parçalar halinde doğrayın ve 10 mililitrelik bir sindirim tamponunda 37 derecelik bir fırında beş dakika boyunca hafifçe döndürerek inkübe edin.Sindirimden sonra, tamponu 70 mikronluk bir filtreden geçirerek sindirilmemiş dokuları çıkarın. Sindirilmiş dokuyu topladıktan sonra, sindirimi durdurmak için 10 mililitre kültür ortamı ekleyin. Daha sonra, tübüler hücreleri peletlemek için filtrelenmiş doku süspansiyonunu beş dakika boyunca 50 g'da santrifüjleyin.Daha sonra, süpernatanı yeni bir tüpe aktarın, beş mililitre kültür ortamı ekleyin ve kalan tübüler hücreleri toplamak için santrifüjlemeyi tekrarlayın. Şimdi, ilk peleti 20 mililitre kültür ortamında yeniden süspanse edin ve toplanan hücreleri daha da saflaştırmak için beş dakika boyunca 50 g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın.Ardından, her iki peleti de 10 mililitre kültür ortamında yeniden süspanse edin. Ardından, tripan mavisi boyamayı kullanarak canlı hücreleri sayın. Daha sonra, 60 milimetrelik kollajen kaplı bir tabağa 10 milyona kadar hücre tohumlayın ve boru şeklindeki hücrelerin gece boyunca bağlanmasına izin verin.Başlamak için, P1 boru şeklindeki hücreleri 40.000 hücrede, kollajen ile kaplanmış taze hazırlanmış 96 oyuklu bir mikroplakanın kuyucuklarına tohumlayın. Kuyu başına 100 mikrolitre kültür ortamı kullanın. Hücre dışı akı tahlilinde hücre yoğunluğunun ve bileşik konsantrasyonunun optimizasyonu, başarılı bir deneyin anahtarıdır.Optimum hücre yoğunluğunu ve bileşik konsantrasyonunu belirlemek için bir pilot titrasyon deneyi öneriyoruz. Ardından, sensör kartuşunu nemlendirin. İlk olarak, sensör kartuşunu kaldırın ve plakanın her bir kuyusunu 200 mikrolitre kalibrasyon çözeltisiyle doldurun.Ardından, sensörleri daldırmak için kartuşu yeniden konumlandırın ve düzeneği gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, eski ortamı aspire edin ve 175 mikrolitre glikoz veya yağ asidi tahlil ortamı ile değiştirin. Ardından, karbondioksit olmadan bir saat boyunca inkübasyona devam edin.Hücre inkübasyonu sırasında, kartuşun A portunu 25 mikrolitre oligomisin ile doldurun, port B'yi FCCP ile yükleyin, port C'yi rotenon / antimisin A ile yükleyin ve port D'yi ve diğer tüm portları su ile yükleyin. Şimdi, kurulum kalibrasyon için hazır olana kadar kartuşu karbondioksit içermeyen inkübatörde saklayın. Hücre dışı akı analizörünü ve kontrolörü açarak devam edin.Ardından, Analizör Yazılımını açın, standart bir tahlil seçin ve Test Sihirbazı seçeneğine basın. Ardından, Bileşikler sekmesi altında, bileşikleri uygun bağlantı noktalarına atayın. Arka Plan Düzeltme sekmesi altında, hücre içermeyen kutuları seçin.Ardından, deneysel grupları etiketlemek için Gruplar ve Etiketler sekmesini kullanın. Ardından, Protokol sekmesi altında, mevcut komutları kullanarak uygun karışım ve ölçüm döngülerini ayarlayın. Bu ayarlar metin protokolünde belirtilmiştir ve bir kez girildikten sonra şablonu ileride kullanmak üzere kaydedin.Şimdi, devam etmek için Sihirbazı Sonlandır'a basın. Şimdi, kalibrasyonu başlatmak için Başlat'a basın. Analizör daha sonra plaka tutucuyu çıkarır ve kartuş plakasının yerleştirilmesini ister.Bu kalibrasyon işleminin tamamlanması 20 ila 25 dakika sürer. Sistem kalibre edildikten sonra, kalibrasyon plakasını hücre plakasıyla değiştirmek için komut istemine basın ve çalışmaya devam edin. Çalışma tamamlandığında, OCR verilerini kaydedin ve plakayı analizörden çıkarın.Şimdi, tahlil kuyucuklarının her birine Hoechst ekleyin ve plakayı 37 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. Ardından, 355 nanometre uyarma ve 460 nanometre emisyon kullanarak hücreleri sayın ve OCR verilerini hücre sayımına göre normalleştirin. Bu protokolde, heterojen bir böbrek hücresi popülasyonu, tam olarak sindirilmemiş tübüller ve diğer doku artıkları kollajen kaplı plakalar üzerinde kültürlendi.İzolasyondan bir gün sonra, kültür ortamı kalıntıları gidermek için santrifüjlendi ve tübüler hücreler yeniden kaplandı. Daha sonra, hücreler daha kolay bağlandı ve kültürdeki beşinci günde% 80 ila 90 oranında birleştiler. Renal TEC'ler daha sonra alt kültüre alındı ve bir hafta içinde birleşecek şekilde büyüdü.Sonraki iki geçişte de benzer bir büyüme meydana geldi. Hücrelerin tek tabakası bir kubbe oluşumu aldı, plakayı kaldırdı ve sıkı bağlantılarla bağlı kaldı. İzole edilmiş primer TEC'lerin mitokondriyal solunumu, tarif edildiği gibi farklı kaplama yoğunluklarında OCR'nin tarif edilen hücre dışı akı analizi kullanılarak ölçüldü.Daha büyük yoğunluklarda kaplanan hücrelerin OCR'sinde orantılı artışlar vardı. Kuyu başına 40.000 hücre, plakanın yüzeyini diğer kaplama yoğunluklarından daha iyi kapladı, böylece hücreler ve bileşikler arasındaki etkileşimleri test etmek için en uygun konsantrasyon haline geldi. Örneğin, yağ asidi substratı içeren ortam, bir ve ikinci pasajlarda TEC'lerdeki yağ asidi oksidasyonunu doğrudan değerlendirmek için bir glikoliz inhibitörü olan 2DG ile birlikte TEC'lere uygulandı.Bu prosedürü denerken, her bir kuyucuktaki kesin hacimlerin ve konsantrasyonların her zaman kaydını tutmak önemlidir. Bileşenlerin nihai konsantrasyonlarındaki değişiklikler tüm deneyin başarısız olmasına neden olabilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, nefroloji alanındaki araştırmacıların, çeşitli nefropatilerin patogenezinde tübüler yağ asidi metabolizmasının rolünü keşfetmelerinin yolunu açacaktır.

isolation-characterization-high-throughput-extracellular-flux

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu yazıda, gelişmekte olan böbrek kök / progenitör hücreleri düzenleyen sinyalizasyon yolaklar çalışma için kullanılabilir embriyonik fare böbrek progenitör hücre niş izolasyonu ve kültürü için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu kültür hücreleri küçük molekül ve rekombinant protein tedavisi için son derece erişilebilir ve önemlisi de aday yollarının etkin bir şekilde müdahale etmenizi sağlar viral iletimi,.

Embriyonik Fare Böbrek Nefrojenik Zone Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Solunum ve oksidatif fosforilasyon ile ve hücre canlılığı üzerindeki ilişkili mitokondriyal fonksiyonları üzerinde, protein kinaz C (PKC), izozimlerinin aktivasyon etkisi tarif edilmektedir. Yaklaşım seçici olarak mitokondriyal işlev ve hücre enerji durumunu belirlemek için birincil hücre kültürü deneyleri ve çeşitli PKC izozimleri overexpress için adenoviral teknik uyum sağlar.

Böbrek Hücreleri aşırı eksprese eden protein kinaz C izozimlerinin Mitokondriyal Fonksiyonlar ve Hücre Canlılık Değerlendirilmesi

Bu videoda, çok çeşitli moleküler biyoloji ve hücre kültürü çalışmaları için renal tübüler epitel hücrelerini izole etme ve saflaştırma adımlarını gösteriyoruz.

Murin Renal Hücre İzolasyonu: Renal Tübüler Epitel Hücrelerinin Primer Kültürünü İzole Etmek ve Oluşturmak İçin Bir Teknik

Yabani tip ve mutant farelerden alınan bireysel kardiyomiyositler, kasılmalarını ve kalsiyum geçişlerini incelemek için kalpten izole edilebilir. Bu, hücresel disfonksiyonun herhangi bir nedenden dolayı kalp disfonksiyonuna katkısının karakterizasyonuna izin verir.

Fare kardiyomiyositlerde İzolasyon ve Fizyolojik Analizi

Renal tübüler epitel ifade iyon kanalları polikistik böbrek hastalığı patolojisinde önemli bir rol oynamaktadır. Burada taze kemirgen böbrekler izole kistik epitel patch-kelepçe analizi ve hücre içi kalsiyum seviyesi ölçümleri gerçekleştirmek için kullanılan deneysel protokolleri açıklayın.

Patch Kelepçe ve Canlı Floresan Mikroskobu uygulanması Taze İzole PKD Epitelinin Fonksiyonel Properties Monitör

Bu protokol, Sprague Dawley sıçan böbreklerinin, deterjanların vaskülatür yoluyla antegrad perfüzyonu yoluyla hücreden arındırılmasını tanımlar ve insan böbrek epitel hücreleri ile yeniden popülasyon için şablon görevi gören aselüler renal hücre dışı matrisler üretir. Büyümeyi izlemek için resazurin perfüzyon testinin yeniden hücreselleştirilmesi ve kullanımı, özel olarak tasarlanmış perfüzyon biyoreaktörleri içinde gerçekleştirilir.

Epitel Hücre Repopulation ve Böbrek Doku Kalkınma Kemirgen Ekstrasellüler Matriks iskelelerinin hazırlanması

Viral enfeksiyonutaki böbrek, nispeten çok sayıda CD8+ T hücrebarındırır ve mukozal olmayan TRM hücrelerini inceleme fırsatı sunar. Burada, akış sitometri analizi için fare böbrek lenfositleri izole etmek için bir protokol açıklar.

Akış Sitometri Analizi için Fare Böbrek-Resident CD8+ T hücrelerinin izolasyonu

Burada, mikrofizyolojik bir sistemde kollajen ve kollajen-agaroz matrisleri kullanarak 3D hücre kültürlerinin uygulanması için talimatları detaylandıran protokoller sunuyoruz. Bu protokoller, renal proksimal tübül ve renal hücreli karsinom sferoidlerinin ko-kültürünü destekleyerek in vivo koşulları simüle eder ve böbrek kanseri hücre etkileşimlerinin ileri düzeyde araştırılmasını sağlar.

Böbrek Kanseri İlerlemesini Modellemek için Renal Sağlıklı ve Tümör Epitelinin Mikroakışkan Ko-kültürü

Burada, hücre dışı bir matris (3D-HRTEC) üzerinde tek tabakalar ve üç boyutlu kültürler geliştirmek için böbrek korteksinden insan renal tübüler epitel hücrelerinin (HRTEC) birincil kültürlerini elde etmek için protokolleri açıklıyoruz.

İnsan Renal Tübüler Epitel Hücre Primer Kültürlerinin Tek Tabakalı ve Üç Boyutlu Koşullarda Geliştirilmesi

Primer renal proksimal tübül epitel hücrelerini izole etmek ve kültürlemek için tüm insan böbreklerinin işlenmesi ve bu hücrelerin renal proksimal tübülü özetlemek için üç boyutlu, mikroakışkan, mikrofizyolojik bir platformda uygulanması için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz.

Primer İnsan Proksimal Tübül Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Renal Proksimal Tübülün Mikrofizyolojik Modelinin Oluşturulmasında Kullanımı

Burada, yüksek metabolik proksimal tübüler epitel hücrelerinde hipoksi/reoksijenasyon hasarını modellemek için in vitro bir protokolü tanımlıyoruz. Bu model, proksimal tübul hasar belirteçlerinin ekspresyonu ve mitokondriyal solunum fonksiyonunun değerlendirilmesi yoluyla ölçülebilen metabolik stres kaynaklı hasarı indüklemek için tasarlanmıştır.

Proksimal tübüler epitel hücrelerinde hipoksi/reoksijenlenme yaralanmasının modellenmesi

Öğrenin fare primer renal tübüler epitel hücrelerinin yalıtımı ve karakterizasyonu için yüksek işlem hacmi ekstraselüler akı analizi yöntemini. Bu teknik mitokondriyal biyoenerjik ve renal metabolizma çalışmalarında kullanılır.

Yalıtım, karakterizasyonu ve yüksek işlem hacmi ekstraselüler akı analiz fare birincil Renal tübüler epitel hücresi

Daha fazla video keşfet