Kardiyak miyositler mitokondrial membran potansiyeli hipoksi/Reoxygenation sonra ölçmek için akış sitometresi tabanlı tahlil
13 Temmuz 2018
Burada, hipoksi/reoxygenation veya koruyucu bir ajan olmadan maruz sonra hücreleri mitokondrial membran potansiyelini değerlendirmek için Dizayn Merkezi-1 boya kullanan bir iletişim kuralı mevcut.
Bu yöntem, hipoksi/reoksijenasyonun mitokondriyal membran potansiyelindeki hücreler üzerindeki etkisini ölçmeye yardımcı olabilir ve bir ajanın bir yaralanmaya karşı koruyucu olup olmadığını değerlendirmek için kullanılabilir. Bu testin temel avantajı, MMP'nin mitokondriyal boyut gibi faktörlerin durumunda tespit edilmesidir. Ek olarak, malzeme ve parlaklık için düşük bir gereksinime sahiptir.
Altı oyuklu bir plakada% 70 birleşik insan kardiyak miyositleri ile başlayın. Hücreleri fosfat tampon salin ile yıkadıktan sonra, iki mililitre serum ve glikozsuz DMEM'e ilaç veya araç ekleyin. Hipoksiden önce 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede %5 CO2 ve %95 hava içeren bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin.
30 dakika sonra, insan kardiyak miyositlerinden oluşan tabağı 2,5 litrelik hava geçirmez anhipoksik bir kavanoza koyun. Serbest oksijeni temizlemek için bir katalizör ve ortamdaki oksijen gerilimini ölçmek için anerobik bir gösterge ile donatılmıştır. Kavanozu doku kültürü inkübatörüne yerleştirin.
Anerobik göstergenin rengi, normoksik ortamda açık maviden hipoksik koşullarda soluk beyaza değişir. Altı oyuklu plakayı kavanozdan çıkararak ve iki saat boyunca inkübatör rafına yerleştirerek insan kardiyak miyositlerini yeniden oksijenlendirin. Yeniden oksijenlendirmeyi takiben, hücreleri bir mililitre önceden ısıtılmış PBS ile durulayın ve kuyu duvarı boyunca 0,5 mililitre önceden ısıtılmış% 25 tripsin ekleyin.
Tüm insan kardiyak miyositleri neredeyse ayrılana kadar yaklaşık bir dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra tripsini nötralize etmek için kuyucuklara bir mililitre DMEM tam ortamı ekleyin. Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında üç dakika boyunca 500 kez G'de santrifüjleyerek HCM'leri peletleyin.
Santrifüjlemeyi takiben, peletleri rahatsız etmeden süpernatanı dikkatlice aspire edin. Daha sonra her tüpe 5 mililitre insan kardiyak miyosit tam ortamı ve 5 mililitre JC-1 çalışma çözeltisi ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek HCM'leri yeniden askıya alın.
Floresan indikatörün ağarmasını önlemek için tüpleri alüminyum folyo ile örtün ve hücreleri normal koşullarda 20 dakika inkübe edin. İnsan kardiyak miyositlerini, dört santigrat dereceye kadar önceden soğutulmuş bir santrifüjde üç dakika boyunca 500 kez G'de santrifüjleyerek peletledikten sonra, hücreleri iki mililitre buz gibi soğuk JC-1 boyama tamponu ile iki kez durulayın. İkinci durulamadan sonra, insan kardiyak miyositlerini 300 mikrolitre buz gibi soğuk boyama tamponunda yeniden süspanse edin.
Ve numuneleri ilgili numune tüplerine filtreleyin. Hücreleri 30 dakika içinde akış sitometrisi ile analiz edin. Akış sitometresini başlatın ve yazılımın bağlı olduğundan emin olun.
Akışkan başlatma gerçekleştirin. Akışı başlatın ve kesmeyi ayarlayın. Akış sitometrisi yazılımında iki nokta grafiği penceresi açın.
İlk nokta çiziminde X ekseninde öne doğru saçılan ışığı ve Y ekseninde yan dağınık ışığı seçin. Hücrelerin özelliklerini sırasıyla büyüklükleri ve taneciklikleri açısından temsil etmek. Y ekseni için PE algılama kanalını seçin.
Ve hücrelerdeki JC-1 boyasının çiçeklenme yoğunluğunu ölçmek için kullanılan ikinci nokta grafiğinde logaritmik bir ölçek kullanarak X ekseni için FITC. Tüp destek kolunun dışarı çıkmasına izin vermek için boşalt'a tıklayın ve JC-1 ile boyanmamış insan kardiyak miyositlerini içeren boş numune tüpünü yerleştirin. Destek kolunu çalışma konumuna döndürmek için yüke tıklayın.
Boş numune tüpündeki süspansiyondan parçacıkları toplamak için kayda tıklayın. Ve ikinci nokta grafiğinde floresan kanallarının voltajlarını ayarlayın. İlk nokta grafiğinde daha fazla analiz için hücre popülasyonunu kapatın.
Ardından, insan kardiyak miyositlerini analiz edin. Her bir numune tüpünün istatistiklerini görüntüleyin ve kırmızı floresan yoğunluğunun oranını yeşil floresan yoğunluğunun oranına bölerek her bir numunenin MMP'lerini hesaplayın. Hipoksi ve reoksijenasyon, Annexin PI oranı ile ölçülen normal hücrelere kıyasla, insan kardiyak miyositlerinin apoptozunu önemli ölçüde indükler.
kardiyo-koruyucu etkileri olan geleneksel bir Çin tıbbı, hipoksi / reoksijenasyon sonrası HCM'lerin apoptozunu önledi. Burada gösterildiği gibi, mitokondriyal CCP ile tedaviden sonra JC-1 kırmızı / yeşil oranı neredeyse sıfırdı. Apoptoz testinden elde edilen sonuçlarla tutarlıdır.
H / R ile tedavi edilen grup, normal gruba kıyasla önemli ölçüde daha düşük bir kırmızı / yeşil oranı gösterdi. Ve böyle bir oran değişikliğini tersine çevirdi. Bu prosedürü denerken, sıcaklığın mitokondriyal membran potansiyelinin stabilitesi üzerinde önemli bir etkisi olduğundan, JC-1 ile yüklü hücreleri buz gibi soğuk duran tamponda başlatmayı unutmamak önemlidir.
Bu prosedürü takiben, MMP'nin azalmasının MPTP'nin açılmasından kaynaklanıp kaynaklanmadığı gibi ek soruları yanıtlamak için genetik manipülasyon gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, hipoksi/reoksijene maruz kalmış hücrelerin mitokondriyal membran potansiyelini (MMP) değerlendirmek için JC-1 boyası kullanır. Aynı zamanda, hücresel hasara karşı koruyucu ajanların etkilerini de değerlendirir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücresel Biyoloji
- Mitokondri İşlevi
- Hipoksi Araştırması
Arka Plan
- Mitokondri membran potansiyeli hücresel hayatta kalma için kritik öneme sahiptir.
- Hipoksi/reoksijene maruz kalma hücresel hasara yol açabilir.
- Koruyucu ajanlar bu etkileri hafifletebilir.
- JC-1 boyası, MMP değişikliklerinin güvenilir bir göstergesidir.
Çalışmanın Amacı
- Hipoksi/reoksijene maruz kalmanın MMP üzerindeki etkisini ölçmek.
- Belirli ajanların koruyucu etkilerini değerlendirmek.
- MMP değerlendirmesi için düşük malzeme gerektiren bir yöntem sunmak.
Kullanılan Yöntemler
- İnsan kardiyak miyositlerini %70 konfluansa kadar kültür edin.
- Hücreleri fosfat tamponlu salin ile yıkayın.
- Serumsüz DMEM içinde ilaç veya taşıyıcı ile kuluçkaya bırakın.
- Değerlendirme için hücreleri hipoksi koşullarına maruz bırakın.
Ana Sonuçlar
- Hipoksi/reoksijene bağlı olarak MMP'de değişiklikler gösterildi.
- Ajanların MMP üzerinde koruyucu etkileri belirlendi.
- Yöntemin düşük malzeme gerekliliği gösterildi.
- Mitokondri boyutunun MMP tespiti üzerindeki etkisi vurgulandı.
Sonuçlar
- JC-1 yöntemi, MMP değişikliklerini değerlendirmek için etkilidir.
- Koruyucu ajanlar, MMP sonuçlarını önemli ölçüde etkileyebilir.
- Bu yöntem hücresel çalışmalar için erişilebilir ve verimlidir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Assessing mitochondrial membrane potential (MMP) is critical for evaluating cardioprotective strategies in ischemia-reperfusion injury models. This flow cytometry-based JC-1 assay provides a quantitative, high-throughput readout of mitochondrial depolarization in human cardiac myocytes, enabling mechanistic de-risking of therapeutic candidates targeting reperfusion injury. The method supports target validation by linking MMP changes to mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening, a key event in cardiomyocyte death.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Measures MMP as a functional readout of mitochondrial health and mPTP opening in disease-relevant human cardiac myocytes.
- Operational Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding cytoprotective agents under hypoxia/reoxygenation stress.
- Predictive Value: Supports target confidence by correlating MMP preservation with reduced apoptosis, as demonstrated by Annexin PI ratio.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: JC-1’s red/green fluorescence ratio provides a ratiometric, mitochondria-specific readout independent of cell size or granularity.
- Operational Value: Low material requirements and compatibility with standard flow cytometry platforms support assay scalability and reproducibility.
- Screening Readiness: Enables rapid evaluation of compound libraries for effects on MMP in a physiologically relevant human cell model.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses human cardiac myocytes to enhance translational relevance over rodent models in ischemia-reperfusion studies.
- Operational Value: Standardized hypoxia/reoxygenation protocol allows consistent induction of mitochondrial depolarization for compound testing.
- Predictive Value: Facilitates go/no-go decisions by linking MMP protection to functional outcomes like reduced apoptosis.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the early discovery continuum, supporting target validation and lead identification by providing mechanistic insights into mitochondrial dysfunction in cardiovascular disease models.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of MMP as a biomarker of mPTP activation and reperfusion injury severity.
- Screening: Delivers quantitative, normalized fluorescence ratio data suitable for hit selection and dose-response profiling.
- Analytics: Generates red/green intensity ratio metrics that allow statistical comparison across treatment groups.
- Translational Research: Uses human-derived cells to improve predictive confidence for preclinical advancement.
- Enterprise Reuse: Protocol can be adapted across cardiotoxicity and cardioprotection screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into mitochondrial depolarization as a convergent point of reperfusion injury pathways.
- Operational Value: Minimizes variability by normalizing MMP readout to mitochondrial content via ratiometric JC-1 detection.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early identification of compounds that preserve MMP and reduce apoptotic commitment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of candidates demonstrating MMP stabilization in human cardiac myocytes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary human cardiac myocyte culture and hypoxia/reoxygenation modeling.
- Dependent on flow cytometry with FITC and PE detection channels and logarithmic fluorescence scaling.
- Necessitates strict temperature control during JC-1 staining to preserve mitochondrial membrane potential integrity.
- Requires standardization of hypoxia duration and reoxygenation timing across experimental groups.
- Limited to adherent cell types amenable to trypsinization and washing without loss of viability.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:42
Establishment of Hypoxia/Reoxygenation Model
1:57
Preparation of HCMs for Flow Cytometry
3:49
Flow Cytometer Setup
4:43
Flow Cytometry Measurement and Data Analysis
5:40
Results: Validation of the Establishment of Hypoxia/Reoxygenation (H/R) Model by Flow Cytometry
6:34
Conclusion
