Endojen nöral kök hücre etkinleştirme en az Medulla Spinalis Yaralanmalarında, fare modeli değerlendirmek için bir Neurosphere tahlil

Bu yöntem, rejeneratif tıpta nöral öncü hücrelerin rolü ile ilgili soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Özellikle, yaralanmanın nöral öncü hücrelerin davranışını nasıl etkilediğini sorabiliriz. Bu tekniğin temel avantajı, omurilik yaralanmasının endojen nöral öncü hücre kinetiği üzerindeki etkisini incelemek için bir yaklaşım sağlamasıdır.

Bu tekniklerin görsel gösterimi çok önemlidir. Cerrahi ve diseksiyon adımları hassasiyet gerektirdiğinden ve pratikle mükemmelleştirilebilmelerine rağmen öğrenilmesi zor olabilir. Prosedüre başlamadan önce, anestezi uygulanmış bir farenin sırtından kürkü sırtın ortasından boynuna ve kulaklarına çıkarmak için saç kesme makinesi kullanın.

Fareyi stereotaktik bir cihaza sabitledikten sonra, vücudu ve omurgayı düzeltmek için kuyruğun tabanını hafifçe çekerken karnın altına dört ila beş parça rulo gazlı bez yerleştirin. Torasik omurgayı desteklemek için torasik gazlı bez rulosunu fare karnından rostral olarak üst toraksa doğru itin. Ve kuyruğu ve uzuvları yıldız benzeri bir yönde sabitlemek için laboratuvar bandı kullanın.

Maruz kalan cildi sıralı% 70 etanol ve povidon iyot çubukları ile dezenfekte ettikten sonra, her iki kürek kemiğinin orta noktasından torasik omurganın eğriliğine kadar hayvanın uzunlamasına eksenine paralel dikey bir kesi yapmak için 10 numaralı bir neşter bıçağı kullanın. Yumuşak dokuyu ve omurga konturunu ortaya çıkarmak için cildi geri çekin. Ve süper skapular yağ yastığının alt sınırını tanımlayın.

Ardından, sırt kas tendonlarını omurgadan ayırmak için vertebral T5 ila T8 ve dokuz kemiğin her iki tarafını dikkatlice ama zorla kesmek için neşteri kullanın. Ekartörleri, ekartörlerin dişleri omurganın her iki tarafındaki kesi bölgesine yerleştirilecek şekilde yeniden konumlandırın. Ve pozlamayı ayarlamak için her bir ekartörü, geri çekilmiş kas katmanlarına çok fazla baskı uygulamadan omurga yeterince yükselene kadar genişletin.

Cerrahi mikroskop altında, omur kemiğini ortaya çıkarmak için omurganın üzerindeki artık kasları ve diğer yumuşak dokuları dikkatlice temizleyin. Omurların dikenli sürecini dişli forsepslerle sıkmak ve çıkarılacak omurları belirlemek için forsepsleri hafifçe yukarı ve aşağı hareket ettirmek. Daha sonra, bir çift kavisli künt makasın bir ucunu, eksize edilecek vertebral laminaya kaudal olarak açıkta kalan intervertebral foramenin her iki tarafına sokun

Ve bağlantı intervertebral eklemlerini iki taraflı olarak kesin. Ardından, laminayı yukarı doğru kaldırın ve kemiği izole etmek ve çıkarmak için laminanın üst ekini kesin. Vertebra laminasını keserken ve çıkarırken, alttaki omuriliğe zarar vermemek için makası her zaman yukarı doğru açılı tutmaya dikkat edin.

Dorsal orta hat damarları bir dönüm noktası görevi görürken, 30 gauge iğne ucunun 45 derece bükülmüş şaftını, eğimli tarafı yukarı bakacak şekilde, omuriliğin dorsal yan yüzeyine bir milimetre derinliğe sokun. Ve orta hattın her iki tarafına yaklaşık 0,5 milimetre yanal. İğneyi kaudaldan rostral yöne yaklaşık iki milimetre hareket ettirin, böylece eğimin tüm uzunluğu kordona yerleştirilir.

Ardından, iğneyi çıkarmak için girişin yolunu yeniden izleyin. Yarayı kapatmak için, ekartörü çıkarın ve orta hat boyunca yaralanmanın her iki tarafındaki sırt kaslarını birleştirmek için 6-0 emilebilir bir sütür kullanın. Ve üstteki cildi kapatmak için 4-0 ipek sütür.

Nörosferleri izole etmek için, kas ve vertebral kemik konturunu ortaya çıkarmak için sırtın tüm uzunluğu boyunca deride orta hat kesisi yapın. Her kürek kemiğinin medial yönünü kaldırın ve kürek kemiği ile omurlar arasındaki yumuşak dokuyu kesmek için makas kullanın. Alttaki vertebral kolon açığa çıktığında, omurganın eğriliğini takip ederek makası üst torasik açıklığa sokun ve vertebral kolonuyu izole etmek için bağlı kaburgaları, kasları ve iç organları kesin.

Makası kaudal vertebral foramenin içine sokun ve sağlam kordona zarar vermemeye dikkat ederek laminaların her iki yanındaki intervertebral eklemleri kesin. Kordonun uygun uzunluğu açığa çıktığında, omurilik dokusunu buz üzerinde düzenli, yapay beyin omurilik sıvısından oluşan bir Petri kabına aktarmadan önce, kordondan yanal olarak uzanan omurilik sinirlerini dikkatlice kesin. Bir diseksiyon mikroskobu altında, omurilik dokusunu, yaralanma bölgesine yaklaşık iki milimetre doku rostral ve kaudal içerecek şekilde kesin ve kordonu dorsal ve ventral fissürler boyunca iki uzunlamasına yarıya nazikçe ayırmak için iki çift ince forseps kullanın.

Yaralı dorsal lateral beyaz maddeyi kesmek için mikro makası kullanın. Ve yaralı dokuyu 15 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin. Omuriliğin bir yarısını forseps ile tutarak, uygun periventriküler bölgeyi izole etmek için omuriliğin rostral kaudal kapsamı boyunca iki çift forseps ile yaralanmamış beyaz maddeyi kızdırın ve çıkarın.

Yaralı beyaz cevheri ve ilişkili periventriküler bölgeleri omuriliğin diğer yarısından aynı şekilde izole ettikten sonra, periventriküler doku parçalarını ayrı ayrı 15 mililitrelik konik tüplere yerleştirin. Ve dokuyu tüplerin duvarlarına karşı nazikçe kıymak için mikro makası kullanın. Doku sindirim prosedürü tamamlandıktan ve tek hücre süspansiyonu elde edildikten sonra, hücre durumu başına 25 militerlik bir doku kültürü şişesine 10 mililitre uygun ortam ekleyerek bir nörosfer kültürü oluşturun.

Ve izole edilmiş nöral kök hücreleri, bir hücre kültürü inkübatöründeki kültürleri için mikrolitre başına 10 hücre klonal yoğunluğa kadar ekleyin. 24 saat sonra, şişeleri hafifçe döndürün ve içindekileri santrifüjleme için ayrı ayrı 15 mililitrelik konik tüplere boşaltın. Saymak için peletleri bir ila iki mililitre taze nöral bazal ortamda yeniden süspanse edin.

Ve hücreleri, kuyu başına 500 mikrolitre uygun karşılık gelen mitojen takviyeli ortam içeren, koşul başına bir 24 oyuklu doku kültürü plakasında klonal yoğunlukta plakalayın. Ardından, hücre kültürü inkübatöründe nöroküreleri yedi gün boyunca büyütün. Minimal omurilik yaralanmasından beş gün sonra, kesin nöral kök hücre kaynaklı nörosferlerin mutlak sayısı, ilkel nöral kök hücre kaynaklı nörosferlerin sayısından daha fazladır.

Kesin nörosferler daha büyük bir çap ve büyük bir karanlık merkez sergiler. İlkel nörosferler ise boyut olarak daha küçüktür ve daha sıkı paketlenmiştir. Minimal omurilik yaralanması, merkezi kanaldan yaralanma seviyesinde büyüyen nörosferlerde önemli bir artışa neden olurken, merkezi kanalda nispeten mütevazı bir artışa kıyasla, yaralanma seviyesine rostral

Kesin nöroküreler, yaralanma seviyesinde lezyonlu beyaz cevherden de üretilebilir. Laminektomi tek başına hayvanlarda nörosfer oluşturan hücreler içermeyen bir bölge. İlkel nöral kök hücrelerde benzer bir artış, lezyon bölgesi seviyesindeki beyaz cevherdeki ilkel nöroküreler hariç, yaralanma sonrası gözlenir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, cerrahi teknik 40 dakikadan kısa sürede gerçekleştirilebilir. Doku diseksiyonu ve izolasyonu, uygun şekilde yapılırsa 30 dakikanın altında gerçekleştirilebilir. Cerrahi prosedürü takiben, hayvan suşuna bağlı olarak, immünohistokimya ve lineat şoklama gibi ek metodolojiler, proliferasyon kinetiği ve yaralanma sonrası nöral öncü hücrelerin kendi kaderi gibi ek soruları yanıtlamak için kullanılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, omurilik yaralanmasını takiben nöral kök hücre aktivasyonunu değerlendirmek için nörosfer testinin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.