Name: Epitel hücrelerinin Shigella enfeksiyon sırasında CA2 + yanıtları görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-24T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Öğrenin, Shigella enfeksiyonu sırasında HeLa hücrelerinde lokal ve global kalsiyum yanıtlarını floresan mikroskopi ile görüntüleme yöntemini. Bu teknik, patojen-konak etkileşimlerini incelemek için değerli bir protokol sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jenny-Lee Thomassin el yazması düzenleme ona yardım için teşekkürler. İş ANR tarafından desteklenen hibe MITOPATHO ve PATHIMMUN, Labex Memolife ve PSL IDEX Shigaforce verir. Chunhui, Çin burs Konseyi bir doktora hibe alıcısının güneştir. Laurent Combettes ve Guy Tran Van Nhieu olan bir WBI-Fransa değişimi Tournesol programı N ° 31268YG alıcıları (Wallonie-Bruxelles International, Fonds de la Recherche Scientifique, Ministère Français des Affaires étrangères et européennes, Ministère de l'Enseignement supérieur et de la Recherche dans le kadro des Partenariats Hubert Curien).

1. hazırlıkları
<ol><li>
Bakteri hazırlık
	<ol>
<li>Bakteri plaka — AfaE adhesin (M90T-AfaE) ifadeShigella vahşi tipi zorlanma — bir trypticase üzerine soya (TCS) agar içeren % 0,01 Kongo kırmızısı (CR) plaka ve onları 37 ° C'de 18 h için kuluçkaya Not: onların tekrarlanabilirlik artırmak için 1.1.1. adımda elde Shigella plakaları 4 ° C'de depolanan ve CR ortamdaki tüm kolonileri sonunda zaman içinde kırmızıya döner çünkü bir hafta içinde kullanılmalıdır.</li>
		<li>TCS suyu öncesi kültür çizgi plakalar üzerinden 3 kırmızı kolonileri seçerek aşılamak. Not: Tek bir klonu olan virülans plazmid Genetik rekombinasyon uğramıştır malzeme çekme olasılığını sınırlandırmak için bir aşı 3 kolonileri ile gerçekleştirilir.</li>
		<li>16 h 200 devirde 37 ° C'de için titreyen bir kuluçka sıvı bakteriyel kültürlerde büyümek. Ampisilin 75 mg/mL nihai bir konsantrasyon ekleyin. Aşırı antibiyotik büyük virülans plazmid kaybına yol açabilir gibi antibiyotik konsantrasyonları 3 x minimum inhibitör konsantrasyonu aşmaması gerekir. Not: Shigella virülans plazmid bakımından uygun antibiyotik konsantrasyonları ile desteklenmiş CR plakaları bakteri kültürleri kaplama tarafından doğrulanması gerekir. Beyaz kolonileri varlığı plazmid kaybı olduğunu gösterir.</li>
		<li>1: 100 seyreltme, bakteriyel öncesi kültür ile Kıbrıslı Türkler kültürü aşılamak. Titreyen bir kuluçka için 200 devirde 2 h 37 ° C'de kuluçkaya. 600 optik yoğunluk emin nm (OD600nm) olduğunu 0,2 - 0,4.</li>
		<li>Bakteri kültürü için 13.000 x g 21 ° c de 2 dk santrifüj kapasitesi ve Pelet EM Orta (120 mM NaCl, 7 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 0.8 mM MgCl2, 5 mM glikoz ve 25 mM HEPES eşdeğer bir hacmi resuspend pH 7,3 =).</li>
		<li>Bir EM arabellek 0.1 son OD600nm , bakteriyel süspansiyon sulandırmak ve hemen kullanın veya 21 ° C'de depolayın ve 60 dk içinde kullanabilirsiniz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hücre hazırlık
	<ol>
<li>DMEM kültür HeLa hücreleri 1 g/M glikoz ile % 10 fetal buzağı serum (FCS) ile desteklenmiş ve onları % 10 CO237 ° C'de büyümek. TC-DMEM içinde 4,5 g/M glikoz, ile yetiştirilen % 10 FCS ve non-gerekli amino asitler içeren % 10 CO237 ° C kuluçka içeren 7 büyümek.</li>
		<li>Hücre için bakım, düzenli olarak bir büyüme-iletişim inhibisyon önlemek için hücreleri bölme konfluent devletlere bağlı; Bu bir Ca2 + sonda yükleme/transfection için yüksek verimlilik önemlidir.</li>
		<li>HeLa hücreleri üzerine 6-şey plakaları 3 x 105 hücreleri/iyi deneme önceki gün HeLa hücreleri için yoğunluğu, steril 25 mm çapında dairesel coverslips plaka.</li>
		<li>TC-7 hücrelerin, trypsinize ve hücreleri saymak. Onları 4 x 105 hücreleri/iyi tohum ve onları bir % 10 CO237 ° C'de 5-7 gün kuluçkaya-kuluçka deneyler bir polarizasyon için izin vermek için önce.<ol>
<li>Hücre kültür orta denemenin gün kadar her gün yenileyin. Not: Cam-alt 35-mm çaplı tek kullanımlık odaları da coverslips içeren wells bir alternatif olarak kullanılabilir. Belgili tanımlık ikinci are kullandıysanız, sıcaklık kontrolü ısıtmalı bir sahne ya da amaç yeterli değildir ve bir termostat kuluçka odası monte mikroskop sahne gereklidir.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Denemenin, gün Orta kaldırmak ve hücreleri 3 yıkama x 21 ° C'de 1 mL EM orta ile</li>
	<li>3 mM Fluo-4-AM14 21 ° C'de 30 dk bir EM arabellekte hücrelerle yük Not: alt konfluent HeLa hücreleri yüklenmesini önemli sorun oluşturmaz, polarize TC-7 hücreleri yüklenmesini kez türdeş olmayan ve kötü verimli iken. Bu hücreler için bulduk yükleme verimliliği dispersiyon ajanı eklenmesi tarafından geliştirilmiş — pluronic asit — son konsantrasyonu % 0,1 ve anyon-ışınlama inhibitörü bromosulfophtalein 20 µM için son bir konsantrasyon, EM Fluo-4-AM-içeren. Ratiometric kimyasal kullanımı probes veya genetik olarak kodlanmış-sondalar gerektiren çift edinme yerel Ca2 + yanıt görüntüleme için gerekli satın alma hızı ile uyumlu değil FRET.</li>
	<li>Örnekleri 3 yıkama x EM ile tampon ve daha da onları EM arabellek 21 ° C'de AM yan hidroliz için izin vermek için 1 ml kuluçkaya. Kullanım Fluo-4 hücreleri hemen içinde sonraki 90 dk (21 ° C'de muhafaza) yüklü.</li>
</ol>2. enfeksiyon ve yerel Ca2 + tepkilerin resim alma
<ol><li>Bir görüntüleme odası veya cam alt kamara Fluo-4 yüklü hücreleri içeren coverslip yerleştirin. Görüntüleme odasında örnekleri yıkamak veya cam alt tek kullanımlık odası 3 x ile bileşikler potansiyel olarak hücre lizis kaynaklanan kaldırmak için EM arabellek. EM arabellek 1 mL ekleyin.</li>
	<li>33 ° C'de ısıtılmış bir ters floresan mikroskop sahnede odası yer Not: Bu sıcaklık yerel yanıt görselleştirmek için en uygun sıcaklık Shigella işgali işlemi ile uyumlu ve Ca2 + yanıtları yavaşlama arasında bir uzlaşma olarak seçilir. Daldırma yağ amaç X 63 kullandığımız (NA 1,25 =) faz kontrast halkalar ile donatılmıştır.</li>
	<li>Mikroskopi alanını seçin ve çekim hızı da dahil olmak üzere ve gerekirse Fluo-4 floresan sinyal en iyi duruma getirmek binning edinme parametreleri, ayarlayın. Not: Yerel Ca2 + görüntüleme önemli sorunlar vardır düşük genlik ve yanıtları, küçük süresi satın alma 30 en az her Bayan gerektiren çeşitli ticari olarak mevcut arka ışıklı EM-CCD veya C-ecek kamera gerekli sunmak duyarlılık Fluo-4 kullanarak yerel Ca2 + yanıt bulmak için. Algılama hassasiyeti de duyarlilik veya spontan yanıt-e doğru bir yüksek frekansta Fluo-4 uyarma floresan bağlantılı gibi eserler sınırlamak için önemli bir konudur. Burada, bir LED tabanlı aydınlatma 470, nm, 480 ± 40 nm bant geçiren uyarma filtre, 505-nm dikroik filtre ve 527 ± 30 nm bant geçiren emisyon %5 maksimum şiddeti 1.0 nötr yoğunluk filtresi ile kombine olarak kullanılan bu sorunları en aza indirmek için kullanılmıştır sınırlı süreler alınan akış altında. Yerel Ca2 + sinyalleri tarafından toplu işlemleri 120 s akışların analizi düzenli olarak yapılan. Bu düşük aydınlatma koşullar altında fluorophore photobleaching 2 dk-akarsu satın almalar sırasında gözlendi değil. Farklı alanlar kullanılır sağlanan aynı örnek üzerinde art arda gelen alımlar gerçekleştirilebilir. Genel bir kural olarak, ilk satın alma akışı denetim alanı kendiliğinden yanıt yokluğu sağlamak için bakteri stimülasyon yokluğunda gerçekleştirilir. Spontan yanıt gözlenir, kadar hiçbir yanıt gözlenen örnekleri EM arabellek ile yıkanır.</li>
	<li>Bakteri için örnek eklemek için EM arabelleği 500 µL odasından kaldırın ve 1.1.6. adımda seçilen mikroskobu alanı taşımak önlemek için uygun bakım ile 0,05 son OD600nm elde etmek için hazırlanan bakteriyel süspansiyon 500 µL ekleyin; birimleri bakteri ve bakteri hücre örnekleri üzerine homojen dağılımı uygun bir karıştırma sağlamak.</li>
	<li>Bakteriyel eklenmesi üzerine bir satın alma gerçekleştirmek. Alternatif olarak, bir satın alma 10 dk bakteri hücreleri kullanılan koşullar altında üzerine tortu için gereken süre için karşılık gelen bakteriyel yanı sıra aşağıdaki gerçekleştirin. Satın alma akışı sonunda bakteri hücreleri ve bakteri istilası siteleriyle ilişkili membran katlar başvurarak görselleştirmek için seçili alanın bir faz kontrast görüntü elde etmek.</li>
	<li>Resim satın almalar, dosyaları tasarruf ve seçimi yeni alanın tüm süreç kapsayacak şekilde süresi için mükellef bulunmaktadır aralıklarla adım 2.5, olduğu gibi satın alma yordamı yineleyin. Not: Shigellaiçin satın alma her 5 dk 20 dk, akarsu işgali olaylar çoğunluğu kapsayacak şekilde izin 10 dk bakteriyel sedimantasyon takip bulduk.</li>
	<li>Satın alma yordamı sonunda 2 µM örneklerin Ca2 + sinyalleri maksimal genliği belirlemek için Ca2 + ionophore ionomycin son bir konsantrasyon ekleyin. Görüntüleri genellikle az 10 dk için sinyal istikrar kadar her 3-5 s.</li>
	<li>Floresans sinyali yokluğunda, Ca2 +belirlemek için 10 mM son bir konsantrasyon, CA2 + şelatör EGTA ekleyerek izleyin. Görüntüleri genellikle az 10 dk için sinyal istikrar kadar her 3-5 s. Not: genel Ca2 + varyasyonları nispeten yavaş dinamikleri nedeniyle, bırakmak için aynı mikroskobik alanda birbirini izleyen tedaviler sırasında Imaging Ca2 + her 3-5 s (akış Mod'da değil), bu satın alma gerçekleştirmek.</li>
</ol>3. analiz
<ol><li>Sitozolik Ca2 + varyasyonları zamanla ΔF/F burada ΔF faiz (ROI) bölgenin ortalama floresans yoğunluğunu çeşitlemeyi gösterir0ve F0 yüzdesi olarak aynı yatırım getirisi, hangi temel floresans hızlı bir hücreleri yoksun alanının ilgili olmayan bölgenin çıkarılır.<ol>
<li>Bazal floresans düzeyleri her hücre için taban çizgisi düzeylerine karşılık gelen farklı alanlardaki kaldırmak; Bu düzeyleri belirsizliğe yer bırakmadan nedeniyle düşük frekans belirlenebilir ve nispeten yerel Ca2 + yanıtlarında verilen akım alma süresi kısa. Not: okudu patojenik modeli ve sorulan sorular ile ilgili yanıt çarpıcı özellikleri ölçmek. Klasik, çeşitli parametreler frekans yerel veya genel Ca2 + yanıt, yanı sıra süresi, genlik ve bu tepkilerin frekans gösteren hücre de dahil olmak üzere Ca2 + sinyalleri, analiz etmek için dikkate alınır. Shigella ve yerel yanıt durumunda, analiz bir başka önemli yönü kayma yanıtları bakteri istilası siteleri ile birliğidir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Genel veya yerel yanıt gösterilen duyarlı hücre yüzdesi ölçmek için ROIs hücrelerde, zaman serileri Fluo-4 yoğunlukta varyasyonlar için karşılık gelen çizmek.<ol>
<li>Bir yanlış pozitif Puanlama önlemek için yerel Ca2 + yanıt, ortalama floresans yoğunluğu hücre temel üç kat yukarıda arka plan varyasyonları veya bir süre en az 200 ms, bir genliği gibi tanımlamak için sıkı parametrelerini ayarlamak. Not: genel bir kural olarak, hatta küçük yerel Ca2 + yanıt herhangi bir arka plan gürültü--dan onların profili tarafından ayrılır. ROIs bulunduğunuz yere tespiti için izin vermek için yeterli floresan sinyallerini entegre için yeterli büyüklükte olması. Fluo-4 algılama yoğunluğuna bağlı olarak, bu ROIs daireler için 2-5 mM arasında değişen fan çapı aynı olmayabilir.</li>
		<li>Ortalama Fluo-4 floresan yoğunluğu aynı hücre yanıtları yerel veya genel olup olmadığını belirlemek için farklı bir alanda 2 bölgelerde varyasyonları ölçmek. Not: Çok sayıda hücre Analizi görüntüleme yazılımı ortalama floresans yoğunluğu varyasyonları on-line ekran görüntüsünü seçili bölgeler için zaman içinde izin kullanımı tarafından yönetilir. Piyasada bulunan görüntüleme yazılımı böyle bir seçenek var, ama bu da Yatırım getirisi yoğunluğu evrim eklentisi kullanarak Icy freeware kullanarak gerçekleştirilebilir.</li>
		<li>Yerel yanıt gösterilen hücreleri yüzdesini belirleyin. Not: Bu yüzde desteklemek için yeterli sayıda olmalı mikroskobu alan analiz toplam sayısı hesaplanır bir istatistiksel olarak anlamlı bir non-parametrik test kullanarak.</li>
		<li>Yerel yanıt süresini belirlemek. Not: Yerel Ca2 + yanıt-e doğru daha fazla süre aralıkları göre ayırt (Yani, daha az 500 ms, 5 ila 10 s arasında veya yukarıda 10 s) ve onların dernek Shigella işgal siteleri ile.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yanıtları genliği ölçmek. İlk olarak, adım 2.1.7 olduğu gibi kararlı maksimal Ca2 + ve hücre arka plan düzeyleri ayarlama. Bu yana Fluo-4 yük her hücre için farklı olabilir, bu tespitler alanında tek tek hücreler için gerçekleştirin.<ol>
<li>Yanıtları genliği göreceli bir maksimal yanıt yüzdesi olarak hızlı.</li>
		<li>İstatistiksel olası yanıt genliği örnekleri arasındaki farkları çözümlemek için parametrik test ardından bir normallik test kullanarak sınama yapın.</li>
		<li>Karşılık gelen faz kontrast Albümdeki görselleştirildiği bakteriyel kaynaklı membran katlar için onların anılan sıraya göre yerelleştirme tarafından derneğin bakteri istilası siteleri göre bu tepkilerin belirlemek.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Ashida, H., Ogawa, M., Kim, M., Mimuro, H., Sasakawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria+and+host+interactions+in+the+gut+epithelial+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Bacteria and host interactions in the gut epithelial barrier.</a> Nature Chemical Biology. 8 (1), 36-45 (2012).</li>
<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11413485">The versatility and universality of calcium signaling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (1), 11-21 (2000).</li>
<li>Strehler, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+calcium+ATPases%3A+from+generic+Ca%282%2B%29+sump+pumps+to+versatile+systems+for+fine-tuning+cellular+Ca%282%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane calcium ATPases: from generic Ca(2+) sump pumps to versatile systems for fine-tuning cellular Ca(2).</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (1), 26-33 (2015).</li>
<li>Muallem, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+Ca2%2B+signals%3A+a+question+of+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Decoding Ca2+ signals: a question of timing.</a> Journal of Cell Biology. 170 (2), 173-175 (2005).</li>
<li>Uhlen, P., Fritz, N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20494106">Biochemistry of calcium oscillations.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 396 (1), 28-32 (2010).</li>
<li>Carneiro, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+induces+mitochondrial+dysfunction+and+cell+death+in+nonmyleoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Shigella induces mitochondrial dysfunction and cell death in nonmyleoid cells.</a> Cell Host & Microbe. 5 (2), 123-136 (2009).</li>
<li>Horng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+and+mitochondrial+destabilization+in+the+triggering+of+the+NLRP3+inflammasome%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling and mitochondrial destabilization in the triggering of the NLRP3 inflammasome.</a> Trends in Immunology. 35 (6), 253-261 (2014).</li>
<li>Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+type+III+secretion+systems%3A+specialized+nanomachines+for+protein+delivery+into+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial type III secretion systems: specialized nanomachines for protein delivery into target cells.</a> Annual Review of Microbiology. 68, 415-438 (2014).</li>
<li>Ashida, H., Mimuro, H., Sasakawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+manipulates+host+immune+responses+by+delivering+effector+proteins+with+specific+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Shigella manipulates host immune responses by delivering effector proteins with specific roles.</a> Frontiers in Immunology. 6, 219(2015).</li>
<li>Tran Van Nhieu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-based+confinement+of+calcium+responses+during+Shigella+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Actin-based confinement of calcium responses during Shigella invasion.</a> Nature Communications. 4, 1567(2013).</li>
<li>Niebuhr, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+PtdIns%284%2C5%29P%282%29+into+PtdIns%285%29P+by+the+S.+flexneri+effector+IpgD+reorganizes+host+cell+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Conversion of PtdIns(4,5)P(2) into PtdIns(5)P by the S. flexneri effector IpgD reorganizes host cell morphology.</a> The EMBO Journal. 21 (19), 5069-5078 (2002).</li>
<li>Konradt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Shigella+flexneri+type+three+secretion+system+effector+IpgD+inhibits+T+cell+migration+by+manipulating+host+phosphoinositide+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">The Shigella flexneri type three secretion system effector IpgD inhibits T cell migration by manipulating host phosphoinositide metabolism.</a> Cell Host & Microbe. 9 (4), 263-272 (2011).</li>
<li>Friedrich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intriguing+Ca2%2B+requirement+of+calpain+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">The intriguing Ca2+ requirement of calpain activation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 323 (4), 1131-1133 (2004).</li>
<li>Thomas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+fluorescent+Ca2%2B+indicator+properties+and+their+use+in+measuring+elementary+and+global+Ca2%2B+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">A comparison of fluorescent Ca2+ indicator properties and their use in measuring elementary and global Ca2+ signals.</a> Cell Calcium. 28 (4), 213-223 (2000).</li>
<li>Sun, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Shigella+type+III+effector+IpgD+recodes+Ca2%2B+signals+during+invasion+of+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The Shigella type III effector IpgD recodes Ca2+ signals during invasion of epithelial cells.</a> The EMBO Journal. 36 (17), 2567-2580 (2017).</li>
<li>Allaoui, A., Menard, R., Sansonetti, P. J., Parsot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Shigella+flexneri+IpgD+and+IpgF+genes%2C+which+are+located+in+the+proximal+part+of+the+mxi+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Shigella flexneri IpgD and IpgF genes, which are located in the proximal part of the mxi locus.</a> Infection and Immunity. 61 (5), 1707-1714 (1993).</li>
</ol>

Yazarlar bildirmek için bir şey yok.

Bu el yazması Shigellagenişletilmiş kinetik sırasında genel Ca2 + yanıtlarının yanı sıra Shigella Invasion kısa kinetik sırasında yerel Ca2 + sinyalleri izlemeye mühendislik protokolünü açıklar. Aşağıda, bu Ca2 + tespiti en iyi duruma getirmek için ele alınması gereken sorunlar bulunabilir anahtar biyolojik süreçleri ile herhangi bir girişim en aza indirerek sinyalleri.
Kimyasal vs. Ca2 + probları genetik olarak kodlanmış:...

CA2 + hücre iskeleti yeniden yapılanma, inflamatuar yanıt ve hücre ölüm yolu ana bilgisayar-patojen etkileşimleri1' e,2,3ile ilgili de dahil olmak üzere tüm bilinen hücre işlemleri düzenler. Fizyolojik şartlarda bazal sitozolik Ca2 + konsantrasyonları düşük, nM aralığı yüzlerce ama agonist stimülasyon üzerine geçici artar tabi. Bu varyasyonlar kez plazma ve endoplazmik retikulum membranlar eylem pompa ve kanalları yoluyla salınım davranış göstermek. Bu titreşimler desen dönem, süre ve Ca2 + artar genliği ile karakterizedir ve yanına hangi, sırayla, Ca2 + kod4,5 bilinen belirli yanıtlar hücreleri tarafından şifresi çözülür . Sitozolik Ca2 + konsantrasyonu patolojik şartlar altında sürekli bir artış mitokondrial membranlar permeabilization ve pro-apoptotik veya nekrotik faktörler6sürümü ile ilgili hücre ölümüne yol açabilir, 7.
Shigella, bacillary dizanteri hastalığının bir tip III salgı sistemi (T3SS)8,9kullanarak konak hücreleri effectors enjekte edilerek epitel hücreleri'yı işgal etti. Konak hücreleri Shigella işgali T3SS tarafından elde edildi yerel ve genel Ca2 + sinyalleri ile ilişkilidir. Gözenek oluşturan gelince toksinler, konak hücre zarlarında ekler ve T3SS effectors enjeksiyon olasılığı için gereklidir T3SS translocon PLC ve inositol (1, 4, 5) trisphosphate (InsP3) aktivasyonu için sorumlu-bağımlı Ca2 + serbest bırakın. Yerelleştirilmiş PLC stimülasyon ve sitelerde bir atipik uzun ömürlü InsP3 bağımlı Ca2 + Shigella işgali sonucu polimerli aktin birikimi ile birlikte10serbest bırakmak. Tip III efektör IpgD, bir phosphatidyl 4,5 bisphosphate (PIP2) -4-fosfataz, böylece yerel Ca2 + doğumdan katkıda InsP3 oluşturmak PLC için kullanılabilir substrat miktarı kontrol PIP2, yerel miktarını sınırlar Yanıt bakteri istilası siteleri11,12. Bu yerel Ca2 + yanıt-e doğru büyük olasılıkla aktin polimerizasyon Shigella işgal siteleri10katkıda bulunur. Ayrıca Shigellatarafından ancak, elde edildi küresel Ca2 + yanıtları için bakteri istilası işlemi gereksiz ama connexin hemichannels plazma zarı, açılış ve ATP sürümü olarak ekstrasellüler tetikler bir bölme. Yayımlanan ATP bir parakrin şekilde hareket sırayla, Ca2 + salınım yanıt virüslü hücrenin yanındaki hücrelerdeki uyarır. IpgD da düzensiz izole yanıt-e doğru yavaş dynamics ile içine küresel Ca2 + yanıt şekillendirme için sorumludur. Sonunda, uzun süreli bir bakteriyel enfeksiyon IpgD InsP3-aracılı Ca2 + sinyalleri inhibisyonu için yol açar. Ca2 + sinyal ile onun müdahale IpgD bir Ca2 +gecikmeler-bağımlı calpain harekete geçirmek önde gelen odak yapışma yapıları sökme ve erken müfreze ile enfekte hücreleri13.
CA2 + sinyalleri patogenezinde önemli yönlerini söz konusu iken, bir mikroorganizma kullanımı bir dizi klasik agonist çalışmalarda karşılaşılmayan teknik sorunlar yükseltir. Açıklanan protokoller burada sık kullanılan floresan Ca2 + kimyasal gösterge Shigella enfeksiyon sırasında yerel Ca2 + sinyalleri karakterize için tasarlanmış Fluo-4 kullanın. Ca2 + sinyal içinde bakteriyel effectors rolü tanımlamak için gerekli onların kantitatif analiz için uygulanan yordamlar yanı sıra bu sinyalleri tespiti için kritik adımları ele alınmıştır.

<table><tbody><tr><td>Fluo-4</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph versiyon 7.7</td><td>Evrensel Görüntüleme</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CoolLED aydınlatma sistemi pE-2</td><td>Roper Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mikro çanak 35 mm, yüksek&nbsp;</td><td>IBIDI</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>Triptikaz Soya (TCS) suyu</td><td>Thermofisher</td><td></td><td>B11768</td></tr><tr><td>TCS agar</td><td>Thermofisher</td><td></td><td>B11043</td></tr><tr><td>Kongo kırmızısı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>75768</td></tr><tr><td>M90T-AfaE</td><td>Sun ve ark. 2017</td><td>Shigella flexneri serotip V. AfaE adezinini</td><td></td> ifade eder</tr><tr><td>ipgD-AfaE</td><td>Sun ve ark. 2017</td><td>AfaE adezinini eksprese eden izojenik ipgD mutant suşu</td><td></td></tr></tbody></table>

epitel hücrelerinin shigella enfeksiyon sırasında ca2 + yanıtları görüntüleme

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

CA2 + her yerde birden bulunan iyon tüm bilinen hücresel oluşum içinde yer var. Küresel Ca2 + yanıt hücre kaderini etkileyecek iken, bulunduğunuz yere konsantrasyonlarda iç mağazaları veya bir akını plazma zarı kanallardan serbest bırakmak için bağlantılı ücretsiz Ca2 + sitozolik, kortikal hücre işlemleri düzenler. Patojenler uygun ya da ana bilgisayar hücreleri tetikleyici yeniden yapılanma etkileyen büyük olasılıkla Ca sinyal2 + hem küresel hem de yerel ana bilgisayar plazma zarı temel aktin sitoiskeleti istila. Çünkü bu olaylar düşük frekanslarda üzerinde genişletilmiş kinetik sözde Stokastik bir şekilde ortaya çıkabilir, patojenler tarafından indüklenen Ca2 + sinyalleri analiz ele alınması gereken önemli teknik sorunlar yükseltir.
Burada, küresel ve yerel Ca2 + sinyalleri Shigella enfeksiyon epitel hücrelerinin üzerine tespiti için protokolleri raporu. Bu iletişim kuralları, eserler güneşe maruz bağlantılı ve Ca2 + floresan problar uyarma ile ilişkili duyarlilik troubleshot sıkı edinme parametreleri üzerinde tanımlanmış zaman dilimlerinde bir kontrol ederek Shigella işgali. Yordamlar genişletilmiş enfeksiyon kinetik kimyasal sonda Fluo-4 kullanarak sırasında küresel sitozolik Ca2 + sinyallerinin frekans ve genlik titizlikle analiz için uygulanır.

Shigella işgali atipik uzun süreli yerel Ca2 + Yanıt ile ilişkilidir:
Yukarıda belirtilen iletişim kuralı, ardından Fluo 4 yüklü HeLa hücreleri WT Shigella ile meydan ve akarsu satın almalar Ca2 + sinyalleri analiz etmek için yapıldı. Temsil edici bir deney Şekil 1' de, tek bir hücre ve karşılık gelen faz kontrast görüntü (Şekil 1A, ...

Burada, kalsiyum (Ca2 +) yanıt Shigellatarafından enfekte HeLa hücreleri tarafından elde edildi görselleştirmek için protokolleri mevcut. Bakteriyel enfeksiyon parametrelerini optimize ve Ca2 + floresan problar ile görüntüleme, enfeksiyon kinetik büyük bir aralığı içinde bakteriler tarafından indüklenen atipik küresel ve yerel Ca2 + sinyalleri karakterize edilmektedir.

Epitel hücrelerinin Shigella enfeksiyon sırasında CA2 + yanıtları görüntüleme

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ ...

Kimyasal problar kullanılarak yapılan bu floresan mikroskopi analizinin genel amacı, patojenik Shigella enfeksiyonu sırasında konakçı hücreler tarafından ortaya çıkan lokal ve küresel kalsiyum tepkilerini analiz etmektir. Bu yöntem, hücre iskeletinin yeniden düzenlenmesine veya hücre ölümüne yol açan patojen kaynaklı sinyalleme gibi hücresel mikrobiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kimyasal problar kullanılarak, patojen tarafından yönlendirilen yerel süreçlerle ilişkili yerel kalsiyum sinyallerinin takip edilebilmesidir.Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, biyolojik numunelerin bütünlüğünü korurken yerel kalsiyum sinyallerini takip etmeyi sağlayan parametrelerin ayarlanması nedeniyle mücadele edeceklerdir. Başlamak için, %0.01 Kongo kırmızısı içeren bir triptikaz soya veya TCS agar plakası üzerine AfaE yapışmasını ifade eden vahşi tip Shigella'yı plakalayın ve plakaları 37 santigrat derecede 18 saat inkübe edin. Üç kırmızı koloni seçerek ve TCS suyunu mililitre ampisilin başına 75 mikrogram ile aşılayarak çizgili plakalardan ön kültürler hazırlayın.Sıvı kültürleri çalkalanan bir inkübatörde 37 santigrat derece ve 200 rpm'de 16 saat boyunca büyütün. Daha sonra, TCS'yi bakteri ön kültürü ile 1:100 seyreltmede aşılayın. Kültürü 37 santigrat derecede 200 rpm'de çalkalanan bir inkübatörde iki saat boyunca inkübe edin.600 nanometredeki optik yoğunluğun 0,2 ila 0,4 olduğundan emin olun. Kültürü 13.000 g ve 21 santigrat derecede iki dakika santrifüjleyin ve peleti eşdeğer bir hacimde EM ortamında yeniden süspanse edin. Bakteriyel süspansiyonu EM tamponunda 0.1'lik son OD 600'de seyreltin ve hemen kullanın veya 21 santigrat derecede saklayın ve sonraki 60 dakika içinde kullanın.% 10 FCS ile desteklenmiş litre başına bir gram glikoz ile DMEM'de HeLa hücrelerini büyütün ve% 10 CO2 ile kültürü 37 santigrat derecede büyütün. DMEM'de TC7 hücrelerini litre başına 4.5 gram glikoz,% 10 FCS ve% 10 esansiyel olmayan amino asitler ve 37 santigrat derece ve% 10 CO2'de kültür ile büyütün. Hücre bakımı için, birleşik durumlara bağlı büyüme teması inhibisyonunu önlemek için hücreleri düzenli olarak bölün.Bu, yüksek kalsiyum probu yüklemesi ve transfeksiyon verimliliği için kritik öneme sahiptir. TC7 hücrelerini tripsinize edin ve sayın. HeLa hücreleri ile yapılan deneyden bir gün önce, hücreleri steril, 25 milimetre çapında dairesel kapak kayar, altı oyuklu plakalarda üç kez 10 ila beş hücre yoğunluğunda kayar.Daha sonra, deneylerden önce polarizasyona izin vermek için, hücreleri oyuk başına dört kez 10 ila beş hücreye tohumlayın ve ortamı her gün değiştirerek beş ila yedi gün boyunca inkübe edin. Deney gününde, ortamı çıkarın ve hücreleri üç kez yıkamak için bir mililitre EM ortamı kullanın. Hücreleri üç mikromolar Fluo-4 ve EM tamponu ile yükleyin ve plakaları 30 dakika boyunca 21 santigrat derecede inkübe edin.EM tamponu ile, numuneleri üç kez yıkayın, daha sonra bir mililitre EM tamponu ekleyin ve parçasının hidrolizine izin vermek için hücreleri 21 santigrat derecede inkübe edin. Fluo-4 yüklü hücreleri içeren lamel bir görüntüleme veya cam tabanlı odaya yerleştirin. Potansiyel olarak hücre lizizinden kaynaklanan bileşikleri uzaklaştırmak için numuneyi üç kez yıkamak için EM tamponu kullanın.Ardından, bir mililitre EM tamponu ekleyin. Odayı, 33 santigrat derecede ısıtılmış ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu aşamasına yerleştirin. Bir mikroskopi alanı seçin ve Fluo-4 floresan sinyalini optimize etmek için gerekirse maruz kalma süresi ve gruplama dahil olmak üzere toplama parametrelerini ayarlayın.Numuneye bakteri eklemek için, hazneden 500 mikrolitre EM tamponunu dikkatlice çıkarın ve 0.05'lik bir son OD 600 elde etmek için 500 mikrolitre bakteri süspansiyonu ekleyin. Bakterilerin hücrelere tortu bırakmasına izin vermek için hemen bir alım yapın veya 10 dakika bekleyin. Edinme akışının sonunda, hücrelere temas eden bakterileri ve bakteri istila bölgeleriyle ilişkili zar fırfırlarını görselleştirmek için seçilen alanın bir faz kontrast görüntüsünü elde edin.Edinme prosedürünü, görüntü alımlarının süresine, dosya kaydetmeye ve tüm süreci kapsayacak şekilde yeni bir alan seçimine uygun aralıklarla tekrarlayın. Edinme prosedürünün sonunda, kalsiyum sinyallerinin maksimum genliğini belirlemek için numuneye iki mikromolar kalsiyum iyonofor iyonomisin ekleyin. Sinyal stabilize olana kadar her üç ila beş saniyede bir, genellikle 10 dakikadan daha kısa bir süre için görüntü alın.Kalsiyum yokluğunda floresan sinyalini belirlemek için kalsiyum şelatörü EGTA'yı 10 milimolar nihai konsantrasyona ekleyerek takip edin. Sinyal stabilizasyonuna kadar her üç ila beş saniyede bir, genellikle 10 dakikadan daha kısa bir süre için görüntü alın. Metin protokolüne göre görüntü analizi yapın.Bu deneyde, Fluo-4 yüklü HeLa hücreleri, vahşi tip Shigella ile sorgulandı ve kalsiyum sinyallerini analiz etmek için akış edinimleri yapıldı. Fluo-4 probunun floresan yoğunluğunun hızlandırılmış bir görüntü serisi, tek bir hücre için ilgilenilen bir bölgede ortalaması alınır ve karşılık gelen faz kontrast görüntüsü gösterilir. Shigella istila bölgesinde 2.5 ila beş saniye arasında değişen genlik ve sürelerde serbest sitozolik kalsiyumda atipik lokal artışlar gözlenir, bunu enfekte hücrede küresel artışlar izler.Bu örnekte, bir fosfatidil 4, 5-bifosfat fosfataz olan tip III efektör IpgD için eksik olan bir izojenik mutant suş, vahşi tip Shigella suşuna kıyasla uzun sürelerle daha küresel ve daha az atipik lokal tepkilere neden oldu. Bu deneyde görüldüğü gibi, genişletilmiş enfeksiyon kinetiği üzerinden küresel kalsiyum yanıtlarının görüntülenmesi, vahşi tip Shigella ile mücadeleden 30 dakika sonra yanıtların sıklığında bir azalma olduğunu göstermektedir. Son olarak, kalsiyum agonisti histamine doza bağlı hücre tepkilerinin nicelleştirilmesi, bir Shigella enfeksiyonunun geç aşamalarında bir inositol trifosfata bağımlı kalsiyum salınımının inhibisyonunu gösterir.Bu prosedürü takiben, belirli bir proseste kalsiyum sinyallerinin rolünü ele almak için uyumlu sıvıları ve görüntülemeyi birleştiren tüm yöntemler aynı anda gerçekleştirilebilir. Patojenlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken atık bertarafı, kontamine yüzeylerin veya ekipmanların temizlenmesi gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

imaging-ca2-responses-during-shigella-infection-of-epithelial-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kaynak: Vonaesch, P. ve ark., Memeli Hücrelerinin Bakteriyel Meydan Okumasından Sonra Stres Gralüleri Oluşumunun İmmünofloresan Analizi. J. Vis. Exp. (2017)Bu video, epitel hücrelerinin patojenik bakteri Shigella flexneri ile enfekte edilmesini ve bunun sonucunda oluşan konak hücresel yanıtını göstermektedir. Bakteriyel efektör proteinler, konak translasyonunu bozarak stres granülleri adı verilen zarsız organellerin oluşumunu tetikler; bu organeller hücrenin enfeksiyona adaptif yanıtını...

Kanserli epitel hücrelerinin Shigella enfeksiyonu sırasında stres granülleri oluşumu

Source: Poore, K., et al. Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella. J. Vis. Exp. (2024)This video demonstrates an in vitro assay to assess Shigella invasion and intracellular replication in human colonic epithelial monolayers. It highlights steps for infection, antibiotic selection, host cell lysis, and recovery of intracellular bacteria for downstream analysis.

Intracellular Replication Assay for Shigella in Human Colonic Epithelial Cells

Bu video, insan epitel hücrelerinin Shigella enfeksiyonu üzerine lokal ve küresel kalsiyum iyonu tepkisini tespit etmek için bir tekniği göstermektedir. Shigella, konakçı hücreleri istila eder ve hücre içi kalsiyum seviyelerini etkileyen istila efektörlerini serbest bırakır. Lokal ve global sitozolik kalsiyumun genliği ve frekansı bir floresan indikatör kullanılarak incelenir.

Bakterilerle enfekte olmuş hücrelerde kalsiyum tepkisini incelemek için bir görüntüleme tekniği

Biz endomembran kopma izleme için bir yöntem açıklanmaktadır, hücre içi bakteri tarafından ortaya...

Vakuolar Kopma Tek Hücre ölçümleri Hücre içi patojenlerin neden

Patojen yayılmasını karşı koymak için, konakçı hücreler bakteriler ve bölümlere Otofaji uyarabilme iskeletinin yeniden. Doku kültürü hücreleri, ev sahibi ve bu işlem altında patojen belirleyicileri kullanılarak Shigella enfeksiyonu tespit ve karakterize edilir. Shigella enfeksiyonu Zebra balığı modellerini kullanarak, keşfedilen moleküllerin ve mekanizmaların rolü in vivo incelenmiştir.

Kullanımı<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Otofaji-Sitoiskelet Etkileşimleri Okumak

Mevcut protokol, in vitro epitel hücre dizileri kullanılarak Shigella aderansı, invazyonu ve hücre içi replikasyonunu sorgulamak için enfeksiyon testlerini açıklamaktadır.

Shigella ile Epitel Hücre Enfeksiyonu Analizleri

M Peyer Kullanıcı yamaları içeren özel bir folikül ilişkili epitel hücreleri mukozal immunosurveillance bağırsak ile ilişkili lenfoid doku için önemli bir rol oynamaktadır. Burada bakteriyel transcytosis M hücreleri tarafından açıklanan değerlendirme...

Fare Uygulama M hücreleri tarafından Bakteriyel Alımı değerlendirin Peyer Patch Bağırsak Loop Testi bağlandı

Biz flow sitometrik negatif seçimin birincil fare tip II alveol epitel hücrelerinde (AECII) hızlı izolasyonu tarif. Bu AECII yüksek canlılığı ve saflık göstermektedir ve bu gibi otoimmün veya bulaşıcı hastalıklar gibi solunum koşullar altında rolü ile ilgili işlevsel ve klinik çalışmalar, geniş bir aralığı için uygundur.

Fonksiyonel ve Moleküler Çalışmalar Birincil murin Tip II alveol epitel hücrelerinde akım sitometri İzolasyonu

Murine nazofarenksin Streptococcus pneumoniae ile kolonizasyonu ve daha sonra yapışık veya işe alınan hücrelerin çıkarılması açıklanmaktadır. Bu teknik, nazofarenksin yıkanmasını ve sıvının nares yoluyla toplanmasını içerir ve diferansiyel hücre niceliği ve mRNA ekspresyonunun yerinde analizi dedahil olmak üzere çeşitli okumalar için uyarlanabilir.

Streptococcus pneumoniae ile İntranazal Kolonizasyon Sırasında İnflamatuar Yanıtların Karakterizasyonu

Bu protokol, antijen yoğunluğuna tek bir hücre süspansiyonu santrifüj ve ilgi hücre popülasyonlarının son olarak manyetik ve / veya FACS ayıklama, ardından doku enzimatik sindirimi farklı adımları ile insan timus hücreleri sunan izole etmek için bir yöntem göstermektedir.

İnsan Thymus ile myeloid dendritik hücreleri ve epitel hücreleri İzolasyonu

Öğrenin, Shigella enfeksiyonu sırasında HeLa hücrelerinde lokal ve global kalsiyum yanıtlarını floresan mikroskopi ile görüntüleme yöntemini. Bu teknik, patojen-konak etkileşimlerini incelemek için değerli bir protokol sunar.

Epitel hücrelerinin Shigella enfeksiyon sırasında CA^{2 +} yanıtları görüntüleme

Daha fazla video keşfet