Yalıtım, karakterizasyonu ve yüksek işlem hacmi ekstraselüler akı analiz fare birincil Renal tübüler epitel hücresi

Bu yöntem, renal fibroz ve diğer çeşitli nefropatilerin gelişimi ile yakından ilişkili olan yağ asidi oksidasyonu gibi böbrek metabolizması ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, renal tübüler epitel hücrelerinde mitokondriyal biyoenerjetik değerleri düzenleyen bileşikleri taramak için yüksek verimli bir platform kullanmaktır. Bu tekniğin etkileri, renal epitel hücrelerinde mitokondriyal metabolizmayı düzenleyen bileşiklerin yüksek kapsamlı taramasına izin verdiği için renal metabolik hastalığın tedavisine kadar uzanır.

Kollajen kaplı 60 milimetrelik Petri kaplarını hazırlamak için, her bir kaba iki mililitre önceden filtrelenmiş 20 milimolar asetik asit ve ardından 35 mikrolitre kollajen I çözeltisi ekleyin. Ardından, plakayı oda sıcaklığında bir saat inkübe edin, havayla kurutun ve UV'ye maruz bırakın. Ardından, asetik asit kalıntılarını PBS kullanarak durulayın. Üç durulama yapın.

Ardından, çanağı 37 santigrat derece karbondioksit içermeyen bir hücre kültürü inkübatöründe saklayın. Fareyi ameliyata hazırladıktan sonra, tüy dökücü bir krem kullanarak kürkü göğsünden ve karnından çıkarın. Ardından cildi iyotla dezenfekte edin ve iyot kalıntısını silin.

Ardından, karın boşluğunu açmak için bir kesi yapın ve kalbi ve böbrekleri açığa çıkarın. Şimdi, dakikada 32 mililitrede bir perfüzyon pompası kurun ve perfüzyona başlamadan önce borudaki kabarcıkları temizleyin. Çizginin sonunda 27 gauge bir iğne kullanın.

Devam etmek için, kalp tepesinden sol ventriküle bir iğne sokun. Tampon kalbi doldurur doldurmaz, perfüzyon tamponu için bir çıkış oluşturmak için sağ atriyumda bir delik açın. Ardından, sindirim tamponuna geçin ve sindirim için pompa hızını dakikada 30 mililitreye hafifçe düşürün.

20 mililitre sindirim tamponu perfüze edildikten sonra, boru şeklindeki hücre izolasyonu için her iki böbreği de çıkarın. Hasat edilen böbrekleri işlemek için önce böbrek kapsüllerini ve medullayı çıkarın. Daha sonra, her iki böbreği de küçük parçalar halinde doğrayın ve 10 mililitrelik bir sindirim tamponunda 37 derecelik bir fırında beş dakika boyunca hafifçe döndürerek inkübe edin.

Sindirimden sonra, tamponu 70 mikronluk bir filtreden geçirerek sindirilmemiş dokuları çıkarın. Sindirilmiş dokuyu topladıktan sonra, sindirimi durdurmak için 10 mililitre kültür ortamı ekleyin. Daha sonra, tübüler hücreleri peletlemek için filtrelenmiş doku süspansiyonunu beş dakika boyunca 50 g'da santrifüjleyin.

Daha sonra, süpernatanı yeni bir tüpe aktarın, beş mililitre kültür ortamı ekleyin ve kalan tübüler hücreleri toplamak için santrifüjlemeyi tekrarlayın. Şimdi, ilk peleti 20 mililitre kültür ortamında yeniden süspanse edin ve toplanan hücreleri daha da saflaştırmak için beş dakika boyunca 50 g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın.

Ardından, her iki peleti de 10 mililitre kültür ortamında yeniden süspanse edin. Ardından, tripan mavisi boyamayı kullanarak canlı hücreleri sayın. Daha sonra, 60 milimetrelik kollajen kaplı bir tabağa 10 milyona kadar hücre tohumlayın ve boru şeklindeki hücrelerin gece boyunca bağlanmasına izin verin.

Başlamak için, P1 boru şeklindeki hücreleri 40.000 hücrede, kollajen ile kaplanmış taze hazırlanmış 96 oyuklu bir mikroplakanın kuyucuklarına tohumlayın. Kuyu başına 100 mikrolitre kültür ortamı kullanın. Hücre dışı akı tahlilinde hücre yoğunluğunun ve bileşik konsantrasyonunun optimizasyonu, başarılı bir deneyin anahtarıdır.

Optimum hücre yoğunluğunu ve bileşik konsantrasyonunu belirlemek için bir pilot titrasyon deneyi öneriyoruz. Ardından, sensör kartuşunu nemlendirin. İlk olarak, sensör kartuşunu kaldırın ve plakanın her bir kuyusunu 200 mikrolitre kalibrasyon çözeltisiyle doldurun.

Ardından, sensörleri daldırmak için kartuşu yeniden konumlandırın ve düzeneği gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, eski ortamı aspire edin ve 175 mikrolitre glikoz veya yağ asidi tahlil ortamı ile değiştirin. Ardından, karbondioksit olmadan bir saat boyunca inkübasyona devam edin.

Hücre inkübasyonu sırasında, kartuşun A portunu 25 mikrolitre oligomisin ile doldurun, port B'yi FCCP ile yükleyin, port C'yi rotenon / antimisin A ile yükleyin ve port D'yi ve diğer tüm portları su ile yükleyin. Şimdi, kurulum kalibrasyon için hazır olana kadar kartuşu karbondioksit içermeyen inkübatörde saklayın. Hücre dışı akı analizörünü ve kontrolörü açarak devam edin.

Ardından, Analizör Yazılımını açın, standart bir tahlil seçin ve Test Sihirbazı seçeneğine basın. Ardından, Bileşikler sekmesi altında, bileşikleri uygun bağlantı noktalarına atayın. Arka Plan Düzeltme sekmesi altında, hücre içermeyen kutuları seçin.

Ardından, deneysel grupları etiketlemek için Gruplar ve Etiketler sekmesini kullanın. Ardından, Protokol sekmesi altında, mevcut komutları kullanarak uygun karışım ve ölçüm döngülerini ayarlayın. Bu ayarlar metin protokolünde belirtilmiştir ve bir kez girildikten sonra şablonu ileride kullanmak üzere kaydedin.

Şimdi, devam etmek için Sihirbazı Sonlandır'a basın. Şimdi, kalibrasyonu başlatmak için Başlat'a basın. Analizör daha sonra plaka tutucuyu çıkarır ve kartuş plakasının yerleştirilmesini ister.

Bu kalibrasyon işleminin tamamlanması 20 ila 25 dakika sürer. Sistem kalibre edildikten sonra, kalibrasyon plakasını hücre plakasıyla değiştirmek için komut istemine basın ve çalışmaya devam edin. Çalışma tamamlandığında, OCR verilerini kaydedin ve plakayı analizörden çıkarın.

Şimdi, tahlil kuyucuklarının her birine Hoechst ekleyin ve plakayı 37 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. Ardından, 355 nanometre uyarma ve 460 nanometre emisyon kullanarak hücreleri sayın ve OCR verilerini hücre sayımına göre normalleştirin. Bu protokolde, heterojen bir böbrek hücresi popülasyonu, tam olarak sindirilmemiş tübüller ve diğer doku artıkları kollajen kaplı plakalar üzerinde kültürlendi.

İzolasyondan bir gün sonra, kültür ortamı kalıntıları gidermek için santrifüjlendi ve tübüler hücreler yeniden kaplandı. Daha sonra, hücreler daha kolay bağlandı ve kültürdeki beşinci günde% 80 ila 90 oranında birleştiler. Renal TEC'ler daha sonra alt kültüre alındı ve bir hafta içinde birleşecek şekilde büyüdü.

Sonraki iki geçişte de benzer bir büyüme meydana geldi. Hücrelerin tek tabakası bir kubbe oluşumu aldı, plakayı kaldırdı ve sıkı bağlantılarla bağlı kaldı. İzole edilmiş primer TEC'lerin mitokondriyal solunumu, tarif edildiği gibi farklı kaplama yoğunluklarında OCR'nin tarif edilen hücre dışı akı analizi kullanılarak ölçüldü.

Daha büyük yoğunluklarda kaplanan hücrelerin OCR'sinde orantılı artışlar vardı. Kuyu başına 40.000 hücre, plakanın yüzeyini diğer kaplama yoğunluklarından daha iyi kapladı, böylece hücreler ve bileşikler arasındaki etkileşimleri test etmek için en uygun konsantrasyon haline geldi. Örneğin, yağ asidi substratı içeren ortam, bir ve ikinci pasajlarda TEC'lerdeki yağ asidi oksidasyonunu doğrudan değerlendirmek için bir glikoliz inhibitörü olan 2DG ile birlikte TEC'lere uygulandı.

Bu prosedürü denerken, her bir kuyucuktaki kesin hacimlerin ve konsantrasyonların her zaman kaydını tutmak önemlidir. Bileşenlerin nihai konsantrasyonlarındaki değişiklikler tüm deneyin başarısız olmasına neden olabilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, nefroloji alanındaki araştırmacıların, çeşitli nefropatilerin patogenezinde tübüler yağ asidi metabolizmasının rolünü keşfetmelerinin yolunu açacaktır.