Name: Erken Postnatal fare beyin içine Interneuron öncüleri Homochronic nakli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Öğrenin, erken postnatal fare beyninden internöron öncülerinin homokronik nakli yöntemini. Bu teknik, gelişimsel nörobilimde hücre kaderini ve olgunlaşmayı incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma Ulusal Sağlık Enstitüleri (K99MH104595) ve T.J.P. NICHD intramural araştırma programı tarafından desteklenen Gord Fishell, kimin Laboratuarı'nda bu yaklaşım başlangıçta kurulmuş teşekkür ediyoruz.

<ol><li>Bozzi, Y., Casarosa, S., Caleo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epilepsy+as+a+neurodevelopmental+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Epilepsy as a neurodevelopmental disorder.</a> Front Psychiatry. 3 (19), (2012).</li>
<li>Takano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuron+Dysfunction+in+Syndromic+Autism%3A+Recent+Advances%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Interneuron Dysfunction in Syndromic Autism: Recent Advances.</a> Dev Neurosci. , (2015).</li>
<li>Inan, M., Petros, T. J., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Losing+your+inhibition%3A+linking+cortical+GABAergic+interneurons+to+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Losing your inhibition: linking cortical GABAergic interneurons to schizophrenia.</a> Neurobiol Dis. 53, 36-48 (2013).</li>
<li>Batista-Brito, R., Machold, R., Klein, C., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+in+cortical+interneuron+precursors+is+prescient+of+their+mature+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Gene expression in cortical interneuron precursors is prescient of their mature function.</a> Cereb Cortex. 18 (10), 2306-2317 (2008).</li>
<li>Flames, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delineation+of+multiple+subpallial+progenitor+domains+by+the+combinatorial+expression+of+transcriptional+codes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Delineation of multiple subpallial progenitor domains by the combinatorial expression of transcriptional codes.</a> J Neurosci. 27 (36), 9682-9695 (2007).</li>
<li>Wonders, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spatial+bias+for+the+origins+of+interneuron+subgroups+within+the+medial+ganglionic+eminence%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A spatial bias for the origins of interneuron subgroups within the medial ganglionic eminence.</a> Dev Biol. 314 (1), 127-136 (2008).</li>
<li>Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+bias+in+the+mitotic+origins+of+somatostatin-+and+parvalbumin-expressing+interneuron+subgroups+and+the+chandelier+subtype+in+the+medial+ganglionic+eminence%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal bias in the mitotic origins of somatostatin- and parvalbumin-expressing interneuron subgroups and the chandelier subtype in the medial ganglionic eminence.</a> Cereb Cortex. 22 (4), 820-827 (2012).</li>
<li>Petros, T. J., Bultje, R. S., Ross, M. E., Fishell, G., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+versus+Basal+Neurogenesis+Directs+Cortical+Interneuron+Subclass+Fate%5BTitle%5D)+AND+%22+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Apical versus Basal Neurogenesis Directs Cortical Interneuron Subclass Fate.</a> Cell Rep. 13 (6), 1090-1095 (2015).</li>
<li>Taniguchi, H., Lu, J., Huang, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spatial+and+temporal+origin+of+chandelier+cells+in+mouse+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The spatial and temporal origin of chandelier cells in mouse neocortex.</a> Science. 339 (6115), 70-74 (2013).</li>
<li>Bandler, R. C., Mayer, C., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+interneuron+specification%3A+the+juncture+of+genes%2C+time+and+geometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cortical interneuron specification: the juncture of genes, time and geometry.</a> Curr Opin Neurobiol. 42, 17-24 (2017).</li>
<li>Kepecs, A., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuron+cell+types+are+fit+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interneuron cell types are fit to function.</a> Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).</li>
<li>Mayer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+diversification+of+cortical+inhibitory+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons.</a> Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).</li>
<li>Mi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+emergence+of+cortical+interneuron+diversity+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Early emergence of cortical interneuron diversity in the mouse embryo.</a> Science. 360 (6384), 81-85 (2018).</li>
<li>Alvarez-Dolado, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+inhibition+modified+by+embryonic+neural+precursors+grafted+into+the+postnatal+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain.</a> J Neurosci. 26 (28), 7380-7389 (2006).</li>
<li>Baraban, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+seizures+by+transplantation+of+cortical+GABAergic+interneuron+precursors+into+Kv1.1+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reduction of seizures by transplantation of cortical GABAergic interneuron precursors into Kv1.1 mutant mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (36), 15472-15477 (2009).</li>
<li>De la Cruz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuron+progenitors+attenuate+the+power+of+acute+focal+ictal+discharges%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Interneuron progenitors attenuate the power of acute focal ictal discharges.</a> Neurotherapeutics. 8 (4), 763-773 (2011).</li>
<li>Gilani, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuron+precursor+transplants+in+adult+hippocampus+reverse+psychosis-relevant+features+in+a+mouse+model+of+hippocampal+disinhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interneuron precursor transplants in adult hippocampus reverse psychosis-relevant features in a mouse model of hippocampal disinhibition.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (20), 7450-7455 (2014).</li>
<li>Larimer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caudal+Ganglionic+Eminence+Precursor+Transplants+Disperse+and+Integrate+as+Lineage-Specific+Interneurons+but+Do+Not+Induce+Cortical+Plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Caudal Ganglionic Eminence Precursor Transplants Disperse and Integrate as Lineage-Specific Interneurons but Do Not Induce Cortical Plasticity.</a> Cell Rep. 16 (5), 1391-1404 (2016).</li>
<li>Martinez-Cerdeno, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+MGE+precursor+cells+grafted+into+adult+rat+striatum+integrate+and+ameliorate+motor+symptoms+in+6-OHDA-lesioned+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Embryonic MGE precursor cells grafted into adult rat striatum integrate and ameliorate motor symptoms in 6-OHDA-lesioned rats.</a> Cell Stem Cell. 6 (3), 238-250 (2010).</li>
<li>Quattrocolo, G., Fishell, G., Petros, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+Transplantations+Reveal+Environmental+Influences+on+Interneuron+Diversity+and+Maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Heterotopic Transplantations Reveal Environmental Influences on Interneuron Diversity and Maturation.</a> Cell Rep. 21 (3), 721-731 (2017).</li>
<li>Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+Nkx2.1-lineage+cells+in+the+mouse+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon.</a> J Comp Neurol. 506 (1), 16-29 (2008).</li>
<li>Thompson, L., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival%2C+differentiation%2C+and+connectivity+of+ventral+mesencephalic+dopamine+neurons+following+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Survival, differentiation, and connectivity of ventral mesencephalic dopamine neurons following transplantation.</a> Prog Brain Res. 200, 61-95 (2012).</li>
<li>Liang, Y., Agren, L., Lyczek, A., Walczak, P., Bulte, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+progenitor+cell+survival+in+mouse+brain+can+be+improved+by+co-transplantation+of+helper+cells+expressing+bFGF+under+doxycycline+control%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neural progenitor cell survival in mouse brain can be improved by co-transplantation of helper cells expressing bFGF under doxycycline control.</a> Exp Neurol. 247, 73-79 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Önemli bir özelliği, bu iletişim kuralı hücrelerin Beka maksimize. Doku ve hücreler her zaman buz gibi carboxygenated sACSF sağlama hücre survival tanıtmak gereklidir. Bu bir verimli diseksiyon ve çeşitli çözüm ve beyin ortamı dışında hücreleri harcamak süreyi en aza indirmek için ayrılma strateji gerektirir. Disseke ve nakledilen beyin bölgeleri sayısına bağlı olarak, diseksiyon ve/veya nakli adımda deneme uzunluğu azaltmak için yardımcı bir arkadaşın olduğu yararlı olabilir. Sağlık ve yavru hayatta kalmasını sağlamak i...

Düzgün kortikal uyarıcı projeksiyon nöronlar ve inhibitör GABAergic interneurons, farklı türleri morfoloji, elektrofizyolojik özellikleri, connectivity ile son derece heterojen bir nüfus arasında bir denge gerektirir ve nörokimyasal işaretleri. Anormal gelişimi ve interneurons (ve belirli interneuron alt gruplar) fonksiyonu bağlı psikiyatrik bozukluklar şizofreni, otizm ve epilepsi1,2,3gibi pathobiology. Ayrıca, birçok genler bu beyin bozukluklarında karıştığı güçlü genç interneurons4' te zenginleştirilmiş. Böylece, interneuron kader tayini ve olgunlaşma düzenleyen mekanizmalar daha büyük bir anlayış normal gelişim ve potansiyel etiologies çok sayıda beyin hastalıkları anlamak için gereklidir.
Ön interneurons öncelikle iki geçici embriyonik yapılardan, medial ve kaudal ganglionic efendiler tarihi (MGE ve CGE, sırasıyla). Bu postmitotic hücreler (interneuron öncüleri) nerede onlar çok çeşitli devreleri entegre telencephalon dağıtmak için uzun süren teğet geçiş aşaması geçmesi. MGE kaynaklı interneurons oluşur üç büyük ölçüde örtüşen, neurochemically tanımlı alt gruplar: hızlı parvalbumin (PV+) interneurons, hızlı-somatostatin (SST+) interneurons, spiking yükseliyor ve geç yükseldi nöronal nitrik hipokampal neurogliaform ve Ivy hücreleri teşkil oksit sentaz (nNOS+) interneurons. Çok sayıda labs düzenleyen ilk kader kararlar PV+ veya SST + interneurons, morfojenlerdeki, interneuron öncüleri, Doğum tarihi ve nörojenik bölümü modu kayma degradeleri de dahil olmak üzere çeşitli mekanizmalar içinde MGE belirledik 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. interneurons başlangıçta 'Kardinal sınıfa' ayırt etmek ve onların çevre11ile etkileşimde bulunan 'kesin sınıfa' aşamalı olarak olgun önerilmiştir. Son kanıtlar bu hücreler ganglionic efendiler, postmitotic olmak gibi bazı olgun interneuron alt türlerinden genetik olarak kablolu erken tanımlanmış içsel genetik programlar daha önce daha büyük bir rol oynayabilir gösteren olabileceğini gösterir takdir12,13. Ancak, içsel genetik programlar için sürücü farklılaşma ayrı interneuron alt türlerini içine çevre ipuçları ile etkileşimini anahtar soru büyük ölçüde keşfedilmemiş kalır.
Çok sayıda çalışma embriyonik MGE hücreleri doğrudan beyin bölgeleri, hücreler olgun aşılı ve genellikle yerel endojen devresi14,15inhibe GABA bırakın uzlaşma sonuçları ile çeşitli içine nakledilen, 16,17,18,19. İnsan indüklenmiş pluripotent kök hücre (hIPSC) kullanarak önemli ilgi oluşturulan bu gözlemler umut verici-beyin hastalıkları çeşitli tedavi interneurons türetilmiş. Ancak, bu aşılı hücreler olgun interneurons beklenen türlerini olgun olmadığını çok az bu çalışmaların değerlendirmek, ne zaman bir kritik bir bileşeni translasyonel yaklaşımlar hakkında düşünüyor.
Nasıl interneuron farklılaşma ve olgunlaşma çevre etkileri gidermek amacıyla bir strateji aşılı interneurons şekil-in belgili tanımlık ev sahibi kabul olup olmadığını incelemek için yeni beyin ortamlara olgunlaşmamış interneuron öncüleri nakli için geliştirildi çevre veya özelliklerini donör çevre20korumak. MGE nakli MGE nüfus interneuron ve çok sayıda beyin bölgeleri21dağıtmak GABAergic projeksiyon hücreler içerdiğinden bu soruyu çözmek uygun değildir. Nerede bu MGE hücreler göç var bilmeden, bir tam olarak nasıl bu nakillerine beyin ortamı tarafından etkilenen değerlendirmek değil. İnterneuron öncüleri erken postnatal timepoints, hasat tarafından bu sorunu kendi geçiş tamamlayan ve hedeflerine ulaştı olgunlaşmamış hücreleri elde ederek hile beyin bölgesi ama çevre en az etkileşim yok. Differentially farklı beyin bölgeleri arasında ifade edilir interneurons özellikleri üzerinde odaklanarak, kimse o zaman nasıl interneuron özellikleri ana ortamı değiştirir belirleyebilirsiniz. Bu protokol için özetlenen genel yaklaşım herhangi bir araştırmacı için uygulanabilir olmalıdır meydan yeni bir ortamda ne kadar genç nöronlar incelemek istiyor ne zaman davranırlar.

<table><tbody><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat</td><td>Sigma</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat monobazik</td><td>Sigma</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Beyin Matrisleri</td><td>Roboz</td><td>SA-2165</td><td>Sadece striatum hasadı yapılırsa gereklidir</td></tr><tr><td>İnce nokta Dumont Forseps</td><td>Roboz</td><td>RS-4978</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodiseksiyon makası</td><td>Roboz</td><td>RS-5940</td><td></td></tr><tr><td>Jiletli bıçaklar</td><td>ThermoFisher</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Pastör pipetleri</td><td>ThermoFisher</td><td>1367820C</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject III</td><td>Drummond</td><td>3-000-207</td><td></td></tr><tr><td>Manuel Manipülatör, standlı</td><td>World Precision Instruments&nbsp;</td><td>M3301R/M10</td><td></td></tr><tr><td>5 ml yuvarlak tabanlı plastik tüpler</td><td>ThermoFisher</td><td>149591A</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Petri kapları</td><td>ThermoFisher</td><td>12556001</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Petri kapları</td><td>ThermoFisher</td><td>12565100</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma</td><td>10165921001</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>16140063</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>Celltrics 50um filtreler</td><td>Sysmex</td><td>04-0042327</td><td></td></tr><tr><td>Tripan mavisi</td><td>ThermoFisher</td><td>15-250-061</td><td></td></tr><tr><td>Hemositometre</td><td>ThermoFisher</td><td>02-671-6</td><td></td></tr></tbody></table>

erken postnatal fare beyin içine interneuron öncüleri homochronic nakli

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Nöronal kader tayini ve olgunlaşma genetik programlarla çevre sinyalleri arasında karmaşık bir etkileşim gerektirir. Ancak, bu Farklılaşma süreci düzenleyen dışsal mekanizmaları vs içsel rolleri disentangling tüm gelişimsel neurobiologists için bir bilmece olduğunu. Bu sorun GABAergic interneurons, geçici embriyonik yapılardan tarihi ve telencephalon dağıtmak için uzun süren bir göçmen faz tabi bir inanılmaz türdeş olmayan hücre nüfus için büyütülür. Ne kadar farklı beyin ortamları etkiler interneuron kader ve olgunlaşma keşfetmek için geliştirdiğimiz fluorescently etiketli olgunlaşmamış interneuron öncüleri (P0-P2) yeni doğan farelerde belirli beyin bölgelerinden hasat için bir iletişim kuralı. Bu yaşta interneuron geçiş neredeyse tamamlanmış ve bu hücreler nispeten küçük sinaptik entegrasyonu ile son istirahat ortamlarında bulunan. Toplama tek hücre çözümler akış sitometresi ile bu interneuron öncüleri P0-P2 wildtype Doğum sonrası pups nakledilen. Her iki Homotopik yaparak (örneğin, korteks korteks) veya heterotopik (örneğin, korteks hipokampus) nakillerine, bir can değerlendirmek yeni beyin ortamlarda olgunlaşmamış interneurons zor onların kaderi, olgunlaşma ve devre entegrasyon nasıl etkiler. Beyin yetişkin fareler hasat ve posthoc analiz aşılı hücrelerde immunohistokimyasal, dahil olmak üzere, çok çeşitli ile denetlesinler elektrofizyolojik ve transkripsiyon profil oluşturma. Müfettişler nasıl ayrı beyin ortam tahlil için bir strateji ile çok sayıda nöron gelişim yönlerini etkilemeye ve belirli nöronal özellikleri öncelikle kablolu genetik programlar tarafından tahrik edilmektedir tanımlamak bu genel yaklaşım sağlar veya çevre ipuçları.

Bu iletişim kuralı erken postnatal beyin (Şekil 1-2) belirli beyin bölgelerine hasat, tek hücre dissociations interneuron öncüleri, toplamak ve saf WT çeşitli beyin bölgeleri içine bu hücrelerin nakli gösterilmiştir postnatal pups (Şekil 3). Posthoc analiz için interneuron habercisi Greftler alınan beyin P30-35 arasında hücre morfolojisi, nörokimyasal işaretleri ve elektrofizyolojik özellikleri tanımlamak için ha...

Yeni beyin bölgelerindeki genç nöronlar zorlu nasıl çevre nöronal kader ve olgunlaşma sculpts içine önemli anlayışlar ortaya çıkarabilir. Bu iletişim kuralı interneuron öncüleri belirli beyin bölgelerinden hasat ve onları her iki homotopically nakli için bir yordam açıklanır veya beyin ve postnatal yavrularını içine heterotopically.

Erken Postnatal fare beyin içine Interneuron öncüleri Homochronic nakli

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Bu prosedürün genel amacı, doğum sonrası fare yavrularında farklı beyin bölgelerinden internöron öncüllerini toplamak ve çevresel değişikliklerin internöron kaderini ve olgunlaşmasını nasıl etkilediğini değerlendirmek için bu hücreleri yaşa uygun alıcılara nakletmektir. Bu yöntem, gelişimsel sinirbilim alanında, içsel genetik programların ve çevresel sinyallerin nöral hücrelerin kaderini şekillendirmek için nasıl etkileşime girdiğine dair temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, internöron öncüllerinin kaderindeki ve olgunlaşmasındaki değişikliklerin, yeni bir beyin ortamına evlat edinildikten sonra analiz edilebilmesidir.Hücre toplama ve aşılama adımlarının görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü teknikteki küçük hatalar verimsiz ve başarısız nakil deneylerine yol açabilir. Başlamak için, doğum sonrası bir gün bir yavru beyninin ön ön lobuna bir tıraş bıçağı yerleştirin ve iki adet 0,5 milimetrelik dilim oluşturmak için ilk tıraş bıçağının hemen arkasındaki yuvalara ek tıraş bıçakları yerleştirin. Striatal dilimleri kabarcıklı sükroz, yapay beyin omurilik sıvısı veya sACSF içeren bir Petri kabına aktarın ve kalan beyin dokusunu buz üzerinde sACSF içeren bir Petri kabına yerleştirin.Dilimleri bir diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin ve striatumu her iki yarım küreden sıkıştırmak için forseps kullanın, striatal parçaları hasat edilirken buz üzerinde 50 mililitrelik bir sACSF tüpüne yerleştirin. Beyin bir floresan muhabir fareden alınmışsa, striatal td-domates sinyalini globus pallidusun daha güçlü floresan sinyalinden ayırt etmek için floresan mikroskobu kullanın. Hipokampusu çıkarmak için, beyni orta hat boyunca yarımkesmek için forseps kullanın ve bir yarım küreyi medial yüzeye diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin.Ventral beyin dokusunu çıkarmak için forseps kullanın ve korteksin dorsal ve ventriküler tarafı boyunca anteroposterior erişimi kapsayan sosis şeklindeki hipokampusu tanımlayın. Forsepsin uçlarını anterior hipokampusun önüne yerleştirin ve hipokampusu korteksten nazikçe ayırmak için hipokampal kortikal sınır boyunca sıkıştırırken forsepsleri arkaya doğru ilerletin. İzole edilen dokuyu buz üzerinde 50 mililitrelik bir sACSF tüpüne yerleştirin ve kontralateral hemisfer için hipokampus hasadını tekrarlayın.Daha sonra hemiseke korteksi medial tarafı aşağı gelecek şekilde yerleştirin ve korteksin en dorsal, ventral, ön ve arka kısımlarını çıkarmak için forsepsleri kullanın. Medial korteksin kalan karesini buz üzerinde 50 mililitrelik bir sACSF tüpüne aktarın. Beyni çıkardıktan sonra, beynin ventral tarafını beyincik ve ön korteks veya koku soğancıklarından geçirin.Kavisli forseps kullanarak, arka korteksi alttaki hipokampustan ve her yarım küredeki diğer dokulardan nazikçe ayırın. Ve altta yatan yapıları ortaya çıkarmak için dorsal korteksi öne doğru soyun. Hipokampusu orta hatta bir yarım kürede sıkıştırmak için forseps kullanın ve hipokampusu beyinden yanal olarak soyarak çıkarın.Hipokampusu buz üzerinde 50 mililitrelik bir sACSF tüpüne yerleştirin ve kontralateral hipokampusu aynı şekilde hasat edin. Daha sonra, çevreleyen dokudan gevşetmek için striatumun kenarlarını nazikçe kazıyın. Striatal dokuyu toplamak için striatumun altına hafifçe sıkıştırın.Korteksin her iki hemisferden toplanmasından sonra, daha önce gösterildiği gibi, striatumu bir floresan diseksiyon kapsamı altına aktarın. Her striatumdan herhangi bir parlak kırmızı td-domates pozitif globus pallidus dokusunu çıkarmak için forseps kullanın. Tüm dokular toplandığında, dokuyu beş milimetrelik yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın ve her toplama tüpündeki sACSF'yi, ara sıra fiske ile oda sıcaklığında 20 dakikalık bir inkübasyon için iki mililitre taze hazırlanmış pronase-sACSF çözeltisi ile değiştirin.İnkübasyonun sonunda, pronaz-sACSF'yi bir ila iki mililitre sulandırma solüsyonu ile dikkatlice değiştirin ve dokuları ateşle parlatılmış Pasteur boruları ile mekanik olarak ayırın. Doku bulanık olduğunda ve hiçbir doku parçası görünmediğinde, floresanla aktive edilen hücre sıralamasından önce hücre kümelerini çıkarmak için hücre çözeltisini 50 mikronluk bir filtreden yeni beş mililitrelik yuvarlak tabanlı tüplere süzün. Hücreleri akış sitometrisinden aldıktan sonra, hücre süspansiyonlarını santrifüjleme için 1.5 mililitrelik konik tüplere aktarın.Santrifüjlemeden sonra, her tüpten son 20 mikrolitre süpernatan hariç hepsini aspire edin ve sayım için peletleri yeniden oluşturun. Gerekirse, hücre çözeltisini sACSF ile mikrolitre konsantrasyon başına bir ila üç kez 10 ila 5. hücrelere seyreltin. İnce uçlu bir mikropipete mineral yağ yükleyin.Mikropipeti bir nanolitre enjektöre takın ve nanolitre enjeksiyon aparatını manyetik bir tabana bağlı bir manipülatöre sabitleyin. İlk yavru buz üzerinde uyuşturulurken, homojen bir hücre dağılımı sağlamak için hücre solüsyonunu birkaç kez pipetleyin. Mineral yağı çıkarın ve pipeti tek hücreli süspansiyonla tamamen doldurun.Ayak parmağını sıkıştırmaya yanıt verilmediğini onayladıktan sonra, yavruyu, başı yapışkan macun üzerinde duracak şekilde bir Petri kabı kapağına yerleştirin, böylece başın üst kısmı nispeten düz olur. Kafayı elmas delikli bir laboratuvar bandı parçasıyla örtün, öğretilen bandı cilt gerilene kadar çekin, böylece kafa sıkıca sabitlenir ve lambda delikten görünür. Güvenli yavruyu nanolitre enjektörün altına getirin ve mikropipeti, ucu doğrudan lambdanın üzerinde olacak şekilde indirin.Manipülatör üzerindeki X, Y koordinatlarını gözlemleyin ve mikropipet başın medial, lateral ve anteroposterior eksenleri boyunca uygun koordinatlara yerleştirilene kadar manipülatör düğmelerini ayarlayın. Uç cilt üzerinde küçük bir içbükeylik oluşturana kadar mikropipeti indirin ve mikropipeti ciltten ve kafatasından beyne sürmek için z ekseni manipülatör düğmesini sıkıca ama nazikçe çevirin. Mikropipeti, ucu çadır şeklinde bir deri konisi ile çevrelenene kadar hafifçe geri çekin.Ve z ekseni boyunca koordinatları görüntüleyin. Daha sonra mikropipeti uygun deney derinliğine indirin ve hücreleri enjekte edin. Mikropipeti geri çekmeden önce hücreler verildikten sonra 15 saniye bekleyin ve istenirse enjeksiyonu ikinci bir yerde tekrarlayın.Yavruyu bir ısıtma yastığının üzerine yerleştirin ve ev kafesine geri aktarmadan önce tam iyileşme sağlanana kadar izleyin. Aşılanmış hücreler, düzinelerce ila birkaç bin arasında değişen değişken hücre sağkalım oranları ile hedeflenen beyin bölgeleri boyunca göç eder. Aşılanmış hücreler, internöron morfolojileri ve iyi karakterize edilmiş internöron nörokimyasal belirteçler sergileyen birçok hücre ile uygun bölgeler içinde lokalize olur.Donör hücreler, heterotopik transplantasyonlarla yeni ortamlara aşılandıklarında bile hayatta kalır ve olgunlaşır. Aşılanmış hücrelerin elektrofizyolojik analizi, iyi tanımlanmış internöron alt tiplerini temsil eden yetişkin benzeri fizyolojik özellikleri ve farklı ateşleme modellerini ortaya çıkarır, bu da aşılanmış internöronların konakçı ortamda uygun şekilde olgunlaşabildiğini düşündürür. Nakledilen hücreler ayrıca spontan uyarıcı postsinaptik akımlar gösterir.Channelrhodopsin-2'yi eksprese eden nakledilen internöronlara bitişik piramidal hücrelerden yapılan kayıt, bu endojen piramidal hücrelerde mavi ışıkla uyandırılan postsinaptik GABAerjik akımları ortaya çıkarır. Bu prosedürü denerken, hücre ölümünü en aza indirmek için hücreleri buz üzerinde tutmak ve hücreleri bir Pasteur pipeti ile nazikçe ezmek önemlidir. Bu prosedürü takiben, çevresel değişikliklerin bir hücrenin transkriptomunu nasıl etkilediğini daha tam olarak tanımlamak için aşılanmış hücreler üzerinde tek hücre dizilimi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.Bu videoyu izledikten sonra, yenidoğan yavruların farklı beyin bölgelerinden internöron öncüllerini izole edebilmeli ve bu hücreleri yaşa uygun doğum sonrası yavruların çeşitli beyin bölgelerine nakledebilmelisiniz.

homochronic-transplantation-interneuron-precursors-into-early

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Kaynak: Weber, R. Z., et al. Fare Beynindeki İnsan Nöral Progenitör Hücrelerinin İntraserebral Transplantasyon ve İn Vivo Biyolüminesans İzlemesi. J. Vis. Uzm. (2022)Bu video, genetiği değiştirilmiş insan nöral progenitör hücrelerinin (NPC'ler) fare beynine stereotaksik transplantasyonunu göstermektedir. Araştırmacılar, lusiferaz ve floresan proteinleri eksprese eden NPC'leri enjekte ederek, in vivo biyolüminesans görüntüleme ve ölüm sonrası floresan mikroskobunun hücre sağkalımını, göçünü ve...

Fare beynindeki insan nöral progenitör hücrelerinin nakli

Bu video, fare embriyonik kök hücrelerinden kortikal internöron öncüleri oluşturmak için bir yöntem sunar. Protokol, kök hücrelerin, kök hücre çoğalmasını ve embriyoid cisimlere (EB'ler) agregasyonunu kolaylaştıran spesifik küçük molekül inhibitörleri içeren ortamlarda kültürlenmesini gerektirir. Daha sonra, EB'ler enzimlerle ayrıştırılır ve kortikal internöron öncülerine farklılaşmalarını teşvik etmek için adezyon proteinleri ile kaplanmış kültür plakası kuyucukları üzerine kaplanır.

Fare Embriyonik Kök Hücrelerinden Kortikal İnternöron Öncüllerinin Üretilmesi

Kaynak: Quattrocolo, G., et al. İnternöron Öncüllerinin Erken Doğum Sonrası Fare Beyinlerine Homokronik Transplantasyonu. J. Vis. Uzm. (2018)Bu video, internöron öncü hücrelerinin homotopik veya heterotopik bir yaklaşım kullanılarak yenidoğan fare beynine naklini göstermektedir. Prosedür, anestezi uygulanmış bir alıcı yavrunun güvence altına alınmasını, hedef beyin bölgesinin tanımlanmasını ve aynı gelişim aşamasında bir donör yavrudan türetilen öncü hücrelerin bir süspansiyonunun enjekte...

İnternöron Öncü Hücrelerinin Bir Fare Yavrusunun Beynine Nakli

Kaynak: Gonzalez-Ramos, A., et. al., Nörogelişimsel Bozuklukları Azaltmak için İnsan Kök Hücre Kaynaklı GABAerjik Nöronların Erken Doğum Sonrası Fare Hipokampüsüne Nakli. J. Vis. Uzm. (2022)Bu video, uyarıcı-inhibitör dengeyi yeniden sağlamayı amaçlayan, azaltılmış inhibitör internöronlara sahip genetik olarak değiştirilmiş bir fare yavrusunun hipokampüsüne insan kaynaklı internöron öncü hücrelerinin stereotaksik enjeksiyonunu göstermektedir.

İnsan Kaynaklı İnternöron Öncü Hücrelerinin Fare Yavrusu Hipokampusuna Nakli

Kaynak: Denaxa, M., el al., Kemogenetik Olarak Tasarlanmış Kortikal İnternöron Progenitörlerinin Erken Doğum Sonrası Fare Beyinlerine Nakli. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, ilgilenilen geni taşıyan bir plazmit vektörünün embriyonik bir beyin dilimindeki internöron progenitörlerine enjekte edilmesi ve ardından plazmit girişi ve gen ekspresyonu için elektroporasyon prosedürünü göstermektedir. Bu modifiye edilmiş progenitörler daha sonra beyin bozukluklarını tedavi etmek için kullanılabilir.

Fare Kortikal İnternöron Progenitörlerinde Agaroz Gömülü Elektroporasyon Destekli Gen Transferi

Bu iletişim kuralı kortikal interneuron ataları ve sonrası Mitotik interneuron öncüleri fare embriyonik kök değiştirilmiş bir embryoid vücut monolayer yöntemi kullanarak hücre oluşturmak için bir yöntem açıklanır. Bu ataları/hareketlenme öncesi ilk belirtiler kullanılan vitro olabilir fluorescently sıralanmış ve kader tayini çalışmak için yenidoğan yeni korteksimiz içine nakledilen veya tedavi uygulamalarında kullanılan.

Fare embriyonik kök hücre farklılaşma içine kortikal Interneuron Kara filmin tarih öncesi

Nöronal öncülerin in vitro lentiviral mühendisliğine dayanarak, vahşi tip beyinleri ve "test" ve "kontrol" türevlerinin eş-transplantasyonu, bu yöntem, neokortikal in vivo gen kontrolünde doğru modelleme sağlar basit ve ekonomik bir şekilde nöron morfoloji.

In vivo Nöromimarlık çalışmaları için tasarlanan nöronal öncülerin intraventriküler nakli

Burada, erken doğum sonrası farelerin korteksine nakledilen kortikal internöron atalarının aktivitesini manipüle etmek için kemogenetik araçları kullanmak üzere tasarlanmış bir protokol sıyoruz.

Erken Doğum Sonrası Fare Beyinlerine Kemogenetik Mühendislik Kortikal İnkornöron Progenitorlarının Nakli

Nöronal programlama ile üretilen insan pluripotent kök hücre kaynaklı GABAerjik nöronların transplantasyonu, nörogelişimsel bozukluklar için potansiyel bir tedavi yaklaşımı olabilir. Bu protokol, insan kök hücre kaynaklı GABAerjik nöronal öncüllerin yenidoğan farelerin beyinlerine üretilmesini ve transplantasyonunu tanımlar, aşılanmış nöronların uzun süreli araştırılmasına ve terapötik potansiyellerinin değerlendirilmesine olanak tanır.

İnsan Kök Hücre Kaynaklı GABAerjik Nöronların Nörogelişimsel Bozuklukları Hafifletmek İçin Erken Postnatal Fare Hipokampüsüne Transplantasyonu

Virüs tabanlı Cre Rekombinasyon kullanarak Postnatal Fare Beyin Gelişimi Gen Fonksiyonu Mosaic Analizi

Öğrenin, erken postnatal fare beyninden internöron öncülerinin homokronik nakli yöntemini. Bu teknik, gelişimsel nörobilimde hücre kaderini ve olgunlaşmayı incelemek için kullanılır.

Erken Postnatal fare beyin içine Interneuron öncüleri Homochronic nakli

Daha fazla video keşfet