Calorespirometry: Hücresel enerji metabolizması araştırmak için bir güçlü, invaziv olmayan bir yaklaşım

Bu prosedürün genel amaçları, biyolojik bir numunenin metabolik aktivitesini analiz etmek ve anaerobik yolların numune içindeki hücresel enerji üretimine ne ölçüde katkıda bulunduğunu belirlemektir. Bu yöntem, ilaç geliştirme sırasında mitokondriyal toksisitenin kapsamı hakkında farmasötik alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, ilgilenilen bir hücre örneğinde oksijen tüketiminin ve ısı üretiminin aynı anda ölçülmesini kolaylaştırmasıdır.

Dolayısıyla bu yöntem, farmasötik geliştirme sırasında tedavi planlaması hakkında fikir verebilir. Metabolik ön koşullandırmanın kriyoprezervasyon üzerindeki etkilerinin değerlendirilebildiği sirobiyoloji gibi diğer alanlara da uygulanabilir. Respirometreyi hazırlamak için önce her bir respirometre odasına iki nokta iki mililitre DMEM ekleyin ve tıpaları tam olarak yerleştirin.

Ortama optimum oksijen difüzyonuna izin vermek için tıpaları bir durdurucu-ara parça aletiyle ayarlayın ve odaları, oksijen konsantrasyonu ve oksijen akışı stabil olana kadar numuneleri 750 santigrat derecede 37 rpm'de sürekli olarak karıştıracak şekilde ayarlayın. Respirometre yazılımının, deneyde kullanılan ortamın oksijen çözünürlüğünü hesaba katacak şekilde programlandığını onaylayın. Ardından oksijen konsantrasyonu izinin sabit bir kısmını seçin ve bu kısmı %100 hava doygunluğu için kalibre edin.

Şimdi, haznelerde kabarcık olmamasına dikkat ederek tıpaları kapatın. Yaklaşık 10 dakika sonra, stabil bir oksijen akışı gözlenmelidir. Kalorimetriye hazırlanmak için önce referans ampule iki nokta beş mililitre deiyonize su ekleyin, ardından kapağı sıkın.

Bir hava pompası kullanarak, ampuldeki dış kalıntıları temizleyin, ardından ampulü kalorimetrenin referans kanalına yerleştirmek için yavaşça indirin. Ampul, hücre numunesi ile ampul hazırlanana kadar birinci konumda kalacaktır. Kalorimetri için kullanılan DMEM, nemlendirilmiş bir atmosfer ve %5 CO2 ile 37 derecelik bir inkübatörde dengelenmelidir.

Kullanılacak her kalorimetrik ampul için 100 mililitrelik bir plakaya üç mililitre DMEM ekleyerek deneye başlayın ve numune kalorimetri için hazır olana kadar plakayı inkübatöre yerleştirin. Ortam dengelenirken, %60 ila 80 arasında birleşen ve homojen olarak dağılmış HepG2 hücrelerine sahip bir plaka seçmek için ters çevrilmiş bir mikroskop kullanın. İlk olarak, hücre kültürü ortamını çıkarın ve hücreleri 10 mililitre PBS ile iki kez yıkayın.

37 santigrat derecede üç mililitre önceden ısıtılmış tripsin ekleyin ve plakayı 37 santigrat derecede inkübe edin. Yedi ila 10 dakikalık inkübasyondan sonra, enzimatik reaksiyonu üç mililitre 37 santigrat derece DMEM ile nötralize edin ve hücreleri tek hücreli bir süspansiyona nazikçe ayırmak için beş mililitrelik bir pipet kullanın. Hücreleri santrifüjleme için steril 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve paleti yaklaşık beş mililitre taze DMEM'de yeniden askıya alın.

Herhangi bir hücre kümesini ayırmak için hücreleri iyice pipetleyin ve saydıktan sonra, hücreleri 50 mikrolitre ortam başına yaklaşık iki milyon hücreye konsantre edin. Bu yöntemin tekrarlanabilirliği, tutarlı ve doğru hücre sayımlarına bağlıdır. Numunenin homojen olduğundan ve hücrelerin analiz sırasında herhangi bir noktada topaklanmadığından emin olmak çok önemlidir.

Ardından, respirometrik ve kalorimetrik ölçümler yapmaya hazır olana kadar hücreleri buz üzerinde saklayın. Kalorimetrik ölçümden önce, kalorimetrenin bilgisayara bağlı olduğunu ve kalorimetrik sinyalin kararlı ve mikro watt cinsinden olduğunu onaylayın. Hücreleri, numune hazırlamadan önce inkübatöre yerleştirilen dengelenmiş ortamda mililitre başına 100.000 hücreye seyreltin.

Daha sonra, her bir ampule iki nokta beş mililitre hücre çözeltisi ekleyin, ampullerin kapakları ile ortam arasında gaz difüzyonuna izin vermek için yeterli miktarda hava tutulduğunu doğrulayın. Kapakları hemen sıkın ve dış kalıntıları temizlemek için sızdırmaz ampulleri hava ile temizleyin. Ardından, kalorimetrelerden birini konumlandırmak için hücre numunesi ile mühürlü ampulü yavaşça indirin.

Homojen bir çözelti sağlamak için numuneyi iyice karıştırın ve sürekli karıştırarak respirometrenin her kapalı odasına iki milyon hücre enjekte edin. Kalorimetrede birinci konumda 15 dakika sonra, hem referans ampulü hem de ampulü hücrelerle birlikte ikinci konuma yavaşça indirin ve indirme süresini kaydedin. Hücreler respirometreye enjekte edildikten 10 ila 15 dakika sonra, oksijen akışında bir stabilizasyon ve oksijen konsantrasyonunda sabit bir azalma gözlenmelidir.

Sızıntı solunumunu belirlemek için, her odaya mililitre oligomisin başına dört miligramlık bir mikrolitre enjekte edin ve oksijen akışının yaklaşık 10 dakika stabilize olmasına izin verin, bu da az önce gösterildiği gibi kararlı sızıntı solunum hızını kaydedin. Daha sonra, maksimum akıyı belirlemek için, odaya iki mikrolitre sıfır nokta iki milimolar FCCP enjekte edin, her enjeksiyondan sonra oksijen akışının stabilize olmasına izin verin ve maksimum akıya ulaşılana kadar titrasyonlara devam edin. Maksimum akı sırasında stabil solunum hızını kaydedin.

Numune ölçümünden önce respirometre odası çalışırken, hem oksijen konsantrasyonu hem de oksijen akışı izleri stabil olmalıdır. Ampul ikinci konuma indirildikten sonra, ısı çıkışının kararlı olduğu bir zaman periyodu tanımlanabilir ve kalorispirometrik oranın hesaplanmasına izin vermek için oksijen akışının stabil olduğu karşılık gelen bir zaman tanımlanabilir. HepG2 hücreleri glikoz yokluğunda kültürlenirse ve mitokondriyal tutulumu arttırmak için galaktoz takviyesi yapılırsa, hücreler kalorimetrenin içinde çoğalmaz, bunun yerine ampulde yaklaşık 30 dakika sonra metabolik aktivitelerini azaltır, bu da kalorispirometrik hesaplamayı ısı dağılımının ölçüldüğü en erken zaman noktasıyla sınırlar.

Oksijen akışının stabilize olması ve oksijen konsantrasyonunun giderek azalması yaklaşık 15 dakika sürdüğü için, ısı üretimi ve oksijen tüketiminin ölçümlerinin aynı zaman noktalarında toplanması için hücrelerin ampule pipetlendiği sürenin kaydedilmesi çok önemlidir. Hücrelerin stabilize oksijen akışı, kalorispirometrik oran hesaplanırken oksijen tüketimi için bir vekil görevi gördüğünden, oksijen akışında bir düşüş ve ardışık FCCP titrasyonları ile solunumun arttırılamaması ile gösterilen maksimum bağlanmamış solunum ile gösterilen sızıntı solunumunu değerlendirmek için ek titrasyonlar yapılabilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa dört saatten daha kısa sürede tamamlanabilir.

Bu prosedürü denerken, diğer hücre dizilerinin farklı metabolik özelliklere sahip olabileceğini hatırlamak önemlidir. Bu nedenle, her yeni hücre hattı hem kalorimetrik hem de respirometrik ölçümler için optimize edilmelidir. Bu videoyu izledikten sonra, doğru enstrümantal kalibrasyonu sağlamak ve bir kalorispirometrik deneyi düzgün bir şekilde yürütmek için HepG2 hücrelerinin kalorispirometri için nasıl hazırlanacağını iyi anlamalısınız.