Name: Retina Cryo-kesitler, Bütün bağlar ve mikrovasküler perisitlerden immunohistokimyasal görselleştirme hipotonik izole damarlara hazırlıkları (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Öğrenin, fare retinasındaki mikrovasküler perisitleri görselleştirmek için kriyokesit, bütün bağ ve hipotonik izolasyon yöntemlerini. Bu teknikler oftalmolojide perisit davranışlarını incelemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Araştırma Lundbeck Vakfı, Danimarka tarafından finanse edildi.

İletişim kuralı en iyi duruma getirilmiş ve yetişkin erkek albino sıçanlar üzerinde gösterdi. Tüm deneysel yordamlar, hayvan hayvanlar kullanım Ophthalmic ve vizyon araştırma için ARVO deyimi düzenlemeye göre tedavi edildi. Hayvanlar karbon dioksit ve sonraki servikal çıkığı tarafından euthanized.
1. fare Retina doku hazırlıkları
<ol><li>
Cryo-bölüm
	<ol>
<li>Arka ve ön ~0.5 cm yırtmaçlı, sıçan göz kapağı bir neşter ile yapmak.<ol>
<li>İsteğe bağlı: bir Diyatermi yazıcı kullanarak, göz iç açıyla katıştırma sırasında göz düzgün bir şekilde yönlendirmek ve optik sinir dikey cryostat kesit için izin vermek için işaretleyin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Forseps ile göz kapmak ve dikkatle çevreleyen doku ortaya çıkarmak için tarafına tilt. Göz bağ ve kas dokusunda diseksiyon makasla kesim yaparak enucleate. Dikkat: optik sinir üzerinde aşırı baskı Retina dekolmanı neden olabilir gibi göz çok zor çekmeyin.</li>
		<li>Göz kısaca fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) bir bisturi ucu ile hafif basınç uygulayarak kornea limbus ilk bir deliğe yapmadan önce stabilize etmek için % 4 formaldehit sok.</li>
		<li>Mikroskop altında kornea limbus kornea kaldırın ve objektif forseps ile 2-4 h için PBS içinde % 4 formaldehit batış önce kaldırmak diseksiyon makası ile kesin.</li>
		<li>Sırayla Sörensen'ın fosfat tampon % 10 sukroz ve % 25 sükroz ile yıkayın.</li>
		<li>Yazulla orta % 3 jelatin domuz deri ve %30 albümin tavuk yumurta beyaz üzerinden hazırlanan katıştırın. Not: Protokol burada ile doku depolama-20 ° C'de duraklatılmış</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bütün Dağı
	<ol>
<li>Arka ve ön ~0.5 cm yırtmaçlı bir neşter ile sıçan göz kapağı yapmak.</li>
		<li>Forseps ile göz kapmak ve dikkatle çevreleyen doku ortaya çıkarmak için tarafına tilt. Göz bağ ve kas dokusunda diseksiyon makasla kesim yaparak enucleate. Dikkat: optik sinir üzerinde aşırı baskı Retina dekolmanı neden olabilir gibi göz çok zor çekmeyin.</li>
		<li>Göz kısaca bir bisturi ucu ile hafif basınç uygulayarak kornea limbus ilk bir deliğe yapmadan önce stabilize etmek için PBS %4 formaldehit koymak.</li>
		<li>Mikroskop altında kornea limbus kornea kaldırın ve objektif forseps ile kaldırmak diseksiyon makası ile kesin.</li>
		<li>Retina retina pigment epiteli optik siniri doğru gelen büyük yırtılma önlemek için küçük açılış hareketleri kullanarak forseps ile ayırın.</li>
		<li>Optik sinir, retina diseksiyon makası ile ücretsiz ve optik sinir başı doğru Retina çevre üzerinden dört yırtmaçlı bir kaç milimetre uzunluğunda olun.</li>
		<li>Retina bir cam slayt üzerine yayılmış ve 5-10dk için kurutma sağlar.</li>
		<li>%4 formaldehit 20-30 dk içinde formaldehit retina üzerine damlama tarafından tamir. Dikkat: camı ayırarak gibi retina üzerinde doğrudan geçerli değildir.</li>
		<li>Durulama PBS ile. En iyi sonuçlar için doğrudan sonra durulama IMMUNO-leke.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hipotonik yalıtım
	<ol>
<li>Arka ve ön ~0.5 cm yırtmaçlı bir neşter ile sıçan göz kapağı yapmak.</li>
		<li>Forseps ile göz kapmak ve dikkatle çevreleyen doku ortaya çıkarmak için tarafına tilt. Göz bağ ve kas dokusunda diseksiyon makasla kesim yaparak enucleate. Dikkat: optik sinir üzerinde aşırı baskı Retina dekolmanı neden olabilir gibi göz çok zor çekmeyin.</li>
		<li>Bir bistüri ucu ile hafif basınç uygulayarak kornea limbus, ilk bir delik açın.</li>
		<li>Mikroskop altında kornea limbus kornea kaldırın ve objektif forseps ile kaldırmak diseksiyon makası ile kesin.</li>
		<li>Retina retina pigment epiteli optik sinir kafa doğru gelen büyük yırtılma önlemek için küçük açılış hareketleri kullanarak forseps ile ayırın.</li>
		<li>Optik sinir, retina diseksiyon makası ile ücretsiz, retina 1 mL deiyonize su bir 24-şey plaka yerleştirin ve oda sıcaklığında 1 h için 1.5 mm titreşim yörünge ile 200 devirde sallamak. Not: Bundan sonra daha az kenarlarında tanımlanan retina görünür.</li>
		<li>Retina Pres'teki lysed hücre enkazı ayırmak ve oda sıcaklığında başka bir 30 dk için sallamak için 200 U DNaz 1 ekleyin. Not: Enkaz forma Wells başlayabilir.</li>
		<li>En az 3 kez nöronal hücre artıkları kaldırmak için 150 – 300 devir / dakikada sallayarak ile 5 min için deiyonize suyla durulayın. Retina ile her durulama nöronal hücresel enkaz kaldırma gösterge daha şeffaf hale gelmelidir.<ol>
<li>Karanlık bir arka plan şeffaf izole Retina damarlara açıkça görmek için 24-şey plaka aramak için kullanın.</li>
			<li>(İsteğe bağlı): damarlara bu noktada daha fazla durulama adımları ekleyebilirsiniz nöronal katmanları (yarı saydam) ücretsiz görünmüyorsa, sallama hızını artırmak veya bir damlalıklı damarlara üzerine sıvı Aspire için kullanın. Dikkat: İsteğe bağlı adımlardan birini damarlara zarar verebilir.</li>
		</ol>
</li>
		<li>10 dk içinde PBS oda sıcaklığında %4 paraformaldehyde ve durulama 3 kez PBS 1 mL fix. Not: Protokol burada ile doku depolama 4 ° C'de duraklatılmış</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. immünhistokimya
<ol><li>
Cryo-bölümlerini boyama
	<ol>
<li>10 µm cryo-bölümlerini dikey optik sinir kesit olarak jelatin gömülü retina keser ve cryo-bölümleri bir cam slayt ve izin kuru (en az 1 h) yerleştirir.</li>
		<li>PBS içinde cam kaymak ile % 0.25 daldırın Triton X-100 (PBS-T) 15 dakika.</li>
		<li>1: 100 PDGFRβ ve 1:500 NG2 birincil antikorlar seyreltilmiş PBS-T + %1 BSA cryo-bölüme damla ve kuluçka odalarında 4 ° C'de gecede kuluçkaya.</li>
		<li>Cam slayt 2 kez PBS-T 15 dakika içinde daldırın ve PBS-t % 3 BSA cryo-bölümler üzerine ile seyreltilmiş 1: 100 anti-fare Alexa Fluor 594 bağlantılı ve 1: 100 anti-tavşan FITC bağlı ikincil antikorları damla.</li>
		<li>Cam slayt karanlık oda sıcaklığında 1 h kuluçkaya.</li>
		<li>Cam slayt PBS-T 2 x 15 dakika yıkayın. Not: İsteğe bağlı: çift ve üç kişilik immünfloresan boyama için sıralı boyama 2.1.3 yordamına 2.1.6 iki ya da üç kez, sırasıyla yineleyerek gerçekleştirilebilir.</li>
		<li>Lekeli cryo-bölümleri montaj orta içeren DAPI ve bir coverslip Anti-solma ile bağlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bütün-mount boyama
	<ol>
<li>PBS-T bütün Dağı damla ve 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
		<li>Ve 1: 100 PDGFRβ ve 1:500 NG2 birincil antikorlar seyreltilmiş PBS-T + %1 BSA damla ve gecede 4 ° C'de nemli odalarında kuluçkaya kapalı dökün.</li>
		<li>Kapalı dökün ve cam slayt 2 x 15 dk içinde durulama için PBS-t damla.</li>
		<li>PBS-t 1s içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında nemli bir odasında kuluçkaya için % 3 BSA ile seyreltilmiş 1: 100 anti-tavşan Cy2 ve 1: 100 anti-fare Cy3 bağlı ikincil antikor üzerinde damla ve kapalı dökün.</li>
		<li>2 x 15 dk içinde belgili tanımlık karanlık durulama için PBS-t damla ve kapalı dökün. Not: İsteğe bağlı: çift ve üç kişilik immünfloresan boyama için sıralı boyama 2.2.2 yordamdan 2.2.5 için iki ya da üç kez, sırasıyla yineleyerek gerçekleştirilebilir.</li>
		<li>Lekeli bütün montaj montaj orta içeren DAPI ve bir coverslip Anti-solma ile bağlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hipotonik izole damarlara boyama
	<ol>
<li>Hipotonik izole damarlara 100 rpm ve oda sıcaklığında 500 µL/iyi % 10 eşek serum PBS içinde seyreltilmiş sallayarak ile 1 h blok.</li>
		<li>Gecede oda sıcaklığında kuluçkaya ve 600 µL/kuyu 1: 100 PDGFRβ ve 1:500 NG2 birincil antikorlar PBS % 10 eşek serumda seyreltilmiş ile 100 RPM sallamak.</li>
		<li>Retina PBS 3 x 5 min için ağ ve 100 rpm ve oda sıcaklığında karanlık 1 h için PBS sallayarak içinde % 10 eşek serumda seyreltilmiş 1: 100 anti-fare Alexa Fluor 594 bağlantılı ve 1: 100 anti-tavşan FITC bağlı ikincil antikorları kuluçkaya durulama.</li>
		<li>PBS-T 5 min için durulama ve 0.2 ng/ml DAPI PBS-t PBS-t 3 x 5 dk durular karanlıkta ardından 15dk için kuluçkaya.</li>
		<li>Bir plastik Pasteur damlalıklı ucu kesilmiş, PBS-T ile nemlendirin ve Retina ağ 4-şey cam odası slayda aktarmak için kullanabilirsiniz. Not: Nemlendirme adım Retina damarlara Pasteur damlalıklı içeriye doğru yapışmasını önlemek önemlidir.</li>
		<li>Retina damarlara açılmak. Bu arapsaçı damarlara neden olabilir gibi Retina damarlara pens ile dokunmaktan kaçının. Not: Unfolding odası slayt ileri geri eğerek yapılabilir veya sıvı Retina damarlara üzerine alıyorum keser.</li>
		<li>Orta kuyulardan kaldırın. Yüzey gerilimi sıvı slayt alt üzerine damarlara dümdüz.</li>
		<li>Plastik kaldırma kuyuları odası slayttan önce mikroskop altında doğru elinde tutmasına emin olun.</li>
		<li>Anti-solma montaj orta ve bir coverslip ile lekeli damarlara bağlayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Eshaq, R. S., Aldalati, A. M. Z., Alexander, J. S., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+retinopathy%3A+Breaking+the+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Pathophysiology%22%5BJournal%5D)">Diabetic retinopathy: Breaking the barrier.</a> Pathophysiology. , (2017).</li>
<li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+in+Brain+Injury+and+Repair+After+Ischemic+Stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Stroke+Research%22%5BJournal%5D)">Pericytes in Brain Injury and Repair After Ischemic Stroke.</a> Translational Stroke Research. , (2016).</li>
<li>Trost, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+and+Retinal+Pericytes%3A+Origin%2C+Function+and+Role%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Brain and Retinal Pericytes: Origin, Function and Role.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 20(2016).</li>
<li>Ramos, D., et al. The Use of Confocal Laser Microscopy to Analyze Mouse Retinal Blood Vessels. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRamos%2C+D+%22Confocal+Laser+Microscopy+-+Principles+and+Applications+in+Medicine%2C+Biology%2C+and+the+Food+Sciences%22">Confocal Laser Microscopy - Principles and Applications in Medicine, Biology, and the Food Sciences</a>. Lagali, N. , InTech. (2013).</li>
<li>Moran, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurovascular+cross+talk+in+diabetic+retinopathy%3A+Pathophysiological+roles+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Heart+and+Circulatory+Physiolog%22%5BJournal%5D)">Neurovascular cross talk in diabetic retinopathy: Pathophysiological roles and therapeutic implications.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiolog. 311, H738-H749 (2016).</li>
<li>Henkind, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/5357346">Microcirculation of the peripapillary retina.</a> Transactions - American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 73, 890-897 (1969).</li>
<li>Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O'Farrell, F. M., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+a+pericyte%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">What is a pericyte?</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36, 451-455 (2016).</li>
<li>Fernandez-Bueno, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histologic+Characterization+of+Retina+Neuroglia+Modifications+in+Diabetic+Zucker+Diabetic+Fatty+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Histologic Characterization of Retina Neuroglia Modifications in Diabetic Zucker Diabetic Fatty Rats.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58, 4925-4933 (2017).</li>
<li>Yu, D. -Y., Yu, P. K., Cringle, S. J., Kang, M. H., Su, E. -N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+morphological+characteristics+of+the+retinal+and+choroidal+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Functional and morphological characteristics of the retinal and choroidal vasculature.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 40, 53-93 (2014).</li>
<li>Allen, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severity+of+middle+cerebral+artery+occlusion+determines+retinal+deficits+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Severity of middle cerebral artery occlusion determines retinal deficits in rats.</a> Experimental Neurology. 254, 206-215 (2014).</li>
<li>Kyhn, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+retinal+ischemia+caused+by+controlled+low+ocular+perfusion+pressure+in+a+porcine+model.+Electrophysiological+and+histological+characterisation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Acute retinal ischemia caused by controlled low ocular perfusion pressure in a porcine model. Electrophysiological and histological characterisation.</a> Experimental Eye Research. 88, 1100-1106 (2009).</li>
<li>Blixt, F. W., Radziwon-Balicka, A., Edvinsson, L., Warfvinge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+CGRP+and+its+receptor+components+CLR+and+RAMP1+in+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Distribution of CGRP and its receptor components CLR and RAMP1 in the rat retina.</a> Experimental Eye Research. 161, 124-131 (2017).</li>
<li>Sarlos, S., Wilkinson-Berka, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+renin-angiotensin+system+and+the+developing+retinal+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The renin-angiotensin system and the developing retinal vasculature.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46, 1069-1077 (2005).</li>
<li>Wittig, D., Jaszai, J., Corbeil, D., Funk, R. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+localization+and+characterization+of+putative+mesenchymal+stem+cell+markers+in+the+retinal+capillary+network+of+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical localization and characterization of putative mesenchymal stem cell markers in the retinal capillary network of rodents.</a> Cells Tissues Organs. 197, 344-359 (2013).</li>
<li>Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+immunofluorescent+staining+of+the+neonatal+mouse+retina+to+investigate+angiogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50546(2013).</li>
<li>Park, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastic+roles+of+pericytes+in+the+blood-retinal+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Plastic roles of pericytes in the blood-retinal barrier.</a> Nature Communications. 8, 15296(2017).</li>
<li>Hughes, S., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+smooth+muscle+cell+and+pericyte+differentiation+in+the+rat+retina+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 2795-2806 (2004).</li>
<li>Lange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravitreal+injection+of+the+heparin+analog+5-amino-2-naphthalenesulfonate+reduces+retinal+neovascularization+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Intravitreal injection of the heparin analog 5-amino-2-naphthalenesulfonate reduces retinal neovascularization in mice.</a> Experimental Eye Research. 85, 323-327 (2007).</li>
<li>Higgins, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diltiazem+reduces+retinal+neovascularization+in+a+mouse+model+of+oxygen+induced+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Diltiazem reduces retinal neovascularization in a mouse model of oxygen induced retinopathy.</a> Current Eye Research. 18, 20-27 (1999).</li>
<li>Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin+digest+protocol+to+analyze+the+retinal+vasculature+of+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50489(2013).</li>
<li>Hazra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+X+receptor+modulates+diabetic+retinopathy+outcome+in+a+mouse+model+of+streptozotocin-induced+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Liver X receptor modulates diabetic retinopathy outcome in a mouse model of streptozotocin-induced diabetes.</a> Diabetes. 61, 3270-3279 (2012).</li>
<li>Zhang, L., Xia, H., Han, Q., Chen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+antioxidant+gene+therapy+on+the+development+of+diabetic+retinopathy+and+the+metabolic+memory+phenomenon%5BTitle%5D)+AND+%22Graefe%27s+Archive+for+Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Effects of antioxidant gene therapy on the development of diabetic retinopathy and the metabolic memory phenomenon.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253, 249-259 (2015).</li>
<li>Dagher, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+rat+and+human+retinas+predict+a+role+for+the+polyol+pathway+in+human+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy.</a> Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).</li>
<li>Navaratna, D., McGuire, P. G., Menicucci, G., Das, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+degradation+of+VE-cadherin+alters+the+blood-retinal+barrier+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Proteolytic degradation of VE-cadherin alters the blood-retinal barrier in diabetes.</a> Diabetes. 56, 2380-2387 (2007).</li>
<li>Gustavsson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+cellular+adhesion+molecule-1+%28VCAM-1%29+expression+in+mice+retinal+vessels+is+affected+by+both+hyperglycemia+and+hyperlipidemia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Vascular cellular adhesion molecule-1 (VCAM-1) expression in mice retinal vessels is affected by both hyperglycemia and hyperlipidemia.</a> PLoS One. 5, e12699(2010).</li>
<li>Kornfield, T. E., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+blood+flow+in+the+retinal+trilaminar+vascular+network%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regulation of blood flow in the retinal trilaminar vascular network.</a> Journal of Neuroscience. 34, 11504-11513 (2014).</li>
<li>Puro, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinovascular+physiology+and+pathophysiology%3A+new+experimental+approach%2Fnew+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31, 258-270 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Biz mikrovasküler Retina perisitlerden çalışmada uygulanan üç Retina hazırlama teknikleri mevcut. Aşağıda, yöntemlerinden her birinin arasında bir karşılaştırma sağlamak ve protokolleri kritik adımlar vurgulayın.
Cryo kesit ile retina sagittal bölümlerde kesilir ve bu nedenle, çok sayıda numune aynı retina elde etmek mümkün. Bu yöntemin sonucu sayısal bölümlerde antikor özgüllük ve gereksiz hayvan kurban engeller olarak titrasyon testi için ideal bir seçim yapmak. Hazırlık çalışmaları için iyi...

Bu hücreler damarlara bütünlük içinde önemli bir rol oynamak gibi Retina perisitlerden birçok araştırma laboratuvarları odaklanmıştır. Diyabetik retinopati1, iskemi2ve glokom3 gibi patolojik durumların perisitlerden fonksiyonu içeren vasküler özellikleri vardır. Perisitlerden iç retinal kapiller plexuses bulunur. Kapiller plexuses iki kat iç retina malzemeleri santral retinal arter dalları. İç vasküler yatağın ganglion hücre ve iç nükleer katmanları arasında yer almaktadır. Daha derin tabaka daha yoğun ve karmaşık ve iç ve dış nükleer katmanlar4,5arasında yerelleştirilmiştir. Buna ek olarak, retinanın bazı bölümlerinin de radyal parapapillary kılcal olarak adlandırdığı bir üçüncü ağ içerir. Bunlar uzun, düz kılcal damarlar, sinir lifleri arasında ve nadiren başka bir veya diğer iki plexuses6ile anastomose. Kapiller duvarı içinde perisitlerden membran içinde gömülü ve vasküler endotel hücrelerinin abluminal yan hat.
Bu tarihe kadar bunları diğer vasküler hücrelerden ayırt bu perisitlerden hiçbir benzersiz biyolojik işaret vardır. Trombosit-türevi büyüme faktörü reseptör β (PDGFRβ) ve sinir/gliyal antijen 2 (NG2) yaygın olarak kullanılan işaretleri olan perisitlerden ama aynı zamanda diğer damar hücreleri üzerinde mevcut vardır. Perisitlerden tanımlaması daha fazla Morfoloji ve protein ifade7' farklılık pericyte alt kümeleri varlığını tarafından karmaşıktır. Şu anda, en iyi kimlik protein işaretleri bir arada ve damar duvarındaki pericyte karakteristik konumlandırma yararlanır. Biz burada sıçan retina mikrovasküler perisitlerden, yani, cryo-bölümler, Bütün bağlar ve damar ağının hipotonik yalıtım PDGFRβ/NG2 immunohistokimyasal boyama için üç farklı doku hazırlama teknikleri göstermek.
Cryo-bölümleri ile retina ve sklera ile optik sinir kesilir. Bu nöronların tüm katmanlı yapılar görselleştirme için sağlar. Retina farklı on kat hematoksilen eozin veya floresan nükleer 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)8gibi lekeleri ile görüntülenmiştir nükleer ve aksonal/dendritik yapıları değişiminin olarak görünür. Katmanlar9 ve bu metabolik gereksinimleri farklıdır belirli bir katmanı kalınlığı veya toplam yokluğunda belirlemek için bir yöntem sağlar (Örneğin, Retina ganglion hücrelerinin kaybı biridir retinal iskemi10, işaretlerinden 11). Ayrı ayrı çalışma içinde anılan sıraya göre Retina katmanları12,13kapiller plexuses edinerek retina ile enine keser gibi damarlara belirgindir.
Daha geleneksel olarak, Retina damarlara ağ araştırmalar Retina bütün-dağ içinde gerçekleştirilir. Bu doku hazırlık ile retina kesme ve bir çiçek şeklindeki yapı olarak basık. Genel mimari Retina damarlara vurgulayabilirsiniz nispeten hızlı doku Hazırlama tekniği yöntemidir ve bu nedenle kez fare retina neovaskülarizasyon soruşturma uygulanır. Bütün Monte Retina microvasculature başarılı görselleştirme aynı zamanda gelişmekte olan yenidoğan fare ve sıçan retina14,15,16,17,18, bildirilmektedir 19. bu çalışmalar geniş kılcal içermeyen alanlar yenidoğan retina14' e göre yetişkin bir daha tanımlı pericytic aktivitesiyle ortaya koyuyor.
Görselleştirmenin başka bir retina microvasculature sonra hipotonik yalıtım yoludur. Bu doku hazırlama teknik retinal kan damarları ve kılcal nöronal hücrelerin serbest bırakılması ile sonuçlanır. İki boyutlu görüntüleme izole retinal damar ağının bu tür genellikle Retina tripsin sindirim20 sonra gerçekleştirilen ve diyabetik retinopati dahil pericyte kaybı ve kılcal damar anormallikleri değerlendirmek için kullanılan dejenerasyon20,21,22. Onlar yapılmıştır gibi RT-PCR ve western Blot23,24,25ile hipotonik yalıtım yöntemini retinal vasküler gen ve protein düzenleyici yanıt araştırmalar sunuyor. Burada ücretsiz-float immunohistokimyasal hipotonik izole Retina damarlara tripsin sindirim mikrovasküler perisitlerden incelemek için bir alternatif olarak boyama için bir protokol sağlar.

<table><tbody><tr><td>Domuz derisinden elde edilen jeletin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2625-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tavuk yumurtası beyazından elde edilen albümin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5253-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sığır pankreasından Deoksiribonükleaz (DNAse) I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-15KU</td><td>0.15 M NaCl içinde çözülmüş</td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA)</td> <td>VWR</td><td>0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>Normal eşek serumu</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121, lot 129348</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan anti-PDGFR ve beta;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-432</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Fare anti-NG2</td><td>Abcam</td><td>ab50009</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 AffiniPure Eşek Anti-Tavşan IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-585-152</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Floresan (FITC) AffiniPure Donkey Anti-Fare IgG (H + L)</td> <td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-095-151</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Cy2 AffiniPure Eşek Anti-Tavşan IgG (H + L)</td> <td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-225-152</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Fare IgG (H + L)</td> <td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-165-150</td><td>1:100</td></tr><tr><td>4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-1MG</td><td>DMSO'da Çözünmüş</td></tr><tr><td>Solma önleyici montaj ortamı</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI Vektörlü solma önleyici montaj ortamı</td><td> Laboratuvarlar</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II 4 kuyulu odacıklı slayt</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>154526</td><td></td></tr></tbody></table>

retina cryo-kesitler, bütün bağlar ve mikrovasküler perisitlerden immunohistokimyasal görselleştirme hipotonik izole damarlara hazırlıkları

Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes

Retina perisitlerden, göz birçok hastalıkları için önemli bir rol oynamaktadır. İmmunohistokimyasal teknikler retina damarları ve mikrovasküler boyama perisitlerden Oftamolojik araştırma merkezi. Mikrovasküler perisitlerden görüntülenmesi uygun bir yöntem seçmek çok önemlidir. Cryo-bölümlerde, Bütün bağlar ve antikorlar trombosit-türevi büyüme faktörü reseptör β (PDGFRβ) ve sinir/gliyal antijen 2 (NG2) için kullanma hipotonik izole damarlara boyama Retina mikrovasküler pericyte immunohistokimyasal açıklar. Bu avantajları ve her Retina mikrovasküler perisitlerden görselleştirme üç doku hazırlıkları eksikliklerin vurgulamak için bize izin verir. Cryo-bölümler tüm Retina katmanları transsectional görselleştirme sağlar ancak yalnızca bir kaç ara sıra enine keser microvasculature içerir. Bütün Dağı tüm Retina damarlara genel bir bakış sağlar, ancak microvasculature görselleştirme zahmetli olabilir. Hipotonik yalıtım nöronal hücre kaldırma tarafından tüm Retina damarlara görselleştirmek için bir yöntem sağlar, ancak bu doku çok kırılgan yapar.

Başarılı iletişim kuralları mikrovasküler perisitlerden görüntülenmesi için üç farklı Retina hazırlıklar sağlar. Bu yöntemlerin her biri PDGFRβ ve NG2 immunoreactivity Co yerelleştirme ve kapiller endotel foridentification sarın perisitlerden benzersiz konumunu kullanır.
Cryo-kesitler, nöronal katmanları DAPI etiketli çekirdeği ve iç floresan yoğunluğu tarafından belirlenebilir ve derin kapiller plexuses PDGFRβ ve NG2 immunoreac...

Biz üç farklı doku hazırlama teknikleri immunohistokimyasal görselleştirme sıçan retina mikrovasküler perisitlerden, Yani, soğutucu bölümü, Bütün bağlar ve damar ağının hipotonik yalıtım için göstermek.

Retina Cryo-kesitler, Bütün bağlar ve mikrovasküler perisitlerden immunohistokimyasal görselleştirme hipotonik izole damarlara hazırlıkları

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular ...

Bu yöntemler, perisit çoğalması veya göç gibi oftalmoloji alanındaki temel soruların yanıtlatMasına yardımcı olabilir. Bu yordamın en büyük avantajı, çeşitli görselleştirme seçenekleri sağlamalarıdır. Prosedürleri gösteren Karin Dreisig ve Frank W.Blixt, laboratuarımızda iki doktora sonrası olacak.Gözü enükleye için, ilk fare göz kapağında yaklaşık 0,5 santimetre arka ve ön yarıklar yapmak için bir neşter kullanın. Forceps ile göz kapmak ve çevreleyen doku ortaya çıkarmak için yan dikkatlice eğim. Bağ ve kas dokusunda diseksiyon makasla kesikler yaparak gözü enükleaz.Kısaca 4% formaldehit ve fosfat tamponlu tuzlu bir ila iki dakika için göz yerleştirin. Neşter ucu ile hafif basınç uygulayarak kornea limbus bir delik yapmadan önce sodyum tampon kısa bir süre durular. Kornea ve lensi forceps ile çıkarmak için diseksiyonu makasla kornea ekstremitesi boyunca kesin.PBS'de %4 formaldehitte kalan dokuyu retina ile 2-4 saat batırın. Kriyo-% 10 sakaroz ve daha sonra% 25 sakaroz içeren Sorenson fosfat tampon daldırma tarafından doku koruyun. Kabın dibine battıktan sonra dokuyu aktarın.Yazulla orta domuz derisinden% 3 jelatin ve tavuk yumurta beyazı% 30 albumin ile hazırlanan embed. Sonra, je

retinal-cryo-sections-whole-mounts-hypotonic-isolated-vasculature

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu makale, embriyonik deri ve timüs kan damarlarının etiketlenmesine yönelik bir yöntem açıklanmaktadır.

Embriyonik Farelerde damarları Etiketleme Bir Yöntem

Kaynak: Vacca, O., et al. Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease. J. Vis. Exp. (2015)Bu video, bozulmuş retinal bariyerler boyunca adeno-ilişkili virüs geçirgenliğini görselleştirmek için fare retinal kriyokesitlerinin hazırlanmasına yönelik adım adım prosedürü göstermektedir.

Adeno-ilişkili Virüsün Retinal Geçirgenliğinin Değerlendirilmesi için Fare Retinal Kriyokesitlerinin Hazırlanması

Yenidoğan fare retina bir anjiyogenez modüle farklı genler ya da uyuşturucu rolleri soruşturma izin anjiyogenez bir iyi karakterize fizyolojik modeli...

Anjiyogenez Araştırma Yenidoğan Fare Retina Tüm Dağı Immunofluorescent Boyama<em&gt; In vivo</em

Burada açıklanan protokol, tam montajlı bir retinal preparatın yapısal değerlendirmesi içindir. Bu, doku diseksiyonunun tanımlarını, hidrofilize politetrafloroetilen (PTFE) membran ekine montajı, floresan işaretleyicilerle bolus yüklemesini ve hücresel ve sinaptik bileşenlerin immünohistokimyasal analizi için karbodiimid ve paraformaldehit ile fiksasyonun karşılaştırılmasını içerir.

Görüntüleme ve İmmünhistokimyanın için Retina Wholemount Hazırlık için optimize edilmiş Protokolü

Bu raporda, immünhistokimya (ıHC) için dondurulmuş fare Retina bölümlerini hazırlamak için kapsamlı yöntemler açıklanmaktadır.  Tanımlanan yöntemlerle oküler posterior bardak diseksiyonu, paraformaldehit fikstasyon, optimum kesme sıcaklığı (OCT) medya ve doku oryantasyonu, seksiyonlama ve immünostasyonu katıştırma bulunmaktadır.

Immünhistokimya için fare retinal Cryo-bölümler hazırlanması

Bu makalede, tüm mount retinal preparatları için iyi kurulmuş ve tekrarlanabilir bir lektin lekesi testi ve proliferatif ve proliferatif olmayan retinopatilerde sıklıkla değiştirilen vasküler parametrelerin nicel ölçümü için gerekli protokoller açıklanmaktadır.

Proliferatif Olmayan ve Proliferatif Retinopatilerle Farelerin Tüm Mount Retinalarında Vasküler Parametrelerin Nicelemesi

Bu protokol, bütün tavşan gözlerinin yüksek kaliteli kriyoseksiyonlarını elde etmek için güvenilir bir yöntemi açıklar. Daha büyük gözlerde immünohistokimya kullanan herhangi bir çalışmada kullanım için kolayca uyarlanabilen tavşan gözü diseksiyonu, fiksasyonu, gömme ve kesit alma prosedürlerini detaylandırır.

Bütün tavşan gözünün yüksek kaliteli kriyoseksiyonlarının elde edilmesi 

Retinal vasküler sistemdeki perisitler, retroorbital floresan domates lektin enjeksiyonu sonrası trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörü β ile immünofloresan boyama ile incelendi. Etiketli retina, doku temizleme yöntemi ile daha fazla tedavi edildi ve retina vaskülatürünü çevreleyen perisitlerin üç boyutlu görünümlerini konfokal mikroskop altında görselleştirmek için tamamen monte edildi.

Farelerde Retinal Vasküler Perisitlerin İmmün Boyama ile 3D Görüntülenmesi 

Fare retinal kriyoseksiyonlarının hazırlanması ve fotoreseptörler üzerinde immün boyama yapılması için bir protokol tanımlanmıştır. Bu makale, araştırmacıların iyi korunmuş morfoloji ve yüksek kaliteli immün boyama sonuçları ile fare retinal donmuş kesitlerini tutarlı bir şekilde üretmelerini sağlar.

Fare Retinasının Kriyoseksiyonu ve İmmün Boyanması

Mevcut yöntem, biyopsileri ve beyin dilimleri gibi küçük, zor yönetmek için, doku parçaları, kesit tekrarlanabilir Kriyostat sağlar. Biz basit bir alüminyum donma aşamasında doku taşıma ve rutin olarak 400 mikron kalınlığında beyin dilimleri 5-10 mikron seri bölümleri üretmek için bir standart Kriyostat kolaylaştırmak için kullanır.

Dilim İmmünohistokimya için hazırlıklar İnce Kesit

Öğrenin, fare retinasındaki mikrovasküler perisitleri görselleştirmek için kriyokesit, bütün bağ ve hipotonik izolasyon yöntemlerini. Bu teknikler oftalmolojide perisit davranışlarını incelemeye yardımcı olur.

Retina Cryo-kesitler, Bütün bağlar ve mikrovasküler perisitlerden immunohistokimyasal görselleştirme hipotonik izole damarlara hazırlıkları (Video) | JoVE Journal

Retina Cryo-kesitler, Bütün bağlar ve mikrovasküler perisitlerden immunohistokimyasal görselleştirme hipotonik izole damarlara hazırlıkları

Daha fazla video keşfet