Retina Cryo-kesitler, Bütün bağlar ve mikrovasküler perisitlerden immunohistokimyasal görselleştirme hipotonik izole damarlara hazırlıkları

Bu yöntemler, perisit çoğalması veya göç gibi oftalmoloji alanındaki temel soruların yanıtlatMasına yardımcı olabilir. Bu yordamın en büyük avantajı, çeşitli görselleştirme seçenekleri sağlamalarıdır. Prosedürleri gösteren Karin Dreisig ve Frank W.Blixt, laboratuarımızda iki doktora sonrası olacak.

Gözü enükleye için, ilk fare göz kapağında yaklaşık 0,5 santimetre arka ve ön yarıklar yapmak için bir neşter kullanın. Forceps ile göz kapmak ve çevreleyen doku ortaya çıkarmak için yan dikkatlice eğim. Bağ ve kas dokusunda diseksiyon makasla kesikler yaparak gözü enükleaz.

Kısaca 4% formaldehit ve fosfat tamponlu tuzlu bir ila iki dakika için göz yerleştirin. Neşter ucu ile hafif basınç uygulayarak kornea limbus bir delik yapmadan önce sodyum tampon kısa bir süre durular. Kornea ve lensi forceps ile çıkarmak için diseksiyonu makasla kornea ekstremitesi boyunca kesin.

PBS'de %4 formaldehitte kalan dokuyu retina ile 2-4 saat batırın. Kriyo-% 10 sakaroz ve daha sonra% 25 sakaroz içeren Sorenson fosfat tampon daldırma tarafından doku koruyun. Kabın dibine battıktan sonra dokuyu aktarın.

Yazulla orta domuz derisinden% 3 jelatin ve tavuk yumurta beyazı% 30 albumin ile hazırlanan embed. Sonra, jelatin gömülü retinanın 10 mikronluk dikey kriyokesitlerini optik sinire doğru kesin. Bir cam slayt üzerine kriyokes yerleştirin ve en az bir saat kurumasını bekleyin.

Kurutuldıktan sonra, slaytı PBS'de %0,25 Triton-X 100 ile 15 dakika batırın. Daha sonra, 1:100 PDGF reseptör beta ve PBST 1:500 NG2 primer antikorlar ve kriyokesit üzerine% 1 BSA bir karışımı damla ve dört derece santigrat bir gecede nemli bir odada yer. Ertesi gün, her seferinde 15 dakika boyunca pbst'a iki kez kaydırağı batırarak bölümleri yıkayın.

Sonra 1:100 Anti-Mouse Alexa Fluor 594 bağlı ve 1:100 Anti-Rabbit FITC bağlı ikincil antikorlar kriyozeksiyon üzerine% 3 BSA ile PBST seyreltilmiş ve karanlıkta bir saat kuluçka karışımı damla. Kuluçkadan sonra, PBST'deki cam kaydırağı her seferinde 15 dakika boyunca iki kez durulayın. DAPI ve coverslip içeren solma önleyici montaj ortamı ile lekeli kriyokesitler monte edin.

İkinci bir retina doku hazırlama tekniği tam montaj. Korneanın çıkarılmasından sonra, retinayı retina pigment epitelinden optik sinire doğru ayırmak için çerofmaların küçük açılış hareketlerini kullanın. Diseksiyonu makasları ile optik sinir de retina serbest ve optik sinir kafasına doğru retina periferik birkaç milimetre uzunluğunda üç ila dört kez yapmak.

Retinayı cam bir kaydıranın üzerine yayın ve 5-10 dakika kurumasını bekleyin. Retinaya %4 formaldehit damlatın ve 20-30 dakika düzeltin. Fiksasyondan sonra PBS ile durula.

Optimal sonuçlar için, durulama dan sonra doğrudan immünoleme. İlk olarak, 15 dakika boyunca oda sıcaklığında tüm montaj ve kuluçka üzerine PBST damla. PBST dökün, sonra birincil antikor solüsyonu ekleyin ve bir gecede dört derece santigrat nemli bir odada kuluçka.

Ertesi gün, birincil antikor dökün ve PBST üzerine damla iki kez 15 dakika her zaman retina yıkar. İkinci yıkamadan sonra, ikincil antikor solüsyonu retinaya damlatın ve karanlıkta oda sıcaklığında nemli bir odada bir saat kuluçkaya yatırın. İkincil antikor inkübasyonunu takiben, pbst ile daha önce olduğu gibi iki kez yıkayın.

DAPI ve bir kapak slip içeren anti-solma montaj ortamı ile lekeli tüm montaj monte. Retinanın tam montajAlternatif, retinal vaskülatür hipotonik izolasyon ile izole edilebilir. İlk olarak, retinayı 24 kuyulu bir plakaya bir mililitre deiyonize su koyun ve oda sıcaklığında bir saat boyunca 1,5 milimetrelik titreşim yörüngesi ile 200 rpm sallayın, sonra retinal vaskülatürden lysed hücre enkaz ayrıştırmak ve oda sıcaklığında başka bir 30 dakika sallamak için DNAE 1 200 birim ekleyin.

Nöronal hücre enkazkaldırmak için 150-300 rpm sallayarak beş dakika boyunca üç kez deiyonize suda retina durulayın. Retina her durulama ile daha şeffaf hale gelmelidir, nöronal hücresel enkaz kaldırılması göstergesi. Duruladıktan sonra retinayı %4 paraformaldehit ve PBS mililitresinde oda sıcaklığında 10 dakika boyunca düzeltin.

PBS ile üç kez durulayın. İmmünostaining devam ediyorsanız, 100 rpm sallayarak bir saat pbs seyreltilmiş% 10 eşek serumu% 100 mikrolitre ile hipotonik izole vaskülatür blok. Bloke edildikten sonra retinayı bir gecede 1:100 PDGF-reseptör betası ve 1:500 NG2 primer antikorlardan oluşan 600 mikrolitre primer antikor çözeltisinde kuluçkaya yatırın ve %10 eşek serumu ve PBS ile seyreltilir.

Ertesi gün, her seferinde beş dakika PBS retinaağı üç kez durulayın, sonra 1:100 Anti-Mouse Alexa Fluor 594 bağlı ve 1:100 Anti-Rabbit FITC bağlı ikincil antikorlar kuluçka, 10% eşek serum ve PBS seyreltilmiş 100 rpm oda sıcaklığında bir saat boyunca oda sıcaklığında sallayarak. PBST'de beş dakikalık bir yıkamanın ardından mililitre başına 0,2 nanogram DAPI ve PBST'yi 15 dakika kuluçkaya yatırın. PBST ile ışıktan korunurken beş dakika boyunca üç kez yıkayın.

Sonra, plastik bir Pasteur pipet ucunu kesin. Bir pipet ucu kullanarak keskin kenarları çıkarın ve PBST ile Pasteur pipet nemlendirin, sonra pipet içine retinal vaskülatür aspire ve dört kuyucam oda slayt içine dağıtmak. Nemlendirici adım Pasteur pipet ilerletinin içine yapışan retinal vaskülatür önlemek için önemlidir.

Oda slaytını ileri geri yatırarak retinal vaskülatürü yerleştirin. Hazne deki boşluğun kuyularından ortayı çıkarın. Sıvının yüzey gerilimi, vaskülatürü slaytın altına düzleştirmekolacaktır.

Gerekirse, açılmak için retinal vaskülatür üzerine sıvı damla damla. Plastik kuyuları hazne kaydırağından çıkarmadan önce mikroskop altında doğru açılmayı sağlayın. Lekeli vaskülatürü, solma önleyici montaj ortamı ve bir kapak fişi ile monte edin.

NG2 immünohistokimya retinanın iç kısmında pozitif damarları ortaya çıkarır. Oklar damarlarda dairesel ve at nalı şeklinde immünoreaktivite gösterir. Ok ucu, uzunlamasına kesilmiş bir damarı işaret ediyor.

PDGF-reseptör beta immünohistokimyang2 benzer immünoreaktivite gösterir. Yine oklar ve ok ucu damarlarda immünoreaktivite gösterir. Bu resim, ng2'nin yeşil, PDGF-reseptör betasının kırmızı ve DAPI'nin mavi ile birleştirilmesini göstermektedir.

Üç farklı filtrenin üst üste bindirilerek NG2 ve PDGF-reseptör betasının birlikte lokalize olduğu ortaya çıkar. Bu resim, kırmızı NG2 boyama ile bir immünostained tüm montaj hazırlık gösterir. İmmünreaktivite abluminal perisitlerde yoğun boyama ile yüzeysel vasküler ağ boyunca görülebilir.

Nöronal hücreler NG2 lekeli mikrovaskülatür arasında DAPI mavi çekirdekleri olarak görülebilir. Bu görüntü, yeşil ve PDGF-reseptör beta sında NG2 ile boyanmış hipotonik izole sıçan retinal vasküler ağ kırmızı gösterir. Tüm ağ NG2-immünoreaktivite gösterdi.

Hücre somalarında PDGF-reseptör beta immünoreaktivitesi bulundu. Daha yüksek büyütmede, PDGF-reseptör beta boyamanın sadece vasküler ağdaki hücre somlarında görüldüğü ve perisit immünreaktivitesini gösteren bir durum olduğu açıktır. NG2 ve PDGF-reseptör beta ile birlikte DAPI boyama dahil bu yüksek büyütme görüntü iki tanımlanmamış damar duvar hücrelerinde üç perisit ortaya koymaktadır.

Bu işlemlerden sonra, düz kas hücresi veya endotel lekeleri gibi diğer immünboyamalar ek sorulara cevap vermek için kullanılabilir. Örneğin, retinal vaskülatürdeki hücreler iskemi sonrası nasıl görünür?