Erken Postnatal fare beyin içine Interneuron öncüleri Homochronic nakli

Bu prosedürün genel amacı, doğum sonrası fare yavrularında farklı beyin bölgelerinden internöron öncüllerini toplamak ve çevresel değişikliklerin internöron kaderini ve olgunlaşmasını nasıl etkilediğini değerlendirmek için bu hücreleri yaşa uygun alıcılara nakletmektir. Bu yöntem, gelişimsel sinirbilim alanında, içsel genetik programların ve çevresel sinyallerin nöral hücrelerin kaderini şekillendirmek için nasıl etkileşime girdiğine dair temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, internöron öncüllerinin kaderindeki ve olgunlaşmasındaki değişikliklerin, yeni bir beyin ortamına evlat edinildikten sonra analiz edilebilmesidir.

Hücre toplama ve aşılama adımlarının görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü teknikteki küçük hatalar verimsiz ve başarısız nakil deneylerine yol açabilir. Başlamak için, doğum sonrası bir gün bir yavru beyninin ön ön lobuna bir tıraş bıçağı yerleştirin ve iki adet 0,5 milimetrelik dilim oluşturmak için ilk tıraş bıçağının hemen arkasındaki yuvalara ek tıraş bıçakları yerleştirin. Striatal dilimleri kabarcıklı sükroz, yapay beyin omurilik sıvısı veya sACSF içeren bir Petri kabına aktarın ve kalan beyin dokusunu buz üzerinde sACSF içeren bir Petri kabına yerleştirin.

Dilimleri bir diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin ve striatumu her iki yarım küreden sıkıştırmak için forseps kullanın, striatal parçaları hasat edilirken buz üzerinde 50 mililitrelik bir sACSF tüpüne yerleştirin. Beyin bir floresan muhabir fareden alınmışsa, striatal td-domates sinyalini globus pallidusun daha güçlü floresan sinyalinden ayırt etmek için floresan mikroskobu kullanın. Hipokampusu çıkarmak için, beyni orta hat boyunca yarımkesmek için forseps kullanın ve bir yarım küreyi medial yüzeye diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin.

Ventral beyin dokusunu çıkarmak için forseps kullanın ve korteksin dorsal ve ventriküler tarafı boyunca anteroposterior erişimi kapsayan sosis şeklindeki hipokampusu tanımlayın. Forsepsin uçlarını anterior hipokampusun önüne yerleştirin ve hipokampusu korteksten nazikçe ayırmak için hipokampal kortikal sınır boyunca sıkıştırırken forsepsleri arkaya doğru ilerletin. İzole edilen dokuyu buz üzerinde 50 mililitrelik bir sACSF tüpüne yerleştirin ve kontralateral hemisfer için hipokampus hasadını tekrarlayın.

Daha sonra hemiseke korteksi medial tarafı aşağı gelecek şekilde yerleştirin ve korteksin en dorsal, ventral, ön ve arka kısımlarını çıkarmak için forsepsleri kullanın. Medial korteksin kalan karesini buz üzerinde 50 mililitrelik bir sACSF tüpüne aktarın. Beyni çıkardıktan sonra, beynin ventral tarafını beyincik ve ön korteks veya koku soğancıklarından geçirin.

Kavisli forseps kullanarak, arka korteksi alttaki hipokampustan ve her yarım küredeki diğer dokulardan nazikçe ayırın. Ve altta yatan yapıları ortaya çıkarmak için dorsal korteksi öne doğru soyun. Hipokampusu orta hatta bir yarım kürede sıkıştırmak için forseps kullanın ve hipokampusu beyinden yanal olarak soyarak çıkarın.

Hipokampusu buz üzerinde 50 mililitrelik bir sACSF tüpüne yerleştirin ve kontralateral hipokampusu aynı şekilde hasat edin. Daha sonra, çevreleyen dokudan gevşetmek için striatumun kenarlarını nazikçe kazıyın. Striatal dokuyu toplamak için striatumun altına hafifçe sıkıştırın.

Korteksin her iki hemisferden toplanmasından sonra, daha önce gösterildiği gibi, striatumu bir floresan diseksiyon kapsamı altına aktarın. Her striatumdan herhangi bir parlak kırmızı td-domates pozitif globus pallidus dokusunu çıkarmak için forseps kullanın. Tüm dokular toplandığında, dokuyu beş milimetrelik yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın ve her toplama tüpündeki sACSF'yi, ara sıra fiske ile oda sıcaklığında 20 dakikalık bir inkübasyon için iki mililitre taze hazırlanmış pronase-sACSF çözeltisi ile değiştirin.

İnkübasyonun sonunda, pronaz-sACSF'yi bir ila iki mililitre sulandırma solüsyonu ile dikkatlice değiştirin ve dokuları ateşle parlatılmış Pasteur boruları ile mekanik olarak ayırın. Doku bulanık olduğunda ve hiçbir doku parçası görünmediğinde, floresanla aktive edilen hücre sıralamasından önce hücre kümelerini çıkarmak için hücre çözeltisini 50 mikronluk bir filtreden yeni beş mililitrelik yuvarlak tabanlı tüplere süzün. Hücreleri akış sitometrisinden aldıktan sonra, hücre süspansiyonlarını santrifüjleme için 1.5 mililitrelik konik tüplere aktarın.

Santrifüjlemeden sonra, her tüpten son 20 mikrolitre süpernatan hariç hepsini aspire edin ve sayım için peletleri yeniden oluşturun. Gerekirse, hücre çözeltisini sACSF ile mikrolitre konsantrasyon başına bir ila üç kez 10 ila 5. hücrelere seyreltin. İnce uçlu bir mikropipete mineral yağ yükleyin.

Mikropipeti bir nanolitre enjektöre takın ve nanolitre enjeksiyon aparatını manyetik bir tabana bağlı bir manipülatöre sabitleyin. İlk yavru buz üzerinde uyuşturulurken, homojen bir hücre dağılımı sağlamak için hücre solüsyonunu birkaç kez pipetleyin. Mineral yağı çıkarın ve pipeti tek hücreli süspansiyonla tamamen doldurun.

Ayak parmağını sıkıştırmaya yanıt verilmediğini onayladıktan sonra, yavruyu, başı yapışkan macun üzerinde duracak şekilde bir Petri kabı kapağına yerleştirin, böylece başın üst kısmı nispeten düz olur. Kafayı elmas delikli bir laboratuvar bandı parçasıyla örtün, öğretilen bandı cilt gerilene kadar çekin, böylece kafa sıkıca sabitlenir ve lambda delikten görünür. Güvenli yavruyu nanolitre enjektörün altına getirin ve mikropipeti, ucu doğrudan lambdanın üzerinde olacak şekilde indirin.

Manipülatör üzerindeki X, Y koordinatlarını gözlemleyin ve mikropipet başın medial, lateral ve anteroposterior eksenleri boyunca uygun koordinatlara yerleştirilene kadar manipülatör düğmelerini ayarlayın. Uç cilt üzerinde küçük bir içbükeylik oluşturana kadar mikropipeti indirin ve mikropipeti ciltten ve kafatasından beyne sürmek için z ekseni manipülatör düğmesini sıkıca ama nazikçe çevirin. Mikropipeti, ucu çadır şeklinde bir deri konisi ile çevrelenene kadar hafifçe geri çekin.

Ve z ekseni boyunca koordinatları görüntüleyin. Daha sonra mikropipeti uygun deney derinliğine indirin ve hücreleri enjekte edin. Mikropipeti geri çekmeden önce hücreler verildikten sonra 15 saniye bekleyin ve istenirse enjeksiyonu ikinci bir yerde tekrarlayın.

Yavruyu bir ısıtma yastığının üzerine yerleştirin ve ev kafesine geri aktarmadan önce tam iyileşme sağlanana kadar izleyin. Aşılanmış hücreler, düzinelerce ila birkaç bin arasında değişen değişken hücre sağkalım oranları ile hedeflenen beyin bölgeleri boyunca göç eder. Aşılanmış hücreler, internöron morfolojileri ve iyi karakterize edilmiş internöron nörokimyasal belirteçler sergileyen birçok hücre ile uygun bölgeler içinde lokalize olur.

Donör hücreler, heterotopik transplantasyonlarla yeni ortamlara aşılandıklarında bile hayatta kalır ve olgunlaşır. Aşılanmış hücrelerin elektrofizyolojik analizi, iyi tanımlanmış internöron alt tiplerini temsil eden yetişkin benzeri fizyolojik özellikleri ve farklı ateşleme modellerini ortaya çıkarır, bu da aşılanmış internöronların konakçı ortamda uygun şekilde olgunlaşabildiğini düşündürür. Nakledilen hücreler ayrıca spontan uyarıcı postsinaptik akımlar gösterir.

Channelrhodopsin-2'yi eksprese eden nakledilen internöronlara bitişik piramidal hücrelerden yapılan kayıt, bu endojen piramidal hücrelerde mavi ışıkla uyandırılan postsinaptik GABAerjik akımları ortaya çıkarır. Bu prosedürü denerken, hücre ölümünü en aza indirmek için hücreleri buz üzerinde tutmak ve hücreleri bir Pasteur pipeti ile nazikçe ezmek önemlidir. Bu prosedürü takiben, çevresel değişikliklerin bir hücrenin transkriptomunu nasıl etkilediğini daha tam olarak tanımlamak için aşılanmış hücreler üzerinde tek hücre dizilimi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, yenidoğan yavruların farklı beyin bölgelerinden internöron öncüllerini izole edebilmeli ve bu hücreleri yaşa uygun doğum sonrası yavruların çeşitli beyin bölgelerine nakledebilmelisiniz.