Name: Bronchoalveolar lavaj Exosomes septik akciğer Lipopolysaccharide kaynaklı yaralanmalarında (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Öğrenin, bronkoalveoler lavaj ekzozomlarını izole etme ve LPS kaynaklı akut akciğer hasarında hücreler arası iletişimi inceleme yöntemini. Bu teknik, septik fare modellerinde inflamatuar yanıtları araştırmak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması olarak atadım.

Genel protokol sepsis indüksiyon ilk gününde ve yalıtım BAL sıvı hayvan ve fare BALF exosomes izolasyonu için ikinci gün de dahil olmak üzere 2 gün gerektirir. Tüm yordamları gözden geçirilmiş ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi Atlanta VA Tıp Merkezi tarafından onaylanmış.
1. fare Akut Septik akciğer yaralanma modeli
<ol><li>Kullanın 6-8 hafta - yaşlı erkek yaban-C57BL/6J farelerde tip (ağırlığı 20-22 g) hayvan için model ve aseptik teknik ve araçları kullanarak tüm yordamlarını gerçekleştirin. Otoklav forseps ve makas için 121 ° C'de 20 dk da dahil olmak üzere tüm cerrahi aletler</li>
	<li>Rastgele fare içine deney ve kontrol grubu dağıtın. Fareler cerrahi bir tahta üzerinde tut. Escherichia coli lipopolysaccharide (LPS, 15 mg/kg) ile fareler mayi yoldan tedavi. Bireysel vücut ağırlığına göre uygun LPS dozlarda fare, başına 0.1 ml PBS sulandırmak LPS çözüm 27 G iğne ile 1 mL şırınga kullanarak enjekte ve PBS bir eşdeğer birim denetim hayvanlara enjekte.</li>
	<li>Fareler uygun oda sıcaklığında temiz kafes oluşur hayvan BSL2 tesis unutmayın.</li>
	<li>24 s sonra CO2 inhalasyon ile fareler ötenazi.</li>
	<li>Cerrahi alan fare boyun ortasına seçin. Küçük bir insizyon attım (yaklaşık 5 mm) yapmak ve yavaşça kasları erişim trakea maruz kadar künt forseps kullanarak nefes borusu için ayırın.</li>
	<li>Fare BAL sıvısı 10 mL steril şırınga ile 27 G iğne ile geri alıyorum. İlk olarak, yavaşça, iğne nefes borusu takın ve 1 mL steril PBS yavaş yavaş nefes borusu enjekte, daha sonra BALF 3 mL tek kullanımlık şırınga 27 G iğne ile çizmek. Yordamı tamamlandığında, şırınga ve iğne biohazard "Sharps" kap içinde atın.</li>
	<li>Chauret ve ark. tarafından daha önce açıklandığı gibi cerrahi aletler ile klor dioksit, tedavi 27ve o zaman ısıyla 121 ° C'de 20 dk için tarafından tüm cerrahi aletler sterilize</li>
</ol>2. Exosomes yalıtım-seri Ultra-Santrifüjü ve karakterizasyonu
<ol><li>Fare BAL sıvısı 15 mL konik tüpler toplamak. Alveolar hücre hasat için örnekleri, 1000 g, 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi</li>
	<li>Süpernatant yeni 15 mL konik tüpler, daha sonra örnekleri için 4.000 x g 4 ° C'de hücre artıkları kaldırmak için de 30 dk santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant ultracentrifuge tüpler ve 10.000 x g 4 ° C'de daha büyük hücresel parçacıkları kaldırmak için de 60 dk santrifüj örnekleri toplamak.</li>
	<li>Süpernatant yeni konik tüpler, daha sonra örnekleri 0.2 µm şırınga filtre daha büyük partiküller kalan kaldırmak için aracılığıyla filtre.</li>
	<li>Ultracentrifuge tüpler örnekleri toplamak ve tüpler denge. 140.000 x g 4 ° C'de exosomes cips için de 2 h için örnekler santrifüj kapasitesi. Not: 20-200 nm exosomes boyutu değişir. 0.2 µm filtre 200'den fazla olan büyük parçacıklar kaldırmak için kullanılır nm boyutunda.</li>
	<li>Supernatants yavaşça atmak. Pelet 100 µL PBS veya lizis çözüm ve transfer exosomes örnekleri için 1,5 mL tüpler ile dağıtılması ve-80 ° C'de kullanmak kadar saklamak. Not: Transmisyon Elektron mikroskobu izole exosomes doğrulamak için önerilir.</li>
	<li>İletişim kuralı28işleme standart TEM örnek izleyin. 200 bar transmisyon elektron mikroskobu ve almak görüntüleri, ölçek kullanarak exosomes örnekleri analiz nm.</li>
</ol>3. miRNA ve sahne miRNA-q-RT-PCR hazırlanması
Not: miRNA-q-RT-PCR miRNAs ifade düzeyini analiz etmek için önerilir.
<ol><li>Standart miRNAs yalıtım Protokolü izleyin ve tek iplikçikli Ters transkripsiyon24saat içinde arıtılmış RNA'ların eşit miktarda kullanmaya dikkat edin.</li>
	<li>Exosomal mikroRNA düzeyi BAL sıvısı içinde algılamak için standart gerçek zamanlı PCR Protokolü izleyin. Belirli gerçek zamanlı PCR astar miR-155, miR-146a ve U6 SnRNA karşı kullanın. PCR reaksiyon kantitatif PCR aparatı ile çalıştırın ve iç kontrol U6 snRNA için ifade değerleri normalize. Not: Her grup onaylatılacak örnekleri24toplam oluşur.</li>
</ol>4. Exosomes etiketleme ve arıtma
<ol><li>Exosomes Pelet 100 µL süspansiyon çözüm ile 1,5 mL polipropilen boru içinde askıya sonra exosomes boya diğer tüp içine 0.4 µL süspansiyon çözeltinin 100 µL ile ekleyin.</li>
	<li>Hızlı bir şekilde exosomes boya çözümde ekleyin ve karıştırarak iyice pipetting tarafından. Örnekleri 5 min için oda sıcaklığında tutmak, ışıktan korumak.</li>
	<li>Bir eksozom spin sütuna bir 1,5 mL elüsyon tüpü yerleştirin. Çözüm karışımı eksozom spin sütun Center'a aktarın.</li>
	<li>Sütun vasıl 800 x g oda sıcaklığında 2 min için spin.</li>
	<li>Sütun atın ve -20 ° C'de eluted örnek kullanmak kadar saklamak.</li>
</ol>5. doğrulama Exosomes alıcı hücreleri tarafından alınan up
<ol><li>1 x 104 MLE 12 /cell bir 8-şey odası slayt ve kültür hücreleri 37 ° c, % 5 CO2tohum.</li>
	<li>10 µL floresan etiketli exosomes hücrelere ekleme. 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya</li>
	<li>Kültür ortamını çıkarın ve hücreleri PBS ile yıkayın, sonra oda sıcaklığında 10 dakika için %1 paraformaldehyde ile hücreleri tamir.</li>
	<li>Slayt Dağı orta DAPI ile bağlayın.</li>
	<li>Floresan mikroskop örnekleri analiz ve fotoğraf, 40 X büyütme çekmek.</li>
</ol>6. Exosomes ve alıcı hücreler arasındaki etkileşim doğrulanması
<ol><li>Tohum 2 x 105 MLE12/iyi uygun kültür orta ve 37 ° c, % 5 CO2kültür hücreleri içeren bir 12-şey kültür plaka.</li>
	<li>20 µg exosomes fare BAL sıvısı MLE12 hücrelere ekleme ve deney grubu başına çoğaltır ayarlayın.</li>
	<li>24 s sonra PBS hücrelerle yıkama ve 600 µL lizis arabellek kuyunun içine ekleyin. Yavaşça plaka sallamak ve pipet ile 1,5 mL tüp lizis örnekleri toplamak.</li>
	<li>Standart toplam RNA izolasyon iletişim kuralı ve cDNA Ters transkripsiyon protokolü takip et, tek iplikçikli cDNA Ters transkripsiyon29tamamlamak.</li>
	<li>MRNA ifade düzey alıcı hücreler29algılamak için standart gerçek zamanlı PCR Protokolü izleyin. TNF-α, Il karşı belirli gerçek zamanlı PCR astar kullanın-6 ve ZO-1. PCR reaksiyonları kantitatif PCR aparatı ile çalıştırın ve iç kontrol GAPDH için ifade değerleri normalize. Not: Her grup onaylatılacak örnekleri oluşur.</li>
</ol>

<ol><li>Rubenfeld, G. D., Herridge, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+and+outcomes+of+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Epidemiology and outcomes of acute lung injury.</a> Chest. 131, 554-562 (2007).</li>
<li>Baron, R. M., Choi, A. J., Owen, C. A., Choi, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+manipulated+mouse+models+of+lung+disease%3A+potential+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Lung+cellular+and+molecular+physiology%22%5BJournal%5D)">Genetically manipulated mouse models of lung disease: potential and pitfalls.</a> American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. , L485-L497 (2012).</li>
<li>Han, S., Mallampalli, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acute+respiratory+distress+syndrome%3A+from+mechanism+to+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">The acute respiratory distress syndrome: from mechanism to translation.</a> Journal of immunology. , Baltimore, Md. 855-860 (1950).</li>
<li>Aeffner, F., Bolon, B., Davis, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Models+of+Acute+Respiratory+Distress+Syndrome%3A+A+Review+of+Analytical+Approaches%2C+Pathologic+Features%2C+and+Common+Measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+pathology%22%5BJournal%5D)">Mouse Models of Acute Respiratory Distress Syndrome: A Review of Analytical Approaches, Pathologic Features, and Common Measurements.</a> Toxicologic pathology. 43, 1074-1092 (2015).</li>
<li>Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Lung+cellular+and+molecular+physiology%22%5BJournal%5D)">Animal models of acute lung injury.</a> American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. , L379-L399 (2008).</li>
<li>Terrasini, N., Lionetti, V. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28328650">Exosomes in Critical Illness.</a> Critical care medicine. , (2017).</li>
<li>Fujita, Y., Kadota, T., Araya, J., Ochiya, T., Kuwano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Vesicles%3A+New+Players+in+Lung+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular Vesicles: New Players in Lung Immunity.</a> American journal of respiratory cell and molecular biology. , (2017).</li>
<li>Kubo, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28684288">Extracellular Vesicles in Lung Disease.</a> Chest. 153, 210-216 (2018).</li>
<li>Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+widespread+regulation+of+microRNA+biogenesis%2C+function+and+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay.</a> Nature reviews. Genetics. 11, 597-610 (2010).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+target+recognition+and+regulatory+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136, 215-233 (2009).</li>
<li>Fanini, F., Fabbri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CANCER-DERIVED+EXOSOMIC+microRNAs+SHAPE+THE+IMMUNE+SYSTEM+WITHIN+THE+TUMOR+MICROENVIRONMENT%3A+STATE+OF+THE+ART%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cell+%26+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">CANCER-DERIVED EXOSOMIC microRNAs SHAPE THE IMMUNE SYSTEM WITHIN THE TUMOR MICROENVIRONMENT: STATE OF THE ART.</a> Seminars in cell & developmental biology. , (2016).</li>
<li>Agarwal, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental%2C+Systems%2C+and+Computational+Approaches+to+Understanding+the+MicroRNA-Mediated+Reparative+Potential+of+Cardiac+Progenitor+Cell-Derived+Exosomes+From+Pediatric+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Experimental, Systems, and Computational Approaches to Understanding the MicroRNA-Mediated Reparative Potential of Cardiac Progenitor Cell-Derived Exosomes From Pediatric Patients.</a> Circulation research. 120, 701-712 (2017).</li>
<li>Prattichizzo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+microRNAs+and+endothelial+hyperglycaemic+memory%3A+a+therapeutic+opportunity%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%2C+obesity+%26+metabolism%22%5BJournal%5D)">Extracellular microRNAs and endothelial hyperglycaemic memory: a therapeutic opportunity?</a> Diabetes, obesity & metabolism. 18, 855-867 (2016).</li>
<li>Huang-Doran, I., Zhang, C. Y., Vidal-Puig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Vesicles%3A+Novel+Mediators+of+Cell+Communication+In+Metabolic+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+endocrinology+and+metabolism%3A+TEM%22%5BJournal%5D)">Extracellular Vesicles: Novel Mediators of Cell Communication In Metabolic Disease.</a> Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 28, 3-18 (2017).</li>
<li>Khalyfa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+Plasma+Extracellular+Microvesicle+MicroRNA+Cargo+and+Endothelial+Dysfunction+in+Children+with+Obstructive+Sleep+Apnea%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+and+critical+care+medicine%22%5BJournal%5D)">Circulating Plasma Extracellular Microvesicle MicroRNA Cargo and Endothelial Dysfunction in Children with Obstructive Sleep Apnea.</a> American journal of respiratory and critical care medicine. 194, 1116-1126 (2016).</li>
<li>Thomou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+circulating+miRNAs+regulate+gene+expression+in+other+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived circulating miRNAs regulate gene expression in other tissues.</a> Nature. 542, 450-455 (2017).</li>
<li>Gregson, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+Exosomal+RNA+Profiles+in+Bronchoalveolar+Lavage+from+Lung+Transplants+with+Acute+Rejection%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+and+critical+care+medicine%22%5BJournal%5D)">Altered Exosomal RNA Profiles in Bronchoalveolar Lavage from Lung Transplants with Acute Rejection.</a> American journal of respiratory and critical care medicine. 192, 1490-1503 (2015).</li>
<li>Valadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nature cell biology. 9, 654-659 (2007).</li>
<li>Doxaki, C., Kampranis, S. C., Eliopoulos, A. G., Spilianakis, C., Tsatsanis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+Regulation+of+miR-155+and+miR-146a+Genes+during+Induction+of+Endotoxin+Tolerance+in+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Coordinated Regulation of miR-155 and miR-146a Genes during Induction of Endotoxin Tolerance in Macrophages.</a> Journal of immunology. , Baltimore, Md. 5750-5761 (2015).</li>
<li>Schulte, L. N., Westermann, A. J., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+activation+and+functional+specialization+of+miR-146+and+miR-155+in+innate+immune+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Differential activation and functional specialization of miR-146 and miR-155 in innate immune sensing.</a> Nucleic acids research. 41, 542-553 (2013).</li>
<li>Alexander, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-delivered+microRNAs+modulate+the+inflammatory+response+to+endotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Exosome-delivered microRNAs modulate the inflammatory response to endotoxin.</a> Nature communications. 6, 7321(2015).</li>
<li>Yuan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM-1+is+induced+in+tumor+associated+macrophages+by+cyclo-oxygenase+pathway+in+human+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">TREM-1 is induced in tumor associated macrophages by cyclo-oxygenase pathway in human non-small cell lung cancer.</a> PloS one. 9, e94241(2014).</li>
<li>Xu, R., Richards, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+In+Vitro+Co-Culture+Model+in+Anti-Cancer+Drug+Development+Cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Combinatorial+chemistry+%26+high+throughput+screening%22%5BJournal%5D)">Development of In Vitro Co-Culture Model in Anti-Cancer Drug Development Cascade.</a> Combinatorial chemistry & high throughput screening. 20, 451-457 (2017).</li>
<li>Yuan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM-1-accentuated+lung+injury+via+miR-155+is+inhibited+by+LP17+nanomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Lung+cellular+and+molecular+physiology%22%5BJournal%5D)">TREM-1-accentuated lung injury via miR-155 is inhibited by LP17 nanomedicine.</a> American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. , L426-L438 (2016).</li>
<li>Sadikot, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dose+dexamethasone+accentuates+nuclear+factor-kappa+b+activation+in+endotoxin-treated+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+and+critical+care+medicine%22%5BJournal%5D)">High-dose dexamethasone accentuates nuclear factor-kappa b activation in endotoxin-treated mice.</a> American journal of respiratory and critical care medicine. 164, 873-878 (2001).</li>
<li>Yuan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin+mediated+epigenetic+modulation+inhibits+TREM-1+expression+in+response+to+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22The+international+journal+of+biochemistry+%26+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Curcumin mediated epigenetic modulation inhibits TREM-1 expression in response to lipopolysaccharide.</a> The international journal of biochemistry & cell biology. 44, 2032-2043 (2012).</li>
<li>Chauret, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorine+dioxide+inactivation+of+Cryptosporidium+parvum+oocysts+and+bacterial+spore+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Chlorine dioxide inactivation of Cryptosporidium parvum oocysts and bacterial spore indicators.</a> Applied and environmental microbiology. 67, 2993-3001 (2001).</li>
<li>Cizmar, P., Yuana, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+Characterization+of+Extracellular+Vesicles+by+Transmission+and+Cryo-Transmission+Electron+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Detection and Characterization of Extracellular Vesicles by Transmission and Cryo-Transmission Electron Microscopy.</a> Methods in molecular biology. , Clifton, N.J. 221-232 (2017).</li>
<li>Yuan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-related+proteins+prolong+macrophage+survival+through+induction+of+Triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells-1%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">HIV-related proteins prolong macrophage survival through induction of Triggering receptor expressed on myeloid cells-1.</a> Scientific reports. 7, 42028(2017).</li>
<li>Jackson, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Mitochondrial+Transfer+in+Direct+Co-cultures+of+Human+Monocyte-derived+Macrophages+%28MDM%29+and+Mesenchymal+Stem+Cells+%28MSC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Mitochondrial Transfer in Direct Co-cultures of Human Monocyte-derived Macrophages (MDM) and Mesenchymal Stem Cells (MSC).</a> Bio-protocol. 7, (2017).</li>
<li>Fujita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Vesicles%3A+New+Players+in+Lung+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular Vesicles: New Players in Lung Immunity.</a> American journal of respiratory cell and molecular biology. 17, 474-484 (2017).</li>
<li>Gunasekaran, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor-Derived+Exosomes+With+Lung+Self-Antigens+in+Human+Lung+Allograft+Rejection%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+transplantation+%3A+official+journal+of+the+American+Society+of+Transplantation+and+the+American+Society+of+Transplant+Surgeons%22%5BJournal%5D)">Donor-Derived Exosomes With Lung Self-Antigens in Human Lung Allograft Rejection.</a> American journal of transplantation : official journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 17, 474-484 (2017).</li>
<li>Kalra, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteomics+evaluation+of+plasma+exosome+isolation+techniques+and+assessment+of+the+stability+of+exosomes+in+normal+human+blood+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative proteomics evaluation of plasma exosome isolation techniques and assessment of the stability of exosomes in normal human blood plasma.</a> Proteomics. 13, 3354-3364 (2013).</li>
<li>Baranyai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Exosomes+from+Blood+Plasma%3A+Qualitative+and+Quantitative+Comparison+of+Ultracentrifugation+and+Size+Exclusion+Chromatography+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Isolation of Exosomes from Blood Plasma: Qualitative and Quantitative Comparison of Ultracentrifugation and Size Exclusion Chromatography Methods.</a> PloS one. 10, e0145686(2015).</li>
<li>Nordin, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafiltration+with+size-exclusion+liquid+chromatography+for+high+yield+isolation+of+extracellular+vesicles+preserving+intact+biophysical+and+functional+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine+%3A+nanotechnology%2C+biology%2C+and+medicine%22%5BJournal%5D)">Ultrafiltration with size-exclusion liquid chromatography for high yield isolation of extracellular vesicles preserving intact biophysical and functional properties.</a> Nanomedicine : nanotechnology, biology, and medicine. 11, 879-883 (2015).</li>
</ol>

Bu eser VA Merit İnceleme 2I01BX001786-06A1 RS için fon tarafından desteklenmiştir.

Fare modelleri hastalıkların belirli genler fizyolojik fonksiyonun değerlendirildiği ve deneme2maliyetini azaltmak için yaygın olarak kullanılır. Açıklanan Akut Septik akciğer hasarı burada inflamatuar yanıt ARDS ile insanlarda görülen taklit eder. Bu model moleküler patogenezi, biyolojik gelişimi araştırmak için ve potansiyel yeni tedaviler5test etmek için geçerlidir.
Ortak kültür sistemleri in vivo çalışmalar transfer RNA, DNA, lipidle...

ALI ve ARDS yaklaşık 1 milyon kişi dünya çapında etkiler sigara kardiyojenik pulmoner ödem tarafından neden olduğu ciddi hipoksemi ile solunum yetmezliği hayati formları vardır her yıl1. ARDS etyolojisinde doğrudan yaralanma için akciğer enfeksiyonları veya aspirasyon ve dolaylı hakaret çeşitli içerir. Son on yılda ARDS moleküler patogenezi artan bir anlayış,2,3için geliştirilen henüz ancak, ARDS için hedeflenen spesifik tedaviler vardır.
Akut akciğer yaralanma birkaç hayvan modeli sağlayan bir köprü deneysel terapiler insan çalışmaları4,5' e çevirmek için geliştirilmiştir. Yaygın olarak kullanılan modelleri yerel yükleme oleik asit, bakteri, LPS ve bleomycin içerir. Diğer bir yaklaşım iskemi-reperfüzyon, cecal tüp ligasyonu ponksiyon, mekanik havalandırma kaynaklı streç yaralanma, hyperoxia veya bakteri ve LPS5sistemik yönetimini içerir. Bu modeller klinik hipotezler test etmek için yararlı bir biyolojik sistem sağlamak ve olası terapiler gelişimi için. İnsan ARDS benzetimini yapmak için hayvan modelleri inflamasyon ve akciğerlerde bariyer işlevindeki kusur ile epitel ve endotel hücrelere akut yaralanma çoğaltmak.
Exosomes arası hücresel doku microenvironment moleküler kompozisyonu havalesi yoluyla iletişimde kolaylaştırmak ve membran veziküller ile 20-200 nm çapında, moleküler içeriği protein, DNA, RNA ve lipidler içerir, vardır. Exosomes hücrelerin endotel hücreleri, epitel hücreleri, düz kas hücreleri ve tümör hücreleri, gibi birden çok türü tarafından salgılanan ve insan vücut sıvısı içinde adlı biri yok. Exosomes çapraz-hadis bağışıklık hücreleri ve stromal hücreler arasında bulaşıcı ve steril inflamatuar hastalıklar sırasında düzenleyen ve çeşitli doğal ve deneysel uyaranlara tarafından fizyolojik sırasında düzenlenmiş olması anormal salınımlarını görünür çalışmalar göstermektedir ve patolojik süreçler6. Böyle iletişim ağı akciğer hastalıkları patogenezinde önemli bir rol oynayabilir ve patofizyolojik ilerleme7,8etkileyebilir. Kodlamayan RNA'ların, miRNAs ve doku ve vücut sıvıları, plazma, sera var mRNA ifade translasyon düzeyinde9,10modüle olarak 18-22 nükleotit.
Farklılaşma ve işlevi hücre birden çok türünün paketlenmiş miRNAs exosomes etkisi ve aşırı düzeyleri hastalıkları, kanser, akciğer hastalıkları, obezite, diyabet ve kardiyovasküler hastalık11de dahil olmak üzere çeşitli ile ilişkilidir, 12,13,14,15,16. Alıcı hücreler ve exosomal miRNAs mekik içine girişini kolaylaştıran hücreler arası iletişim microenvironment17,18hemostaz değiştirme. Akut akciğer-yaralanma bir karmaşık süreçler, birden çok hücre tipleri ile exosomes8geniş hücreler arası iletişim ile ilgili olduğunu. miR-155 ve miR-146a ortak transkripsiyon düzenleyici mekanizma paylaşmak ve inflamatuar yanıt ve immün tolerans19,20katkıda bulunur. Son yıllarda yapılan çalışmalarda her ikisi de exosomal miRNAs bağışıklık hücreleri21arasında mekik ile inflamatuar yanıt modüle gösterir. Ancak, düzenleyici etkileri exosomal miRNAs endotoksin alveoler yanıt temel moleküler mekanizmaları belirsiz kalır, hiç şüphesiz soruşturma potansiyel klinik önemi ve çevirim dolaylı hak daha fazla.
Ortak kültür modelleri inflamasyon ve kanser22,23gibi karmaşık ortamında belirli hücre tipleri arasındaki etkileşimin tanımlamak için istihdam edilmektedir. Bu platformlar özellikle bağışıklık ve yapısal hücreler için hücre tipleri arasında çapraz konuşma sorguya çekmek için alternatif bir stratejisi sağlayabilir.
Intra-trakeal, solumuş, mayi veya sistemik LPS deneysel akciğer hasarı24,25,26ikna etmek için yaygın olarak kullanılan ve yönetim epitel ve endotel geçirgenliği ikna etmek için göstermiştir kusur. Burada mayi LPS septik manken akut akciğer yaralanma farelerde ikna etmek için kullanın. LPS mayi yönetim 24 h içinde geçirgenliği kusurları ile inflamatuar hücre alımı akciğerlerde indüklenen vardır. Ayrıca, exosomes BAL üzerinden miRNA-155 ve miR-146a içerir ve exosomes BAL sıvısı üzerinden alıcı epitel hücreleri, IL-6 ve TNF-α gibi ifadede pro-inflamatuar sitokinlerin neden göster. O exosomal miRNAs ilk Akut Septik akciğer hasarı bu modelde BAL içinde salgılanan verilerdir.

<table><tbody><tr><td>lipopolisakkarit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Escherichia coli 055:B5</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH7.2(1X)</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>mirVana miRNA izolasyon kiti</td><td>Thermo Fisher</td><td>449774</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gen Ekspresyonu Master Mix</td><td>Thermo Fisher</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>mmu-miR-155 (002571) astar</td><td>Thermo Fisher</td><td>4427975</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-146a (000468) astar</td><td>Thermo Fisher</td><td>4427975</td><td></td></tr><tr><td>U6snRNA astar</td><td>Thermo Fisher</td><td>4427975</td><td></td></tr><tr><td>TNF-&alfa;( Mm00443258_m1 ) astar</td><td>Thermo Fisher</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>IL-6 (Mm00446190_m1&nbsp; &nbsp; (astar</td><td>Thermo Fisher</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 (Mm00493699_m1&nbsp; )primer</td><td>Thermo Fisher</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>minimal esansiyel ortam (MEM)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>11095-072</td><td></td></tr><tr><td>Trysin-EDTA çözeltisi (% 0.05)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Eksozomlar PKH67 ile PKH67 Yeşil Floresan Hücre bağlayıcı Mini Kiti ile etiketlendi.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI67-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Eksozom Döndürme Sütunları (MW3000)</td><td>Thermo Fisher</td><td>4484449</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter Optima L-100XP ultrasantrifüj&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>L-100XP</td><td></td></tr><tr><td>Ultra şeffaf santrifüj tüpleri</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems 7500 Hızlı Gerçek Zamanlı PCR Sistemi</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>transmisyon elektron mikroskopları (TEM)</td><td>JEOL Ltd</td><td>120 kV TEM</td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX41 mikroskobu</td><td>Olympus</td><td>BX41</td><td></td></tr></tbody></table>

bronchoalveolar lavaj exosomes septik akciğer lipopolysaccharide kaynaklı yaralanmalarında

Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury

Akut akciğer hasarı (ALI) ve Akut Respiratuar distress Sendromu (ARDS) yüksek morbidite ve mortalite bulunmaya devam ediyor akciğer hastalıkları heterojen bir grup temsil eder. ALI moleküler patogenezi daha iyi tanımlanmış; Ancak, hastalık karmaşık yapısı nedeniyle moleküler terapiler geliştirilecek için henüz. Burada bir lipopolysaccharide (LPS) indüklenen fare modeli Akut Septik akciğer yaralanma exosomes inflamatuar yanıt rolü betimlemek için kullanın. Bu modeli kullanarak, biz mayi LPS maruz fareler exosomes içinde miRNA ve inflamatuar yanıt düzenleyen sitokinler ile paketlenmiş akciğerler solunum-alveoler lavaj (BAL) sıvı salgılar göstermek başardık. Daha fazla ortak kültür model sistem kullanarak, gösterdiğimiz makrofajlar yayımlanan exosomes ifade bronş epitel hücrelerdeki sıkı kavşak proteinlerin bozabilir. Bu sonuçlar 1) exosomal mekik ile doğuştan gelen bağışıklık ve yapısal hücreler arasında çapraz konuşma katkıda bulunmak için inflamatuar yanıt ve yapısal bariyer ve 2) hedefleme bu miRNAs bozulma tedavisi için yeni bir platform sağlamak öneririz ALI ve ARDS.

Septik akciğer yaralanmalara neden fareler mayi LPS (15 mg/kg) ile tedavi edildi. LPS yönetim 24 h içinde nötrofilik akını akciğerlerde, Şekil 1A' gösterildiği gibi görüldü. Yalıtım ve arıtma exosomes ardından fare BAL sıvısı çizilmiştir. BALF exosomes morfoloji elektron transmisyon mikroskopisi (Şekil 1B) tarafından doğrulandı.
Seçici pro-inflamatuar miRNAs miRNA-155 v...

Fareler için mayi LPS maruz miRNAs ile paketlenmiş exosomes solunum-alveoler lavaj (BAL) sıvı salgılar. Ortak kültür sistemiyle, biz BAL sıvısı serbest exosomes ifade bronş epitel hücrelerdeki sıkı kavşak proteinlerin bozabilir ve akciğer hasarı vurgulamak pro-inflamatuar sitokinlerin ifade artış gösteriyor.

Bronchoalveolar lavaj Exosomes septik akciğer Lipopolysaccharide kaynaklı yaralanmalarında

Acute lung injury (ALI) and acute respiratory distress syndrome (ARDS) represent a heterogeneous group of lung diseases which continues to have a high ...

Bu deneyin genel amacı, LPS'nin neden olduğu, akut septik akciğer hasarı olan bir fare modelinde enflamatuar yanıtlarda eksozomların rolünü tanımlamaktır. Dolayısıyla bu yöntem, akut akciğer hasarı ve akut solunum sıkıntısı sendromunda hücre çapraz konuşması ile ilgili temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Özellikle eksozom mekiği yoluyla alveolar-mikro ortam içinde hücreler arası iletişim.Bu tekniğin temel avantajı, akut akciğer hasarı olan endotoksin ile tedavi edilmiş septik farelerden türetilen yüksek oranda saflaştırılmış bronkoalveoler lavaj eksozomlarının izolasyonuna ve karakterizasyonuna izin vermesidir. Prosedürü gösteren Dr.Zhihong Yuan ve Dr.Chetna Bedi'dir. Başlamak için, fare başına 0,1 mililitre LPS ve PBS içeren 27 gauge iğne ile donatılmış bir mililitrelik bir şırınga yükleyin ve ilk altı ila sekiz haftalık erkek C57 siyah 6J fareyi manuel olarak kısıtlayın.LPS'yi intraperitoneal olarak verin ve hayvanı kafesine geri koyun. 24 saat sonra, ilk hayvanın boynunun ortasında beş milimetrelik bir kesi yapın ve trakeayı ortaya çıkarmak için kasları nazikçe ayırmak için künt forseps kullanın. Daha sonra, steril 10 mililitrelik bir şırıngaya bağlı 27 gauge iğneyi trakeaya yavaşça yerleştirin ve bir mililitre steril PBS enjekte edin.Ardından 10 mililitrelik şırıngayı hemen yeni bir 27 gauge iğne ile donatılmış üç mililitrelik bir şırınga ile değiştirin. Bronkoalveoler lavaj sıvısını veya BOLF'u aspire edin ve BOLF'yi buz üzerinde uygun şekilde etiketlenmiş 15 mililitrelik konik bir tüpe ekleyin. Eksozomları izole etmek için BOLF örneklerini santrifüjleyin ve süpernatanları yeni 15 mililitrelik tüplere aktarın.Numuneleri tekrar santrifüjleyin ve daha büyük, hücresel parçacıkları çıkarmak için süpernatanları ultra santrifüj tüplerine aktarın. Süpernatanları yeni konik tüplere aktarın ve kalan daha büyük parçacıkları gidermek için numuneleri 0,2 mikron şırınga filtrelerine yükleyin. Eksozomları peletlemek için filtrelenmiş numuneleri yeni ultra santrifüj tüplerine ekleyin.Süpernatanları dikkatlice atın ve peletleri tüp başına 100 mikrolitre PBS'de yeniden askıya alın. Daha sonra eksozom örneklerini eksi 80 santigrat derece depolamaları için ayrı ayrı 1,5 mililitrelik tüplere aktarın. Eksozomları saflaştırmak için, numune başına 100 mikrolitre süspansiyon çözeltisi içeren bir tüpe 0.4 mikrolitre uygun eksozom boyası ekleyin ve her bir boya tüpüne hızlı bir şekilde çözülmüş bir eksozom numunesi ekleyin.Eksozomları boya ile iyice karıştırın ve numuneleri ışıktan koruyarak oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, numune başına bir eksozom spin kolonunu 1.5 mililitrelik bir illüzyon tüpüne yerleştirin ve eksozom solüsyonlarını her bir spin kolonunun merkezine aktarın. Daha sonra numuneleri santrifüjleyin, kolonları atın ve belirtilen numuneleri eksi 20 santigrat derecede saklayın.Alıcı hücreler tarafından eksozom alımını ölçmek için, ilk tohum bir kez 10 ila dördüncü fare akciğer epiteli 12 hücreyi 0.5 mililitre ortamda sekiz oyuklu bir odacıklı slaytın her bir oyuğuna% 5 karbon dioksit içinde 37 santigrat derecede 16 saatlik bir kültür için koyun. Çözüldükten sonra, her bir oyuğa 10 mikrolitre saflaştırılmış floresan etiketli eksozom ekleyin ve hücre kültürlerini bir saat boyunca inkübatöre geri koyun. İnkübasyonun sonunda, hücreleri PBS ile yıkayın ve her bir ko-kültürü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 1 paraformaldehit ile sabitleyin.Ortamı çıkarın ve ardından slaytı DAPI ile desteklenmiş ortamla monte edin ve numuneleri 40 kat büyütmede floresan mikroskobu ile görüntüleyin. Alıcı hücrelerle eksozom etkileşimini doğrulamak için, 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte iki saatlik bir inkübasyon için uygun kültür ortamını içeren 12 oyuklu bir kültür plakasında oyuk başına iki mililitre ortamda 10 ila beşinci fare akciğer epitel 12 hücresini iki kez tohumlayın. İnkübasyonun sonunda, deney grubu başına üç epitel hücresi kuyusuna 20 mikrogram eksozom ekleyin ve hücreleri inkübatöre geri koyun.24 saat sonra, ortamı çıkarın, hücreleri PBS ile yıkayın ve hafifçe çalkalayarak her bir oyuğa 600 mikrolitre lizis tamponu ekleyin. Daha sonra her bir kuyucuğun tüm içeriğini ayrı ayrı 1,5 mililitrelik tüplere aktarın ve numuneleri standart gerçek zamanlı PCR protokollerine göre analiz edin. LPS uygulamasından sonraki 24 saat içinde, LPS ile tedavi edilen hayvanların akciğerlerinde nötrofilik akış gözlenir.Az önce gösterildiği gibi izolasyon ve saflaştırmalarından sonra, septik akciğer hasarı olan hayvanlardan BOLF'de eksozomların varlığı, transmisyon elektron mikroskobu ile doğrulanabilir. Seçilmiş proinflamatuar mikro RNA'nın ekspresyonu, LPS ile tedavi edilen hayvanlardan alınan bronkoalveolar sıvı eksozomlarında, kontrollü PBS ile tedavi edilen farelere kıyasla önemli ölçüde artmıştır. LPS ile muamele edilen eksozomlar, bir saatlik ko-kültürden sonra floresan boya etiketli eksozomların DAPI işaretli hücrelerle birlikte lokalizasyonu ile kanıtlandığı gibi, fare bronşiol epitel hücreleri tarafından alınır.Pro-inflamatuar mediatör ekspresyonu, LPS ile tedavi edilen hayvanlardan eksozomlarla birlikte kültürlenen epitel hücrelerinde, kontrol PBS ile tedavi edilen farelerden alınan eksozomlarla ko-kültüre kıyasla önemli ölçüde artmıştır. Ayrıca, LPS ile tedavi edilen farelerden eksozomlarla tedavi edilen hücreler, LPS ile muamele edilen eksozom ko-kültüründen sonra daha az sağlam bir hücre bütünlüğünü gösteren kontrollere kıyasla önemli ölçüde zayıflamış bir zonula oklüden ekspresyonu gösterir. LPS'nin intraperitoneal enjeksiyonu, bronkoalveoler lavaj ekstraksiyonu ve bronkoalveoler lavajdan eksozom delegasyonu tüm adımlar nispeten kısa bir sürede tamamlanabilir.Bu prosedürü takiben, akciğer alveolar mikro ortamındaki doğuştan gelen ve yapısal hücreler arasındaki çapraz konuşma hakkında ek soruları yanıtlamak için eksozom ve epitel hücre ko-kültürü gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Eksozom mekiği yoluyla doğuştan gelen bağışıklık ve yapısal hücreler arasındaki çapraz konuşma, inflamatuar yanıta ve yapısal bariyer bozulmasına katkıda bulunur, bu da ekzozomal mikro-RNA hedeflemesinin akut akciğer hasarı ve akut solunum sıkıntısı sendromunu tedavi etmek için normal bir platform sağlayabileceğini düşündürür. Bu videoyu izledikten sonra, farelerde septik akciğer hasarının nasıl indükleneceğini, farelerden bronkoalveoler lavaj sıvısının nasıl izole edileceğini, eksozomların lavaj sıvısından nasıl izole edileceğini ve hücre içi çapraz konuşmayı sorgulamak için bir ko-kültür modelinin nasıl kullanılacağını iyi anlamalısınız.LPS ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman uygun kişisel koruyucu ekipman giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.

bronchoalveolar-lavage-exosomes-lipopolysaccharide-induced-septic

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Source: Yuan, Z., et al. Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates an in vivo mouse model for inducing and analyzing acute lung injury (ALI) using intraperitoneal administration of bacterial lipopolysaccharide. The inflammatory cascade triggered by alveolar macrophages and neutrophils leads to epithelial and endothelial barrier disruption, allowing fluid and immune cells to accumulate in the alveoli. Alveolar...

Lipopolysaccharide-Induced Acute Lung Injury in Mice for Exosome and Immune Analysis

Patojen enfeksiyonuna karşı konak bağışıklık tepkisi sıkı bir şekilde düzenlenmiş bir süreçtir. Farelerde bir lipopolisakarit akciğer maruz modeli kullanarak, bu hastalığın patojenezi ile ilgili kompleks mekanizmalar yüksek çözünürlüklü değerlendirme yapmak mümkündür.

Farelerde Host immün yanıtı değerlendirmek için Orofarengeal intratrakeal PAMP İdaresi ve Bronchoalveolar Lavage Kullanımı

Biz akut akciğer hasarı modeli, nebülizasyonu tarafından aerosolleşmiş lipopolisakkaride meydan tarafından nötrofilik akciğer inflamasyonu uyarılması için bir yöntem açıklanmaktadır. Buna ek olarak, akciğer izolasyonu, entübasyon ve bronkoalveoler lavaj temel cerrahi teknikler de tarif edilmiştir.

Aerosolize Lipopolisakarid kullanma Yaratma Pulmoner nötrofilisi için bir yöntem

anestezi domuzlarda tekrarlanan akciğer lavaj insan akut solunum sıkıntısı sendromu (ARDS) önemli yönlerini benzeyen akciğer hasarı neden olur. Bu amaçla, akciğerler, art arda 37 ° C'de% 0.9 tuzlu su ile yıkanır. Protokolün amacı, ARDS araştırma için gaz değişimi ve hemodinamik tekrarlanabilir hafifletme olduğunu.

Akut Solunum Sıkıntısı Sendromu Modeli itibariyle Domuzların lavaj kaynaklı Surfaktan tükenmesi (ARDS)

Akciğerin sağlık durumu, akciğer bronşiollerinde bulunan bağışıklık hücrelerinin türüne ve sayısına göre yansıtılır. Farelerin alt solunum yollarından yapışkan olmayan hücrelerin ve çözünür faktörlerin izolasyonunu ve çalışılmasını sağlayan bir bronkoalveolar lavaj tekniğini açıklıyoruz.

İnflamatuvar Hücre İnfiltrasyonunu İncelemek İçin Murin Akciğerlerin Bronkoalveoler Lavajı

Burada, iki hücre dışı vezikül yalıtım protokol, Ultrafiltrasyon Santrifüjü ve ultrasantrifüj ile yoğunluk gradient Santrifüjü ekstraselüler veziküller fare bronchoalveolar lavaj sıvı örneklerinden izole etmek, açıklamak. Fare bronchoalveolar lavaj sıvı her iki yöntem tarafından türetilmiş hücre dışı veziküller sayılabilir ve karakterize.

Üzerinden Ultrafiltrasyon tekniği Santrifüjü kullanarak fare Bronchoalveolar lavaj sıvı ekstrasellüler veziküller yalıtım

Burada sunulan bir adım-adım prosedür doğrudan intratrakeal lipopolisakkarid instilasyon tarafından fareler akut akciğer hasarı neden ve kan örnekleri, Bronkoalveoler Lavaj sıvısı ve akciğer dokusu FACS analizi gerçekleştirmek için. Minimal invasiveness, basit kullanım, iyi reproducibility, ve hastalık şiddeti titrasyon bu yaklaşımın avantajlarıdır.

Doğrudan Intratracheal Lipopolysaccharide Instilasyon ile farelerde akut akciğer hasarının İndükleme

Kombine ozon ve bakteriyel endotoksin maruz fareler nötrofiller de dahil olmak üzere geniş yayılmış hücre ölümü gösterir. Sitoskeletal lamellipodia'nın bozulması, karmaşık V ATP sintaz alt β birliğinin hücresel ekspresyonunun artması ve bronko-alveoler lavajda anjiyostatin, akciğer immün yanıtının baskılanması ve nötrofil alımının gecikmesi gibi hücresel adaptasyonları gözlemledik.

Kombine Ozon ve LPS kaynaklı Murine Akut Akciğer Hasarı Sırasında Akciğer Hücresel Adaptasyonlarının Görselleştirilmesi

Bu çalışmada, invaziv olmayan endotrakeal instillasyon tekniğinin, akciğerlere hassas LPS iletimi sağlamak için temel bir laringoskop kullanılarak sıçanlarda ALI geliştirdiği gösterilmiştir. LPS, laringoskop kullanılarak endotrakeal tüp aracılığıyla yerleştirilir. Akciğer yaralanmasının büyüklüğü birden fazla zaman noktasında değerlendirilir.

Kemirgenlerde akut akciğer hasarını indüklemek için lipopolisakkaridin invaziv olmayan endotrakeal uygulaması

Bu protokol, etkili bir şekilde, taze izole edilmiş beşeri villöz sitotrofoblastlar siRNA transfekte gözeneklendirilmesinin kullanılarak bu hücrelerde DNA-protein kompleksleri tanımlanması için bir yöntem tarif eder. Transfekte edilen hücreler, Western Blot ile izlenebilir ve EMSA 4-günlük kültür döneminde analiz eder.

Taze izole edilmiş insan Villöz sitotrofoblastlar ilgili siRNA transfeksiyonu ve EMSA analizi

Öğrenin, bronkoalveoler lavaj ekzozomlarını izole etme ve LPS kaynaklı akut akciğer hasarında hücreler arası iletişimi inceleme yöntemini. Bu teknik, septik fare modellerinde inflamatuar yanıtları araştırmak için kullanılır.

Bronchoalveolar lavaj Exosomes septik akciğer Lipopolysaccharide kaynaklı yaralanmalarında

Daha fazla video keşfet