Elastin benzeri Protein Hydrogels üretimi için saklama ve Immunostaining hücre 3D

Bu protokolün genel amacı, 3D hücre kapsüllemesi için ayarlanabilir bir hidrojel olarak kullanılmak üzere rekombinant olarak türetilmiş elastin benzeri proteinleri eksprese etmek ve saflaştırmaktır. Ek olarak, bu protokol, kapsüllenmiş hücrelerin konfokal mikroskobunda aşağı akış floresan etiketleme metodolojisini sunar. Bu yöntem, hücre-hücre dışı matris etkileşimlerinin 3D'deki rolünü anlamak gibi biyomalzemeler, rejeneratif tıp ve hücre biyolojisi alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin temel avantajı, çoklu hücre tiplerinin incelenmesine uygun, tekrarlanabilir, ayarlanabilir ve modüler bir malzeme platformu sağlamasıdır. Genel olarak, bu tekniğin uygulanması, gelecekteki hücre bazlı rejeneratif tedavilerin başarısını belirleyebilecek kritik hücre ECM sinyal parametreleri hakkındaki anlayışımızı geliştirebilir. İlgilenilen ELP'yi kodlayan bir vektör içeren önceden hazırlanmış bir bakteri stoğu ile bir ampisilin ve kloramfenikol agar plakası çizin.

Ardından, bakteri üremesine izin vermek için çizgili plakayı gece boyunca 37 santigrat derecede baş aşağı inkübe edin. Ertesi gün, plakadan tek bir koloni seçin ve önceden ısıtılmış başlangıç kültürünü aşılayın. Kültürü 16 saat boyunca 37 santigrat derecede bir çalkalayıcıda inkübe edin.

İnkübasyon süresinden sonra, her bir ekspresyon şişesine 20 mililitre başlangıç kültürü aktarmak için serolojik bir pipet kullanın. İfade şişesini bir saat sallayarak bırakın. Bir saat sonra, ifade şişesinden bir alikotun 600 nanometresindeki optik yoğunluğu ölçün.

Okuma 0,6'ya ulaşır ulaşmaz, çalkalayıcının sıcaklığını 32 santigrat dereceye düşürün. Okuma 0.8'e ulaştığında, ifade şişesinde ELP ekspresyonunu indüklemek için bir mililitre bir molar steril filtreli IPTG ekleyin. Kültürün yedi saat boyunca ifade etmesine izin verin.

Yedi saat sonra, ekspresyon ortamını bir zemin santrifüjünde dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 12.000 x g'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, hücre peletini santrifüj kabından toplamak için bir spatula kullanın ve önceden tartılmış bir kilitli torbaya yerleştirin. Daha sonra, hücre peletini steril filtrelenmiş TEN tamponunda çözün.

Homojen bir çözelti oluşturmak için hücre peletine masaj yapın. Kilitli torbayı yeniden askıya alınmış hücre peleti ile ikincil bir kapta 80 santigrat derecede dondurun. Çözülmüş hücre peletine, her 100 mililitre hücre lizatı için yaklaşık 30 ila 40 miligram deoksiribonükleaz ve bir mililitre 100 milimolar PMSF ekleyin.

Lizatı gece boyunca bir çalkalayıcı üzerinde dört santigrat derecede inkübe edin. Üçüncü donma-çözülme döngüsünün ardından, numuneleri dört santigrat derecede bir saat boyunca en az 15.000 x g santrifüjleyin. Santrifüjleme sonrası, süpernatanı santrifüj kabından boşaltın ve çözeltiyi yeni bir santrifüj kabına aktarın.

Her 100 mililitre süpernatanta, son bir molar konsantrasyona üç parça halinde 5.84 gram sodyum klorür ekleyin. Süspansiyonu üç saat boyunca 37 santigrat derecede çalkalanan bir inkübatörde inkübe edin. İnkübasyonun ardından, numuneleri 37 santigrat derecede bir saat boyunca en az 15.000 x g'da santrifüjleyin.

Santrifüjleme sonrası, süpernatanı santrifüj kabından atın ve peleti kütleleştirin. Daha sonra, santrifüjlemeden sonra elde edilen pelet gramı başına 10 mililitre otoklavlanmış ultra saf su ekleyin. Proteinin tamamen çözünmesini sağlamak için, peleti ezmek ve yeniden süspanse etmek için metal bir spatula kullanın.

Yeniden süspanse edilmiş peleti bir orbital çalkalayıcı üzerinde gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. ELP'yi daha da saflaştırmak için soğuk ve sıcak santrifüjleme adımlarını toplam üç döngü boyunca tekrarlayın. Daha sonra, protein çözeltisini tuzdan arındırmak için üç gün boyunca dört santigrat derecede dört litre önceden soğutulmuş ultra saf suya karşı 3.5 kilodaltonluk bir diyaliz membranında kalan süpernatanı diyaliz edin.

Son diyaliz çözeltisini önceden soğutulmuş bir santrifüjde santrifüjleyin. Süpernatanı önceden tartılmış bir konik tüpte 80 santigrat derecede dondurun. Son olarak, donmuş çözeltiyi üç gün boyunca liyofilize edin ve ardından protein verimini belirlemek için son liyofilize ürünü tartın.

Biyopsi punch yardımıyla, 0,5 milimetre kalınlığında bir silikon tabakada delikler oluşturun. Sonra her deliğin etrafına bir kare kesin. Ardından, tek tek kalıpların her iki tarafındaki plastik sargıyı çıkarmak için cımbız kullanın.

Plastik sargıyı çıkardıktan sonra, aynı sayıda çıplak silikon kalıbı ve cam kapak fişini, sonraki plazma yapıştırma için 48 oyuklu bir plakanın kapağına alternatif sıralar halinde yerleştirmek için cımbızı kullanın. Tüm hücre kültürü materyalleri üretildikten sonra, aşağı akış hidrojel kapsüllemesi için ilgilenilen hücre tipinin hazırlanmasına başlanabilir. Hücreleri tek bir hücre süspansiyonuna ayırdıktan sonra, istenen sayıda hücreyi 1.5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne ayırın.

Ardından, hücreleri üç dakika boyunca yaklaşık 200 x g'da santrifüjleyin. Santrifüjleme sonrası, süpernatanı aspire edin ve peleti buz üzerinde saklayın. Hücre peletini ELP stok çözeltisinde nihai hacmin %80'ine kadar yeniden süspanse edin.

Ardından, çözeltiyi ELP'de homojen bir hücre süspansiyonuna karıştırmak için bir pipet kullanın. Kalan %20'lik nihai hacim için, hücre ELP süspansiyonuna THPC stok çözeltisi ekleyin. Hava kabarcıklarının oluşmasını önlerken homojen bir karışım oluşumunu sağlamak için birkaç kez pipetleyin.

Daha sonra, dairesel hareketlerle, hücre ELP THPC karışımını 24 oyuklu bir plakada her bir kalıba pipetleyin. Daha sonra numuneleri oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. 15 dakika sonra, numuneleri 37 santigrat derecede 15 dakika daha inkübe edin.

İnkübasyon bittikten sonra, 24 oyuklu bir plakada her bir oyuğa dikkatlice 750 mikrolitre ılık hücre kültürü ortamı ekleyin. İstenilen kültür süresi boyunca hidrojeli 37 santigrat derecede bırakın. İlk olarak, ortamı her bir kuyucuktan aspire edin.

Ardından kuyuları bir mililitre ılık DPBS ile yıkayın. Yıkama tamamlandıktan sonra, her kuyucuğa 750 mikrolitre sabitleme çözeltisi ekleyin. Ardından, 24 oyuklu plakayı 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, sabitleme çözeltisini her bir kuyucuktan aspire edin ve sabitleyiciyi tehlikeli bir atık kabına atın. Ardından, numuneye bir mililitre DPBS ekleyin ve DPBS'yi hemen tehlikeli bir atık kabına atın. Daha sonra, numuneyi dakikada 15 devirde külbütör üzerinde oda sıcaklığında bir saat boyunca geçirgenleştirmek için 750 mikrolitre geçirgenleştirme çözeltisi ekleyin.

Bir saat sonra, geçirgenlik çözeltisini aspire edin ve numuneye 750 mikrolitre bloke edici çözelti ekleyin. Numuneyi üç saat boyunca oda sıcaklığında külbütör üzerinde bırakın. Daha sonra istenen primer antikorları antikor seyreltme solüsyonu ile seyreltin.

Daha sonra, her numuneye 500 mikrolitre antikor çözeltisi ekleyin. Numuneleri gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, birincil antikor çözeltisini aspire edin, ardından numuneleri oda sıcaklığında dakikada 15 devirde üç kez bir saat PBST ile yıkayın.

Daha sonra, mililitre başına 2.5 mikrogramlık bir nihai konsantrasyon elde etmek için uygun ikincil antikorları mililitre DAPI stok çözeltisi başına beş miligram içinde seyreltin. Ardından, her numuneye 500 mikrolitre çözelti ekleyin. Daha sonra, 24 oyuklu plakayı kaplamak için alüminyum folyo kullanın ve plakayı gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

Ertesi gün, ikincil antikor çözeltisini aspire edin ve numuneleri PBST ile her biri 30 dakika boyunca oda sıcaklığında bir külbütör üzerinde üç kez yıkayın. Ardından, bir cam sürgünün yüzeyine bir damla sert montaj ortamı yerleştirin ve numuneyi montaj ortamına yerleştirin. Son olarak, kontaminasyonu veya numune hareketini önlemek için numuneleri cam kapak sürgüsüne kapatmak için oje kullanın.

Burada, kontrollü koşullar altında tam uzunlukta ELP ile hedef proteinin ekspresyonu, hem SDS-PAGE hem de western blot analizinde 37 kilodaltonda bantların varlığı ile doğrulanır. Bununla birlikte, kontrolsüz koşullar altında, western blot kullanılarak birkaç düşük moleküler ağırlıklı bant da görülebilir. Daha düşük moleküler ağırlık bantları, dörtten az elastin benzeri alan tekrarına sahip proteinlere karşılık gelir, bu da proteinin ekspresyon sırasında tam olarak çevrilmediğini gösterir.

Bu sonuç, 32 santigrat derecenin üzerindeki ifadeyi gerçekleştirirken yaygındır. Hidrojel mekanik özelliklerini sabit tutarken hücre yapıştırıcı ligand konsantrasyonunu değiştirmek için, fibronektin türevi hücre yapıştırıcısını ve hücre dışı yapıştırıcı dizilerini içeren ELP varyantının oranı ayarlanır. Ayrıca, murin nöral progenitör hücreleri, %3'lük bir ELP hidrojel içinde kapsüllendiğinde yedi günlük bir süre boyunca yaşayabilir.

Canlı hücreler, kalsein boyası nedeniyle yeşil renkle tanımlanırken, kırmızı etidyum homodimer tercihen ölü hücreler tarafından alınır. Nöral progenitör hücrelerin kök hücre fenotipini doğrulamak için, hücreler 3D ELP hidrojellerinde kapsüllendiğinde Sox2 ve nestin gibi kanonik belirteçlerin ekspresyonu da immün boyama ile görselleştirilir. Bu videoyu izledikten sonra, çeşitli hücre tiplerinin aşağı akış kapsüllenmesi için elastin benzeri proteinin nasıl eksprese edileceğini ve saflaştırılacağını iyi anlamalı ve buna ek olarak, hücresel fenotipi modüle etmede 3D mikro çevrenin rolünü araştırmalısınız.