Name: Elastin benzeri Protein Hydrogels üretimi için saklama ve Immunostaining hücre 3D (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Öğrenin, elastin benzeri proteinleri ifade edip saflaştırarak 3D hücre kapsülasyonu için ayarlanabilir hidrojeller üretin. Bu yöntem, biyomalzemeler ve rejeneratif tıp alanlarında hücre-ekstraselüler matris etkileşimlerini incelemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar T. Palmer teşekkür ve H. Şekil 4 fare NPCs. vektör sanat sağlamak için Babu (Stanford Nöroşirürji) kullanılmış ve sunucusu tıbbi Sanat altında Creative Commons Attribution 3,0 dağıtıma açıktır Lisansı (https://creativecommons.org/ uyarlanmıştır licenses/by/3.0/legalcode). Bu eser parçası, Stanford Nano paylaşılan özellikleri (Ödülü ECCS-1542152 altında Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenen SNSF), gerçekleştirildi. Üssü destek üzerinden ulusal genel tıbbi Bilimler Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri (32 GM 008412) olarak kabul eder. C.M.M. bir NIH NRSA desteğinden önceden Doktora Bursu (F31 EB020502) ve Siebel akademisyenler Program kabul eder. S.C.H. Ulusal Sağlık Enstitüleri (U19 AI116484 ve R21 EB018407), Ulusal Bilim Vakfı (DMR 1508006) ve California Institute desteği rejeneratif tıp (RT3-07948) kabul eder. Bu araştırma Eunice Kennedy Shriver Ulusal Enstitüsü Çocuk Sağlığı ve insan geliştirme (NICHD), Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenen İttifak'ın rejeneratif rehabilitasyon araştırma ve eğitim (AR3T), fon aldı Nörolojik bozukluklar ve kontur (NINDS) ve Ulusal Enstitüsü Biyomedikal görüntüleme ve Biyomühendislik (NIBIB) Ulusal Ödülü numarası P2CHD086843 altında Sağlık Enstitüleri. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri görüşlerini temsil etmiyor.

<ol><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+Cell-Matrix+Adhesions+to+the+Third+Dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension.</a> Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).</li>
<li>Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+perturbation+in+vitro-A+growing+case+for+three-dimensional+%283D%29+culture+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene expression perturbation in vitro-A growing case for three-dimensional (3D) culture systems.</a> Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 405-412 (2005).</li>
<li>Gómez-Lechón, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expression+of+differentiated+functions+in+hepatocytes+cultured+in+three-dimensional+collagen+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Long-term expression of differentiated functions in hepatocytes cultured in three-dimensional collagen matrix.</a> Journal of Cellular Physiology. 177 (4), 553-562 (1998).</li>
<li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+the+third+dimension+-+how+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
<li>Justice, B. A., Badr, N. A., Felder, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+culture+opens+new+dimensions+in+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">3D cell culture opens new dimensions in cell-based assays.</a> Drug Discovery Today. 14 (1-2), 102-107 (2009).</li>
<li>Caliari, S. R., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+hydrogels+for+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical guide to hydrogels for cell culture.</a> Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).</li>
<li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).</li>
<li>Madl, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+neural+progenitor+cell+stemness+in+3D+hydrogels+requires+matrix+remodelling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Maintenance of neural progenitor cell stemness in 3D hydrogels requires matrix remodelling.</a> Nature Materials. 16 (12), 1233-1242 (2017).</li>
<li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Cells+Feel+and+Respond+to+the+Stiffness+of+Their+Substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate.</a> Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).</li>
<li>Sun, Y., Villa-Diaz, L. G., Lam, R. H. W., Chen, W., Krebsbach, P. H., Fu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+Regulates+Fate+Decisions+of+Human+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Mechanics Regulates Fate Decisions of Human Embryonic Stem Cells.</a> PLoS ONE. 7 (5), e37178(2012).</li>
<li>Ehrbar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+the+Role+of+Matrix+Stiffness+in+3D+Cell+Migration+and+Remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Elucidating the Role of Matrix Stiffness in 3D Cell Migration and Remodeling.</a> Biophysical Journal. 100 (2), 284-293 (2011).</li>
<li>Rowlands, A. S., George, P. A., Cooper-White, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+osteogenic+and+myogenic+differentiation+of+MSCs%3A+interplay+of+stiffness+and+adhesive+ligand+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Directing osteogenic and myogenic differentiation of MSCs: interplay of stiffness and adhesive ligand presentation.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 295 (4), 1037-1044 (2008).</li>
<li>Lampe, K. J., Antaris, A. L., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+three-dimensional+engineered+protein+hydrogels+for+tailored+control+of+neurite+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Design of three-dimensional engineered protein hydrogels for tailored control of neurite growth.</a> Acta Biomaterialia. 9 (3), 5590-5599 (2013).</li>
<li>Kilian, K. A., Mrksich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+Stem+Cell+Fate+by+Controlling+the+Affinity+and+Density+of+Ligand-Receptor+Interactions+at+the+Biomaterials+Interface%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Directing Stem Cell Fate by Controlling the Affinity and Density of Ligand-Receptor Interactions at the Biomaterials Interface.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (20), 4891-4895 (2012).</li>
<li>Tse, J. R., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Hydrogel+Substrates+with+Tunable+Mechanical+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of Hydrogel Substrates with Tunable Mechanical Properties.</a> Current Protocols in Cell Biology. , 10.16.1-10.16.16 (2010).</li>
<li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+A+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li>
<li>DiMarco, R. L., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+Materials+through+Modular+Protein+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Multifunctional Materials through Modular Protein Engineering.</a> Advanced Materials. 24 (29), 3923-3940 (2012).</li>
<li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+recombinant+proteins+by+fusion+with+thermally-responsive+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides.</a> Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).</li>
<li>Aladini, F., Araman, C., Becker, C. F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+synthesis+and+characterization+of+elastin-like+polypeptides+%28ELPs%29+with+variable+guest+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Peptide+Science%22%5BJournal%5D)">Chemical synthesis and characterization of elastin-like polypeptides (ELPs) with variable guest residues.</a> Journal of Peptide Science. 22 (5), 334-342 (2016).</li>
<li>McMillan, R. A., Caran, K. L., Apkarian, R. P., Conticello, V. P. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ma991119z">High-Resolution Topographic Imaging of Environmentally Responsive, Elastin-Mimetic Hydrogels.</a> Macromolecules. 32 (26), 9067-9070 (1999).</li>
<li>McMillan, R. A., Conticello, V. P. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ma9921091">Synthesis and Characterization of Elastin-Mimetic Protein Gels Derived from a Well-Defined Polypeptide Precursor.</a> Macromolecules. 33 (13), 4809-4821 (2000).</li>
<li>Chung, C., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrakis%28hydroxymethyl%29+Phosphonium+Chloride+as+a+Covalent+Cross-Linking+Agent+for+Cell+Encapsulation+within+Protein-Based+Hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Tetrakis(hydroxymethyl) Phosphonium Chloride as a Covalent Cross-Linking Agent for Cell Encapsulation within Protein-Based Hydrogels.</a> Biomacromolecules. 13 (12), 3912-3916 (2012).</li>
<li>Romano, N. H., Madl, C. M., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+RGD+ligand+density+and+L1CAM-mediated+Schwann+cell+interactions+synergistically+enhance+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Matrix RGD ligand density and L1CAM-mediated Schwann cell interactions synergistically enhance neurite outgrowth.</a> Acta Biomaterialia. 11, 48-57 (2015).</li>
<li>Shah, M., Hsueh, P. Y., Sun, G., Chang, H. Y., Janib, S. M., MacKay, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradation+of+elastin-like+polypeptide+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Biodegradation of elastin-like polypeptide nanoparticles.</a> Protein Science. 21 (6), 743-750 (2012).</li>
<li>Nettles, D. L., Chilkoti, A., Setton, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+elastin-like+polypeptides+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Applications of elastin-like polypeptides in tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 62 (15), 1479-1485 (2010).</li>
<li>Madl, C. M., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine-Selective+Functionalization+for+Bio-Orthogonal+Cross-Linking+of+Engineered+Protein+Hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tyrosine-Selective Functionalization for Bio-Orthogonal Cross-Linking of Engineered Protein Hydrogels.</a> Bioconjugate Chemistry. 28 (3), 724-730 (2017).</li>
<li>Zhu, D., Wang, H., Trinh, P., Heilshorn, S. C., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin-like+protein-hyaluronic+acid+%28ELP-HA%29+hydrogels+with+decoupled+mechanical+and+biochemical+cues+for+cartilage+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Elastin-like protein-hyaluronic acid (ELP-HA) hydrogels with decoupled mechanical and biochemical cues for cartilage regeneration.</a> Biomaterials. , 132-140 (2017).</li>
<li>Madl, C. M., Katz, L. M., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-Orthogonally+Crosslinked%2C+Engineered+Protein+Hydrogels+with+Tunable+Mechanics+and+Biochemistry+for+Cell+Encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Bio-Orthogonally Crosslinked, Engineered Protein Hydrogels with Tunable Mechanics and Biochemistry for Cell Encapsulation.</a> Advanced Functional Materials. 26 (21), 3612-3620 (2016).</li>
<li>Cai, L., Dinh, C. B., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-pot+synthesis+of+elastin-like+polypeptide+hydrogels+with+grafted+VEGF-mimetic+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">One-pot synthesis of elastin-like polypeptide hydrogels with grafted VEGF-mimetic peptides.</a> Biomater Sci. 2 (5), 757-765 (2014).</li>
<li>Straley, K. S., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2009/sm/b808504h#!divAbstract">Independent tuning of multiple biomaterial properties using protein engineering.</a> Soft Matter. 5 (1), 114-124 (2009).</li>
<li>Baneyx, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10508629">Recombinant protein expression in Escherichia coli.</a> Current Opinion in Biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).</li>
<li>Graumann, K., Premstaller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manufacturing+of+recombinant+therapeutic+proteins+in+microbial+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Manufacturing of recombinant therapeutic proteins in microbial systems.</a> Biotechnology Journal. 1 (2), 164-186 (2006).</li>
<li>Tashiro, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Synthetic+Peptide+Containing+the+IKVAV+Sequence+from+the+A+Chain+of+Laminin+Mediates+Cell+Attachment%2C+Migration%2C+and+Neurite+Outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A Synthetic Peptide Containing the IKVAV Sequence from the A Chain of Laminin Mediates Cell Attachment, Migration, and Neurite Outgrowth.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16174-16182 (1989).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Rekombinant protein ifade ve arıtma ile yüksek tekrarlanabilirlik Biyomalzeme sentezlemek için güçlü bir araç var. Ticari moleküler klonlama advent büyük ölçüde nedeniyle, özel rekombinant plazmid birkaç terdarikçilerin ELPs gibi malzemeler ile çalışmak için zaman önemli ölçüde küçültür satın alınabilir. Benzer şekilde, plazmid doğrudan kaynak laboratuvardan ne zaman orijinal çalışma bir federal anlaşma tarafından desteklenen ve gelecekteki iş kar amacı gütmeyen kullanım için olacak istenebilir. Tam ELP amino asit dizisi...

Son yüzyıl içinde iki boyutlu (2D) doku kültürü temel hücre biyolojisi vitroçalışmak için ayrılmaz bir araç haline geldi. Ayrıca, 2D hücre kültürü için nispeten ucuz ve basit protokoller kabulünün için birçok biyolojik ve tıbbi disiplinler arasında açmıştır. Bununla birlikte, araştırmaları bu toplanan vivo içindegelen belirgin sapma, değerli zaman ayrılır ve fon klinik olarak odaklı araştırma1,2içinboşa olduğunu geleneksel 2D platform sonuçlara yol açabilir göstermektedir, 3. Bu tutarsızlık en uygun yayılması ve çeşitli hücre tiplerinin olgunlaşma için gerekli olabilir 2D yüzeylerde kültürlü hücrelere sağlanan yerel Biyokimya ve biyofizik cues eksikliği ilişkilendirilebilir ki biz ve diğerleri öngörmekteyiz.
Bu sınırlamalar ve yardım Köprüsü 2D arasındaki boşluğu gidermek için Gelişmiş üç boyutlu (3D) hidrojel platformlar için hücre-kapsülleme1,4,5 vitro ve in vivo çalışmalar, araştırmacılar var ,6. Hydrogels doku gibi mekanik özellikleri ve besinlerin hızlı ulaşım sağlar su şişmiş yapısı nedeniyle hücre dışı matriks (ECM) vivo endojen microenvironment özetlemek için ideal maddeler olduğunu ve sinyal7,8faktörler. Ayrıca, 3D hydrogels iskele mekanik ve biyokimyasal özelliklerinin üzerinde bağımsız denetim sağlamak için tasarlanabilir. Matris mekaniği9,10,11,12 ve hücre yapışkanlı ligandlar13,14,15 hücre etkilemek için iyi bilinen davranış vitro ve içinde vivo. Böylece, ayarlanabilir özellikleri ile 3D hydrogels hücreler ve onların microenvironment arasındaki nedensel ilişkiyi incelemek için bir platform sunuyoruz. Bir ideal 3D hidrojel matris için ölçüt basit, Sigara sitotoksik hücre kapsülleme yanı sıra fizyolojik ilgili mekanik özelliği bağımsız ayar ve taklit eder yerel hücre yapışkanlı motifler içerir.
Her iki sentetik (Örn., Polietilen glikol, polylactic asit, poli (Glikolik asit)) ve doğal olarak elde edilen (e.g., aljinat, kollajen, Matrigel) hydrogels var avantajları 2D vitro kültür platformlarına; Ancak, aynı zamanda onların uygulanabilirliği sınırı önemli eksiklikleri var. İlk, birçok sentetik ve doğal olarak elde edilen platformlar memeli hücrelere potansiyel olarak toksik olabilir sert crosslinking koşullar gerektirir, önde gelen azalma hücre canlılığı7. Ayrıca, birçok sentetik platformlar yerli bioactivity eksikliği ve artan maliyetini ve karmaşıklığını16ekleyebilirsiniz ikincil kimyasal reaksiyonlar ile functionalized gerekir. Son olarak, doğal olarak elde edilen malzemeler genellikle iç biyo-aktif etki alanları içerir iken, onlar sık sık yüksek toplu iş toplu iş değişkenlik tarafından boğulmuş ve genellikle nispeten zayıf jelleri7,17şekillendirme için sınırlıdır.
Protein sıra üzerinde açık denetime izin vererek Rekombinant protein mühendislik malzemeleri tasarımı için benzersiz bir araç seti sunar ve uzatma tarafından son hidrojel potansiyel mekanik ve biyokimyasal özelliklerinin18İskele yapısı. Ayrıca, Escherichia coli (e.coliproteinler ifade etmek için) iyi bilinen biyolojik makine yararlanarak, malzemeler düşük maliyetle ve tutarlı bir şekilde sınırlı Inter - ve içi-toplu değişkenliği ile üretilmektedir. Burada sunulan elastin benzeri protein (ELP) üç mühendislik etki alanı vardır: (1) bir T7 ve His6 etiket etiketleme yoluyla fluorescently antikorlar öğesini için izin veren, elastik mekanik özellikleri confers ve kimyasal için izin veren (2) bir 'elastin-gibi' bölgesi Crosslinking ve (3) hücre yapışkanlı motifler için kodlar 'biyo-aktif' bölge.
Elastin benzeri bölgemizde nerede dört 'xaa' amino asit siteleri isoleucine (Ile), ama olabilir herhangi bir amino asit prolin hariç olacak şekilde kurallı (Val-Pro-Gly-Xaa-Gly)5 elastin sırasını temel alır. Bu sıra rekombinant ELPs19,20Bisiklete binme termal üzerinden basit arıtma sonrası ifade için istismar alt kritik çözüm sıcaklık (LCST) davranışı ile endows. Bu LCST özelliği termal olarak toplamak için farklı sıcaklıklarda Konuk 'Xaa' kalıntı21,22değiştirerek ayarlanabilir.
Burada, bir beş elastin benzeri tekrarlar 'Xaa' konumuna hidrojel crosslinking için kullanılmaktadır Amin sunulması (Lys) lizin amino asit ile değiştirilmiştir. Önceki çalışmalarımız sitotoksik sigara ve sağlam crosslinking Amin-reaktif crosslinker tetrakis (hydroxymethyl) phosphonium klorür (THPC)23ile reaksiyonu ile göstermiştir. Değişen toplam protein içeriği ve crosslinker konsantrasyon tarafından bir fizyolojik ilgili sertlik aralığı (~0.5-50 kPa)9,23,24span için ayarlanan hydrogels üretmek edebiliyoruz. Mekanik özellikleri ayarlama ek olarak, hücre adezyon hidrojel içinde ELP protein omurga içinde kurallı hücre yapışkanlı etki alanlarının entegrasyonu kaynaklanır. Örneğin, genişletilmiş fibronektin kaynaklı 'RGDS' amino asit dizisi birleşme hücre adezyon ve şifreli, süre konformasyon esneklik sağlar bağlayıcı 'RDGS' değişken hücre-matris yapışması24kısıtlar. Hücre-Yapıştırıcı Yapıştırıcı proteinler hem de toplam protein konsantrasyonu oranını modüle tarafından biz etkili ligand konsantrasyonu geniş bir yayılma hydrogels üretmek edebiliyoruz. Sonuçta, bir hidrojel platform bağımsız olarak çeşitli hücre tiplerinin en iyi 3D kültür için ayarlanan bilgisini iletmiyor biyokimyasal ve biyofiziksel özellikleri ile geliştirdik.
Matris sertlik ve yapışkanlı ligand ayar ek olarak, rekombinant hydrogels hücre yayılan, yayılması ve 3D içerik4 içinde geçiş için gerekli olan tasarım belirli malzeme bozulması profilleri, yeteneği teklif , 9. bu bozulma özellikle genişletilmiş 'RGDS'9 veya elastin benzeri sıra25hedef proteaz hücre salgılanmasını tarafından tanınan. ELP hydrogels hücre canlılığı ve işlev immunocytochemistry yanı sıra DNA/RNA/protein ayıklama nicel reverse için de dahil olmak üzere eğitim için gerekli olan sonraki biyokimyasal testleri desteklemek için de gösterilmiş olan Transkripsiyon-polimeraz zincir tepkimesi (PCR qRT) ve Western blot9. ELP türevleri de vivo içinde modeller bir dizi kullandık ve bağışıklık sistemi26tarafından iyi tolere bilinmektedir.
Hücre-kapsülleme çalışmaları için malzeme bir platform çok çeşitli yararları genellikle Biyokimya ve biyofizik ayar aynı derecede eksikliği sentetik veya doğal olarak elde edilen malzeme platformları için karşılaştırıldığında sahiptir olarak birlikte, ELP alınan ve tekrarlanabilirlik. Ayrıca, ELP'ın basit ve sitotoksik sigara kullanımı ile çok çeşitli hücre tiplerinin (Örn., piliç dorsal kök gangliyon14,24, fare nöral progenitör hücre9, insan mezenkimal kök hücrelerin27, sığır Yenidoğan kondrosit28, insan endotel hücreleri29,30) 2D hücre kültürü için karşılaştırıldığında endojen 3D ECM daha fizyolojik ilgili bir model sağlar. Burada, biz recombinantly türetilmiş bir ifade için bir iletişim kuralı mevcut, kapsülleme ELPs tunable hidrojel platformu olarak kullanmak için 3D hücre. Biz daha fazla metodoloji ve kapsüllenmiş hücre confocal mikroskobu aşağı akışı floresan etiketleme için mevcut.

<table><tbody><tr><td><güçlü>Elastin Benzeri Protein Ekspresyonu ve Saflaştırma</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 cm Petri Kapları</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>%70 Etanol</td><td>RICCA Chemical</td><td>2546.70-1</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum Sülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3920-500G</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1760-25G</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>9002-18-0&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3)pLysS Yetkin Hücreler</td><td>İnvitrojen</td><td>C606003</td><td></td></tr><tr><td>Kloramfenikol</td><td>Amresco</td><td>0230-100G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sığır pankreasından deoksiribonükleaz I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>EDTA disodyum tuzu, dihidrat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>O2793-500</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP229-4</td><td></td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A451-4</td><td></td></tr><tr><td>İzopropil &beta;-D-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1755-10G</td><td></td></tr><tr><td>Luria Suyu</td><td>EMD Millipore</td><td>1.10285.5007</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetansülfonil florür (PMSF)</td> <td>MP Biyomedikal</td><td>195381</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Hidroksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S 8045-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga Filtre Ünitesi (0.22 &mu; m)</td> <td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>Müthiş Et Suyu</td><td>Millipore</td><td>71754-4</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td><3D ELP Hidrojellerde güçlü>Hücre Kapsülleme< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 & mu; m şırınga filtreleri</td><td>Millipore</td><td>SLGV004SL</td><td></td></tr><tr><td>0,5 mm kalınlığında silikon levha</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimi</td><td>70338-05</td><td></td></tr><tr><td>24 oyuklu doku kültürü plakaları&nbsp;</td><td>Corning</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Biyopsi Punch (2 mm)</td><td>Integra Miltex</td><td>33-31</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Biyopsi Punch (4 mm)</td><td>Integra Miltex</td><td>33-34</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Biyopsi Punch (5 mm)</td><td>Integra Miltex</td><td>33-35</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s fosfat tamponlu salin (DPBS)&nbsp;</td><td>Corning</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>No. 1 12 mm cam lameller</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>Tetrakis (hidroksimetil) fosfonyum klorür (THPC)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>404861-100ML</td><td></td></tr>% <tr><td>0.5 Tryspin / EDTA</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>3D ELP Hidrojellerde Hücrelerin İmmünositokimyası< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>% 16 (a / h) Paraformaldehit (PFA)</td> <td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>15701</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümini (BSA)</td> <td>Roche</td><td>3116956001</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroklorür)</td> <td>Moleküler Problar</td><td>D1306 ve nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Eşek Serumu</td><td>Lampire Biyolojik Laboratuvarları</td><td>7332100</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-fare İkincil Antikoru (AF488)</td><td>Moleküler Problar</td><td>A-11017</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-tavşan İkincil Antikoru (AF546)</td><td>Moleküler Problar</td><td>A-11071</td><td></td></tr><tr><td>Keçi Serumu</td><td>Gibco</td><td>16210-072</td><td></td></tr><tr><td>Fare Nestin Birincil Antikoru</td><td>BD Pharmingen</td><td>556309</td><td></td></tr><tr><td>Fare Sox2 Birincil Antikor Hücre</td><td>Sinyal Teknolojisi</td><td>23064S</td><td></td></tr><tr><td>Oje Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Hardset Montaj Ortamı&nbsp;</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>H-1400&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

elastin benzeri protein hydrogels üretimi için saklama ve immunostaining hücre 3d

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

İki boyutlu (2D) doku kültürü teknikleri temel hücre biyoloji anlayışımız için gerekli olmuştur. Ancak, geleneksel 2B doku kültürü sistemleri olmaması önemli bir sonuçlanan bir üç boyutlu (3D) matris kesin-den sonuçlanmak arada toplanan vitro ve içinde vivo. Bu sınırlamaya yönelik olarak, araştırmacılar-si mühendislik in vivo hücre microenvironment Biyokimya ve biyofizik özelliklerini taklit edebilirsiniz 3D hidrojel doku kültürü platformlar. Bu araştırma gerek 3D hücre saklama ve aşağı akım biyokimyasal testleri destek malzeme platformlar geliştirmek için motive vardır. Rekombinant protein mühendisliği protein sıra ayrıntılı denetim için izin vererek ve bu nedenle, dolayısıyla, sonuç potansiyel mekanik ve biyokimyasal özelliklerinin 3D hidrojel malzemesi tasarım ve geliştirme için benzersiz bir araç seti sunar matris. Burada, bağımsız olarak ayarlanabilir mekanik özellikleri ve hücre yapışkanlı ligand konsantrasyonu ile form hydrogels için kullanılan recombinantly türetilmiş elastin benzeri protein (ELP), bir ifade için bir iletişim kuralı mevcut. Daha fazla hücre kapsülleme ELP hydrogels içinde için bir metodoloji sunmak ve sonraki immünfloresan boyama, hücreleri aşağı akım Analizi ve miktar için gömülü.

Bu protokol için kullanılan ELPs beş bölgelerinde oluşmaktadır: T7 etiketi, His6 etiketi, enterokinase (EK) bölünme sitesi, biyo-aktif bölge ve elastin benzeri bölge (Şekil 1). T7 ve His6 Etiketler standart Western blot teknikleri ile kolay tanımlanması için izin verir. EK bölünme sitenin giriş gerekirse etiket bölge enzimatik kaldırılması için izin verir. Biyo-aktif bölge genişletilmiş, fibronektin türetilmiş hücre-yapıştırıcı ('RGDS') veya non-yapıştırıcı (...

Polimer omurga ve bu nedenle, hücre microenvironment tam ayar için izin olarak Rekombinant protein mühendislik hydrogels 3D hücre kültürü için avantajlı olan. Burada, rekombinant elastin benzeri protein arıtma süreci ve kendi uygulamasında 3D hidrojel hücre kapsülleme açıklanmaktadır.

Elastin benzeri Protein Hydrogels üretimi için saklama ve Immunostaining hücre 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

Bu protokolün genel amacı, 3D hücre kapsüllemesi için ayarlanabilir bir hidrojel olarak kullanılmak üzere rekombinant olarak türetilmiş elastin benzeri proteinleri eksprese etmek ve saflaştırmaktır. Ek olarak, bu protokol, kapsüllenmiş hücrelerin konfokal mikroskobunda aşağı akış floresan etiketleme metodolojisini sunar. Bu yöntem, hücre-hücre dışı matris etkileşimlerinin 3D'deki rolünü anlamak gibi biyomalzemeler, rejeneratif tıp ve hücre biyolojisi alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu tekniğin temel avantajı, çoklu hücre tiplerinin incelenmesine uygun, tekrarlanabilir, ayarlanabilir ve modüler bir malzeme platformu sağlamasıdır. Genel olarak, bu tekniğin uygulanması, gelecekteki hücre bazlı rejeneratif tedavilerin başarısını belirleyebilecek kritik hücre ECM sinyal parametreleri hakkındaki anlayışımızı geliştirebilir. İlgilenilen ELP'yi kodlayan bir vektör içeren önceden hazırlanmış bir bakteri stoğu ile bir ampisilin ve kloramfenikol agar plakası çizin.Ardından, bakteri üremesine izin vermek için çizgili plakayı gece boyunca 37 santigrat derecede baş aşağı inkübe edin. Ertesi gün, plakadan tek bir koloni seçin ve önceden ısıtılmış başlangıç kültürünü

production-elastin-like-protein-hydrogels-for-encapsulation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Biz, sentetik hidrojeller içinde hücreler 3 boyutlu (3D) kapsülleme için protokolleri mevcut. Kapsülleme işlemi kapsüllü hücre davranışlarını değerlendirmek için iki yaygın olarak kullanılan çapraz bağlanma yöntemleri (michael-tipi hafif başlatılan ek ve serbest radikal mekanizmaları) yanı sıra bir dizi teknik özetlenmiştir.

Doku Mühendisliği 3D Hidrojeller Hücresel Kapsülleme

Bu videoda, bir 3D hidrojel içinde kapsüllenmiş hücrelerin immün boyama tekniği gösterilmektedir. Nöral progenitör hücreleri içeren hidrojel kültürü sabitlenir, geçirgen hale getirilir ve spesifik olmayan immün boyamayı önlemek için bir bloke edici çözelti ile muamele edilir. Spesifik proteinleri bağlamak için bir birincil antikor kokteyli eklenir, ardından floresan olarak etiketlenmiş ikincil antikorlar ve bir nükleer leke eklenir. Numune daha sonra bir lam üzerine monte edilir ve konfokal bir...

3D hidrojel sisteminde kapsüllenmiş hücrelerin immün boyalanması

Kolajen ECM temel bir bileşenidir ve göç farklılaşma ve çoğalması kadar çeşitli hücresel süreçler için gerekli ipuçları sağlar. 3D kolajen hidrojellerin içinde hücreleri gömmek için bir protokol ve PDMS mikrokanallar kullanılarak randomize veya hizalanmış kollajen matrisleri oluşturmak için daha gelişmiş bir teknik burada sağlanmıştır.

3D Etkileşimleri Çalışmaları 3D Kollajen jeller ve Mikrokanallarda Hazırlanması<em&gt; İn Vivo</em

Üç boyutlu hücre kültürü uygulamaları için sentetik hidrojel matrislerinin ışık aracılı oluşumu ve ardından biyokimyasal modellemesi için sıralı bir süreci tanımlıyoruz. Hidrojellerin sitouyumlu fototıklama kimyası ile yapımı ve modifikasyonu gösterilmiştir. Ek olarak, bu hidrojeller içindeki kalıpları ölçmek ve gözlemlemek ve hücre canlılığını belirlemek için basit teknikler sunulmaktadır.

Hücre Kültürü Uygulamaları için Hidrojeller Işık aracılı Oluşumu ve Desenlendirme

Bu akciğer hücre dışı matristen 3 boyutlu hücre kültürü iskele oluşturmak için bir yöntemdir. Bozulmamış akciğer üç boyutlu hücrelerin büyümesini destekleyen hidrojeller olarak işlenir.

3D Hücre Kültürü için Pulmoner Ekstrasellüler Matrix Ayarlanabilir Hidrojellerinin

Protein bazlı hydrogels üç boyutlu mimarisinde işlemek için farklı yöntemler burada malzeme özellikleri ile ilgili olarak değerlendirilir. Macroporous ağlar ile bir hücre yapışkanlı peptid functionalized ve onların fizibilite hücre kültüründe iki farklı model hücre hatları kullanılarak hesaplandı.

Protein bazlı Hydrogels mimarilerde kolayca idare hücre kültür uygulamaları için

Bu iletişim kuralı elastik 3D macroporous microcryogels imalatı microfabrication cryogelation teknolojisi ile entegre ederek açıklar. Hücrelerle yükleme üzerine, 3D microtissues, hangi rejeneratif terapi kolaylaştırmak için kolayca enjekte içinde vivo olabilir veya diziler vitro yüksek üretilen iş uyuşturucu tarama için içine monte oluşturulur.

Enjekte edilebilir rejeneratif terapi ve yüksek-den geçerek uyuşturucu tarama için 3D Microtissues

Burada facile hazırlanması enjekte edilebilir hydrogels kitosan tabanlı dinamik imin kimya kullanarak açıklar. Hidrojel'ın mekanik mukavemeti ve 3D hücre kültürü kendi uygulamasında ayarlamak için yöntemleri sunulmaktadır.

Kitosan-esaslı enjekte edilebilir Hydrogels ve kendi uygulamasında 3D hücre kültürü hazırlanması

Hidrojel oluşumu sırasında kesme işlemi, kesme kuvvetlerinin giderilmesini takiben kesme inceliğinde ancak hızla yeniden yapılandırılan mikrojel süspansiyonlarının üretilmesiyle sonuçlanır. Bu tür malzemeler, biyobaskı kompleksi, hücre yüklü yapılar için destekleyici bir matris olarak kullanılmıştır. Burada, destekleyici yatağın ve uyumlu biyomürekkeplerin üretiminde kullanılan yöntemler açıklanmaktadır.

Askıda 3D biyobaskı için jelasyon sırasında kesme işlemi ile oluşturulan agaroz sıvı jelleri

Bu makale, hücre dışı matris sertleşmesini ve fibroblast aktivasyonunu incelemek için fototize edilebilir hidrojellerin 3D biyo-baskısının nasıl yapılacağını açıklamaktadır.

Fibroblast Aktivasyonunu İncelemek için 3D Biyobaskı Fototable Hidrojeller

Hücre dışı matriks (ECM) sertliği hücresel davranışın temel düzenleyicisi olsa da, altta yatan algılama ve transdüksiyon mekanizmaları belirsizdir. Bunu ele almak için, hücre-ECM çapraz konuşmasını anlamamızı ilerletmek için ayarlanabilir sertliğe sahip poliakrilamid ve silikon bazlı substratlar oluşturmak için protokoller sunuyoruz.

Hücre Biyolojisi Uygulamaları İçin Tanımlanmış Sertlikte Poliakrilamid ve Silikon Ekstrasellüler Matris Substratlarının Üretimi

Öğrenin, elastin benzeri proteinleri ifade edip saflaştırarak 3D hücre kapsülasyonu için ayarlanabilir hidrojeller üretin. Bu yöntem, biyomalzemeler ve rejeneratif tıp alanlarında hücre-ekstraselüler matris etkileşimlerini incelemenizi sağlar.

Elastin benzeri Protein Hydrogels üretimi için saklama ve Immunostaining hücre 3D

Daha fazla video keşfet