Name: Taze ve donmuş Gastrointestinal örnekleri üzerinden hücre altı ayırma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Öğrenin, gastrointestinal biyopsilerden sitoplazmik ve nükleer proteinleri ayırmak için hücre altı fraksiyonlama yöntemini. Taze ve donmuş örneklerle tekrarlanabilir protein lokalizasyon analizi yapın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Ander Lopez ve Miren Telletxea yardım video kayıt ve düzenleme için kabul. ACR Ikerbasque arkadaş grubu ve bir araştırma projesi Asociación de Celiacos Madrid (ACM) tarafından finanse edilmektedir. JRB proje ISCIII-PI16/00258 tarafından finanse edilen ve Avrupa Birliği ERDF/ESF tarafından "Avrupa nın yolunu" ortak finanse. Bu bir araştırma projesi hibe Bask Sağlık Bakanlığı tarafından 2015111068 finanse edilmektedir. IRG ve AJM HGUGM bursu hibe UPV/EHU ve Bask Department of Education, sırasıyla destekler.

Bu çalışmada Cruces Üniversitesi Hastane etik kurulu tarafından kabul edildi ve aydınlatılmış onam tüm konular ya da aileleri elde sonra analizleri gerçekleştirilmiştir.
1. biyopsi koleksiyonu
Not: Biyopsi örnekleri hastaların distal duodenum dan bu aralıktaki arasında 2 ve 10 mg kilo biyopsi yönetme rutin tanı endoskopi sırasında elde edilir. Biyopsi doku, bağışıklık epitel ve endotel hücreleri de dahil olmak üzere farklı hücre türleri oluşan karmaşık bir dokudur. Klinik gastroenterologlar endoskopi gerçekleştirmek aşağıdaki kurulan klinik yönergeleri.
<ol><li>Biyopsi endoskopi sonra steril bir filtre kağıdı yerleştirin.</li>
	<li>Forseps biyopsi 1,5 mL tüpler transfer için PBS ile ıslatın ve bir cryotube koyun kullanın.</li>
	<li>Laboratuarda gelene tüpler buz üzerinde tutun.<ol>
<li>Taze biyopsileri hemen işleme başlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Donmuş biyopsileri, flaş tüpler içeren biyopsi donma ve sıvı azot kadar kullanmak saklarız. Not: Soğuk desteklenmiştir arabellek 1 eklenene kadar donmuş örnek tutmak önemlidir.</li>
</ol>2. arabellek hazırlık
Not: başlamadan önce arabellekleri aşağıdaki gibi ek.
<ol><li>1 mM DTT (son konsantrasyonu) ekleyin ve proteaz ve fosfataz inhibitörü kokteyl (1 son konsantrasyonu x) 1 ve hipertonik hipotonik tampon tampon 2 (Tablo 1).<ol>
<li>Arabellek 1 ve 150 µL arabelleğinin 2 örnek başına 1,5 mL hazırlayın. DTT örnekleri oksidasyonunu engeller.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Çekirdeklerin yıkama arabellek % 1 deterjan (nonil phenoxypolyethoxylethanol) ekleyerek zaten desteklenmiştir arabelleğine %1 0.1 son bir konsantrasyon için hazır olun. 1 mL örnek başına çekirdek yıkama tamponunun hazırlayın.</li>
</ol>3. biyopsi homojenizasyon
<ol><li>
Taze biyopsi
	<ol>
<li>Tek kullanımlık havaneli motorlu Mikser yerleştirin. Havaneli tüp alt ulaştığından emin olmak.</li>
		<li>Biyopsi cryotube çıkar ve bir pipet ucu ile 1,5 mL tüp yerleştirebilirsiniz.</li>
		<li>200 µL desteklenmiştir arabelleği 1 1,5 mL tüp ekleyin.</li>
		<li>Doku tamamen bozulur kadar biyopsi havaneli ile homojenize ve buz üzerinde tutun.</li>
		<li>Bir kez tüm biyopsiler homojenize adım 4 ile devam edin. Not: Tek kullanımlık dibekler biyopsi arasında değiştirilmesi gerekir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Donmuş biyopsi Dikkat: sıvı azot dikkatle ele; sıvı azot ile cilt veya gözlerle temas ciddi donma yaralanmalara neden olabilir. Eller ve gözler her zaman sıvı azot ile çalışırken korumak.<ol>
<li>Bazı sıvı azot azot tankından alındı cryotubes depolamak için bir kutu almak.</li>
		<li>Biyopsi azot depoda bulun ve sıvı azot ile kutusunda cryotube takın. Biyopsi için bu adımı yineleyin.</li>
		<li>Biyopsi cryotube 1.5 mL tüp aktarın. Not: Biyopsi için dondurulmuş Tüp bağlı olacak. Tüm tüpünden ayırarak biyopsiyi steril pipet ucu ile itmek.</li>
		<li>200 µL desteklenmiştir arabelleği 1 ekleyin.</li>
		<li>Doku havaneli ve harç doku tamamen bozulur kadar kullanarak, tüm prosedürü boyunca 4 ° C sıcaklıkta muhafaza lunaparkçı. Not: arabellek eklemeden önce çözülme biyopsi izin vermeyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. sitoplazma yalıtım
<ol><li>10 dakika buzda homojenize biyopsi kuluçkaya.</li>
	<li>Her örnek % 0.05 son bir konsantrasyon için 10 µL % 1 deterjan (nonil phenoxypolyethoxylethanol) ekleyin. Not: Hücreleri şişmeye ve hafif deterjan hücre zarı bozabilir olacaktır gibi ozmotik lizis tarafından patladı.</li>
	<li>Buz üzerinde 5 dakika kuluçkaya.</li>
	<li>Kısaca girdap ve 2 min için 4 ˚C'de 400 x g, santrifüj.</li>
	<li>Vortexing sonra süpernatant kaldırmak ve yeni bir temiz 1.5 mL tüp transferi; Bu sitoplazmik kesir olacak. Pelet atmayın.</li>
</ol>5. nükleer yalıtım
<ol><li>Pelet 200 µL çekirdeği yıkama arabelleği ile önceki adımdaki resuspend.</li>
	<li>Tüp 400 x g ve 4 ° c de 2 dk santrifüj kapasitesi</li>
	<li>Süpernatant atın ve iki kez daha çamaşır yordamı yineleyin. Not: Yıkar nükleer kesir sitoplazmik kirlenme kaldırmak olacaktır.</li>
	<li>Sonra üçüncü yıkama, Pelet arabellek 2 100 µL içinde resuspend.</li>
	<li>Örnek 4 ˚C 30 dakika süreyle, alternatif olarak shake şiddetle, örnek buz ve girdap her 5 dk üzerinde kuluçkaya.</li>
	<li>Sallayarak sonra örnek üst hızda 10 dk santrifüj kapasitesi (> 12.000 x g) ve 4 ° c</li>
	<li>Vortexing sonra yeni bir temiz 1.5 süpernatant aktarın. mL tüp. Bu nükleer kesir olacak.</li>
</ol>6. protein miktar
Not: bir bicinchoninic asit (BCA) protein tahlil kiti ile proteinler ölçmek. Kesirler proteinlerin konsantrasyonu 0.5 ve 5 µg/µL, nükleer kesir daha düşük olma arasındaki aralığı olacaktır (bkz. protein konsantrasyonları 2 mg biyopsi sonuç için Tablo 2 ).
<ol><li>Aşağıdaki Sığır serum albumin (BSA) tutarların (µg)12ile standart bir eğri hazırlamak: 0-0.5-1-2-3-4-5-6.</li>
	<li>Son BCA Mix örnek başına 100 µL kullanmak için gerekli reaktifler hazırlayın.</li>
	<li>Her protein fraksiyonu 96 iyi plaka 2 µL pipet, BCA karışımı ekleyin ve okumak için üreticinin yönergelerini izleyin.</li>
</ol>

<ol><li>Cox, B., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+subcellular+fractionation+and+protein+extraction+for+use+in+mass-spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1872-1878 (2006).</li>
<li>Itzhak, D. N., Tyanova, S., Cox, J., Borner, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+quantitative+and+dynamic+mapping+of+protein+subcellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Global, quantitative and dynamic mapping of protein subcellular localization.</a> eLife. 5, (2016).</li>
<li>Preedy, V. R., Watson, R. R., Ronald, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPreedy%2C+VR+%22Methods+in+disease+investigating+the+gastrointestinal+tract%22">Methods in disease investigating the gastrointestinal tract</a>. , Greenwich Medical Media. (1998).</li>
<li>Alex, P., Gucek, M., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+proteomics+in+the+study+of+inflammatory+bowel+diseases%3A+Current+status+and+future+directions+with+available+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+bowel+diseases%22%5BJournal%5D)">Applications of proteomics in the study of inflammatory bowel diseases: Current status and future directions with available technologies.</a> Inflammatory bowel diseases. 15 (4), 616-629 (2009).</li>
<li>Ericsson, C., Franzén, B., Nistér, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frozen+tissue+biobanks.+Tissue+handling%2C+cryopreservation%2C+extraction%2C+and+use+for+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+oncologica+%28Stockholm%2C+Sweden%29%22%5BJournal%5D)">Frozen tissue biobanks. Tissue handling, cryopreservation, extraction, and use for proteomic analysis.</a> Acta oncologica (Stockholm, Sweden). 45 (6), 643-661 (2006).</li>
<li>Hoffmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+application+of+a+subcellular+fractionation+method+to+kidney+and+testis+for+the+determination+of+conjugated+linoleic+acid+in+selected+cell+organelles+of+healthy+and+cancerous+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">New application of a subcellular fractionation method to kidney and testis for the determination of conjugated linoleic acid in selected cell organelles of healthy and cancerous human tissues.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 381 (6), 1138-1144 (2005).</li>
<li>Foster, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mammalian+Organelle+Map+by+Protein+Correlation+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Mammalian Organelle Map by Protein Correlation Profiling.</a> Cell. 125 (1), 187-199 (2006).</li>
<li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, e440-e445 (2015).</li>
<li>Börner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+protein+extraction+from+human+pancreatic+cancer+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Subcellular protein extraction from human pancreatic cancer tissues.</a> BioTechniques. 46 (4), 297-304 (2009).</li>
<li>Antalis, T. M., Shea-Donohue, T., Vogel, S. N., Sears, C., Fasano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+disease%3A+protease+functions+in+intestinal+mucosal+pathobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+clinical+practice.+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of disease: protease functions in intestinal mucosal pathobiology.</a> Nature clinical practice. Gastroenterology. 4 (7), 393-402 (2007).</li>
<li>Cutler, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCutler%2C+P+%22Protein+purification+protocols%22">Protein purification protocols</a>. , Humana Press. (2004).</li>
<li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bicinchoninic+Acid+%28BCA%29+Assay+for+Protein+Quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Protein+Protocols+Handbook%22%5BJournal%5D)">The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation.</a> The Protein Protocols Handbook. , 11-14 (1996).</li>
<li>McLane, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+localization+of+T-bet+and+Eomes+in+CD8+T+cell+memory+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology+%28Baltimore%2C+Md.%3A+1950%29%22%5BJournal%5D)">Differential localization of T-bet and Eomes in CD8 T cell memory populations.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 190 (7), 3207-3215 (2013).</li>
<li>Nguyen, K. T., Holloway, M. P., Altura, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRM1+nuclear+export+protein+in+normal+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+biochemistry+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">The CRM1 nuclear export protein in normal development and disease.</a> International journal of biochemistry and molecular biology. 3 (2), 137-151 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada açıklanan protokolü bağırsak biyopsisi nükleer ve sitoplazmik ayırma için kullanılır. Saf protein denatüre değil ve sadece Şekil 2 ve 3 ' te ama aynı zamanda immunoprecipitation, elektroforetik hareketlilik üst karakter tahlil (Emsan) gibi yerli katlanmış proteinlerin gerektiren deneyleri içinde gösterildiği gibi Batı leke analiz kullanılabilir veya yerli polyacrylamide jel elektroforez (sayfa).
Açıklanan yöntemi ile birlikte nükleer membra...

Bir hücre içinde hemen hemen tüm biyolojik fonksiyonları proteinler katılmak ve herhangi bir varyasyon kendi yapısı, miktar veya konumu patojenik bir senaryo için neden olabilir. Doku örneği ayırma yöntemleri çoğu hastalık karmaşıklığını azaltmak için yararlı bir yaklaşım ile ilgili protein analizleri. Bazı çalışmalarda protein yerelleştirme bilgileri kullanın veya belirli bir hücresel bölme bir protein olduğu gibi proteinlerin tekrarlanabilir ayırma için bir protokol biyolojik bazı soruları cevaplamak yararlı bu yüzden zenginleştirmek. Proteinlerin hücre altı yerelleştirme belirleme ve kendi compartmental yeniden dağıtım veya etkileşimler, bazal izleme ve hastalık koşulları hastalığı tanımlamak yardımcı olacak ilgili işlevsel farklılıklar1,2. Bu nedenle, bu yöntem tekrarlanarak bağırsak doku biyopsisi, taze ve donmuş, sitoplazmik ve nükleer hücre altı bölmeleri içine fractionate amaçlamaktadır.
Bağırsak biyopsisi örnekleri rutin olarak endoskopi işlemleri3 sırasında (Şekil 1) elde edilen ve etkin bir şekilde protein miktar veya immunoprecipitation çalışmalar için kullanılabilir. Epitel doku örnekleri bağırsak üzerinden doğrudan hastalık patogenezinde4' te tutulabilir proteinler içerdiğinden, bağırsak biyopsisi bağırsak hastalığa özgü başarılı tanımlanması için çok değerli bir kaynak olduğu proteinler. Saklı donmuş, hasta doku örnekleri klinik bilgilerinin yanı sıra protein analizi için yararlı kaynak vardır ve bir basit ve tekrarlanabilir numune hazırlama sınırlayıcı miktarda kullanarak hücre compartmental bilgileri sağlamak için önemli bir konudur dondurulmuş doku5.
Hücresel kesirler ayrılması için birkaç piyasada kitleri vardır, ama bunlar daha pahalı ve genellikle daha fazla zaman alıcı burada sunulan protokolü daha. Birden fazla adımlı degrade Santrifüjü protokolleri temel ve sürekli degradeler da daha önce farklı dokuların6,7farklı hücresel kompartmanlarda ayırma için kullanılmıştır. Ancak, sürekli degradeler tutarlılığını sağlamak kez zor bir iştir. Membranlar sıralı lizis üzerinde dayalı benzer iletişim kuralları daha önce tarif var ama onlar genellikle ikiden fazla arabellekleri ve gerekir zaman ellerde uzun8 .
Doku örnekleri parçalanması zaman, o doku protein ayıklama için devam zaman kültürlü hücreleri mevcut hem önemli örnekleri mevcut hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimleri unutmayın. Hücreleri ve hücre dışı matriks protein kalitesini etkilemeden arasında uygun arıza bağırsak dokusu protein yalıtım9kritik bir etken olacaktır. Bu protokol için hücre-hücre ve hücre-matris kişiler ilk kırık, hücreleri serbest ve tek tek hücreler ulaşmak için tampon izin vardır. Protein-yuvası ayırma önce karıştırma önlemek için kişileri dökümünü hücreleri veya nükleer membran bütünlüğü değiştirmeden bulunması gerekir.
Bağırsak mukoza10çeşitli proteaz zenginleştirme nedeniyle, protein yıkımı ayıklama sırasında kontrol etmek önemlidir. Potansiyel protein yıkımı en aza indirmek için birden çok proteaz inhibitörü protein ayıklama arabellekleri içinde dahil edilmesi gerekir. Ayrıca, özleri fonksiyonel deneyleri için kullanılmak üzere kullanacaksanız, bu protein etkinliği11kaybına neden olur gibi proteinler veya proteolizis denatürasyon önlemek önemlidir. Bu amaçla, protokol 4 ° C'de gerçekleştirilir ve taze phenylmethylsulfonyl florür (PMSF) 0.1 mM daha fazla proteolizis etkisizleştirmek için kullanmak için sadece önceki son bir konsantrasyon, arabellekleri eklenir.
İlk hücre ayırma doku bozulması ve hücre lizis adımıdır. Daha önce de belirtildiği gibi hücreler ve onları en az hasar ile açık kırıldığını disaggregate hedefidir. Bağırsak doku örnekleri homojenize gerekir ve hücreleri hücre zarı maksimum kırılma elde etmek için lysed. Bu protokol için saniye içinde yüksek hızlı vortexing eylem yoluyla homojenize bağırsak dokusu kırmak için bir motorlu havaneli karıştırıcı kullanın. Homojenizasyon sonra doku hücreleri hücre zarı patlama olacak ama çekirdeklerin olduğu gibi bir sigara denaturing deterjan (nonil phenoxypolyethoxylethanol) ve çekirdekleri ayırmak için kısa bir girdap eklenmesi tarafından takip devam edecek hipotonik, arabellek içinde inkübe sitoplazmik kesir. Sitoplazma kaldırıldıktan sonra sallayarak ile hipertonik bir arabellek içine hücre çekirdek zarı patladı.
Burada sunulan yöntemi endoskopik yordamlar ve Aralık içinde ağırlık 2 ve 10 mg arasında sırasında elde edilen taze ve donmuş bağırsak biyopsisi hücre altı ayırma için uygun bir yöntemdir. İletişim kuralı kolay ve tekrarlanabilir ve temel laboratuvar donatım ve bir saat içinde reaktifler kullanarak gerçekleştirilebilir.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034-1kg</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333-1kg</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5588886-1kg</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Termo Bilimsel</td><td>36978</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz ve fosfataz inhibitörleri</td><td>Thermo Scientific</td><td>A32959</td><td></td></tr><tr><td>NP-40&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CA-630</td><td>Deterjan</td></tr><tr><td>BCA testi</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td>Protein miktar tayin kiti</td></tr><tr><td>Tek kullanımlık plastik tokmaklar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z359947-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Dounce homojenizatör</td><td>VWR</td><td>431-0100</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5415-R</td><td></td></tr><tr><td>Shacker</td><td>IKA</td><td>MS3 temel</td><td></td></tr></tbody></table>

taze ve donmuş gastrointestinal örnekleri üzerinden hücre altı ayırma

Subcellular Fractionation from Fresh and Frozen Gastrointestinal Specimens

Bu iletişim kuralının amacı insan bağırsak dokusu tarafından endoskopi yerelleştirme analizi için nükleer ve sitoplazmik bölmeleri spesifik proteinlerin veya protein kompleksleri (Yani, sağlıklı farklı doku Birleşik Devletleri içine elde edilen fractionate etmektir hastalığı) vs . Bu yöntem her iki taze ve donmuş bağırsak doku örneği ayırma için yararlıdır; Tüm laboratuarlar için kolayca erişilebilir ve zaman alıcı.

Şekil 1 bir hematoksilen eozin boyama sağlam villus ve mezar yapıları ile bir bağırsak biyopsisi bölümünün gösterir.
Bu iletişim kuralını kullanan nükleer ve sitoplazmik ayırma temsilcisi sonuçları rakamlar 2 ve 3' te gösterilmiştir. Şekil 2, bir taze (Fh) ve dondurulmuş (Fz) gösterilen deneyinde biyopsi aynı anda şeker burada sunulan p...

Burada, insan taze ve donmuş bağırsak biyopsisi sitoplazmik ve nükleer proteinlerin hücre altı ayrılması için basit bir hücresel ayırma gerçekleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut.

Taze ve donmuş Gastrointestinal örnekleri üzerinden hücre altı ayırma

The purpose of this protocol is to fractionate human intestinal tissue obtained by endoscopy into nuclear and cytoplasmic compartments for the ...

Aşağıdaki protokolün amacı, donmuş veya taze gastrointestinal örneklerden hücre altı fraksiyonlar oluşturmaktır. Proteinler, bir hücre içindeki hemen hemen tüm biyolojik işlevlerinizde yer alır. Herhangi bir varyasyonda, bir konum arasında çıkarıldıkları patojenik bir senaryoya yol açabilir.Bazı çalışmalar, protein lokalizasyonunun değerlendirilmesinden yararlanacak veya belirli bir hücresel bölmeden bir proteini istila etmesi gerekecektir. Bu nedenle, bozulmamış proteinlerin tekrarlanabilir fraksiyonasyonu bu açıdan önemlidir. Bağırsak biyopsi örnekleri son zamanlarda endoskopi prosedürleri sırasında elde edilebilir ve protein miktar tayini veya immünoçökeltme çalışmaları için etkili bir şekilde kullanılabilir.Klinik bağırsak örnekleri, doku ve hastalığa özgü proteinlerin etkili bir şekilde tanımlanması için önemli bir kaynaktır. Bu yöntemin adı, endoskopi ile elde edilen insan bağırsak dokusunu, belirli bir protein veya protein komplekslerinin lokalizasyon analizi için nükleer ve sitoplazmik bölmelere ayırmaktır. Bu yöntem, her ikisinin de fraksiyonlanmasına hizmet eder.İlk olarak, donmuş bağırsak biyozumuz gerçekleşir. Dondurulmuş doku prosedürü için, numuneleri ekstraksiyondan hemen sonra dondurun ve kullanılana kadar sıvı nitrojen içinde saklayın. Soğuk homojenizasyon tamponu eklenene kadar numunenin donmuş halde tutulması önemlidir.Taze numuneler için biyopsiyi 1,5 mL'lik bir mikrotüpe aktarın ve prosedür başlayana kadar buz üzerinde tutun. Donmuş doku örnekleri genellikle kriyotüpün duvarına tutturulur, doku konik 1.5 mL'lik bir mikrotüpe aktarılmadan önce steril bir pipet ucu kullanılarak serbest bırakılabilir. Numuneyi içeren mikrotüpe DDT ve fosfataz ve proteaz inhibitörleri ile desteklenmiş 200 mL tampon ekleyin.Doku tamamen bozulana kadar numuneyi bir kap ile homojenize edin ve buz üzerinde tutun. Numuneyi buz üzerinde 10 dakika inkübe edin. Hücre zarını bozmak için her numuneye 10 mL yüzde 1 deterjan ekleyin, yüzde 0.05'lik bir nihai konsantrasyona getirin.Beş dakika buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Kısa bir süre vorteks yapın ve iki dakika boyunca 4 derecede 400 g'da santrifüjleyin. Sitoplazmik protein fraksiyonunu içeren süpernatanı çıkarın ve temiz bir tüpe aktarın.Peleti atmayın. Pelet, DDT ve fosfataz ve proteaz inhibitörleri ile desteklenmiş 200 mL tampon ikide yeniden süspansiyon haline getirin. 400 g'da 2 dakika santrifüjleyin.Süpernatanı atın ve yıkama işlemini iki kez daha tekrarlayın. Üçüncü yıkamadan sonra, peleti 100 mL tampon ikide tekrar süspanse edin. 30 dakika boyunca 4 derecede kuvvetlice çalkalayın.10 dakika boyunca en yüksek hızda 4 derecede santrifüjleyin. Nükleer protein fraksiyonunu içeren süpernatanı temiz bir tüpe aktarın. Sitoplazmik ve nükleer fraksiyonlar artık miktar tayini ve aşağı akış deneyleri için hazırdır.Bağırsak mukozası çeşitli proteazlar açısından zengindir ve bu nedenle protein yıkımını en aza indirmek için ekstraksiyon sırasında protein yıkımının kontrol edilmesi gerekir, protein ekstraksiyon tamponlarına çoklu proteaz inhibitörleri dahil edilmelidir. Ek olarak, ekstraktlar ek tahliller için kullanılacaktır. Protein denatürasyonundan veya proteolizden kaçınmak önemlidir.Bu da protein aktivitesi kaybına neden olur. Dokularda bulunan hücre-hücre ve hücre-matriks temaslarının bir sonucu olarak, hücre kültürlerinde rutin olarak kullanılan protein ekstraksiyon protokollerinde bazı modifikasyonların uygulanması gerekmektedir. Protein kalitesini etkilemeden hücrelerin transsellüler matriksten ayrılması, bağırsak dokusu proteinlerinin verimli izolasyonu için kritik bir faktördür.Soldaki tablo, taze ve dondurulmuş 2 mL biyopsi örneklerinden elde edilen fraksiyonların her birinin protein konsantrasyonlarını göstermektedir. Konsantrasyonlar mikrolitre başına mikrogram cinsinden gösterilir. Bu deneyde, taze ve donmuş bir numune, protokol izlenerek aynı anda fraksiyonlandı.Ve her numuneden 20 mg kullanılarak bir Western blot gerçekleştirildi. Fraksiyonların saflığını kontrol etmek için, sitoplazmik kontroller olarak HSP90 ve Tubulin ve nükleer kontroller olarak HDAC1 ve H3 kullanıldı. Görülebileceği gibi, HSP90 ve Tubulin esas olarak sitoplazmada ve HDAC1 ve H3 çekirdekte bulunur ve iki fraksiyon arasında çok kalıntı karışımı vardır.Protokolün hücre ölümünü etkileyip etkilemediğini görmek için CASP3'ü de tespit ettik. Her iki numune de CASP3 için çok minimal bir boyama sunar ve biyopsilerin hızlı dondurulmasından sonra bile prosedürün hücre ölüm yolunu etkilemediğini doğrular. Bu deneyde kullanılan donmuş numuneler, bağırsak enflamatuar durumu olan bir kişiden geldi ve beklendiği gibi, pSTAT1 bu numunenin sitoplazmasında belirir, bu da protein modifikasyonlarının fraksiyonlamadan sonra korunduğunu doğrular ve bu nedenle aşağı akış fonksiyonel analizi için kullanılabilir.Frozen biyopsilerde sonuçların tekrarlanabilirliği bu şekilde gösterilmiştir. Fraksiyonlar, minimum bölme protein karışımı ile temizdir. Taze ve donmuş biyopsiler bu protokollerde eşit olarak kullanılabilir, donmuş biyopsiler Şekil 1 ve 2'de görüldüğü gibi temiz ve tekrarlanabilir sonuçlar verir.Burada açıklanan protokol, olası protein fraksiyonlarını oluşturmak için tasarlanmıştır. Bununla birlikte, dokunun boyutu ve durumu da dahil olmak üzere numune içindeki bazı içsel değişkenlikler, protein miktarlarında ve fraksiyonlardaki dağılım miktarlarında sapmalara yol açabilir.

subcellular-fractionation-from-fresh-frozen-gastrointestinal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

, Memeli hücrelerinin mikroskop lamelleri yerinde Subselüler fraksiyonasyon protein localisation görselleştirme sağlar .

Yapışkan ve Sigara yapışık Memeli Hücre yerinde Subselüler Fraksiyonu

Bu videoda, taze donmuş glioma dokusundan tek çekirdekleri izole etmek için kullanılan protokol açıklanmaktadır. İzole edilmiş tek çekirdekler, merkezi sinir dokularının gliomunda gözlenen tümörler arası ve tümör içi heterojenlik hakkında daha derin bilgiler elde etmek için tek çekirdekli RNA (snRNA) dizilemesi ve Transpozaz Erişilebilir Kromatin (snATAC) dizilemesi için tek çekirdekli Test gibi dizileme teknikleri için örnekler olarak kullanılabilir.

Taze Donmuş Glioma Dokularından Çekirdek İzolasyonu: Glioma Tümör Örneklerinden Sağlam Çekirdek Elde Etmek İçin Bir Yöntem

Burada, uzamsal olarak farklı murin kolonik epitel yüzey hücrelerinin alttaki kript bazlı hücrelerden izolasyonu için basit bir yöntem açıklıyoruz.

Fare Kolon Mukozanın Mikrodisseksiyon için Cryosectioning Yöntemi

Burada, MF fenotipine sahip donmuş mide, ince bağırsak ve kolon dokusu oluşum hücrelerinden primer fibroblast/miyofibroblast (MF) kültürlerinin izole edilmesi ve oluşturulması için bir protokol sunulmaktadır. Bu hücreler CD90, α-SMA ve vimentin eksprese eder. MF'ler, enzimatik aktivite ve sitokin üretimi dahil olmak üzere çeşitli fonksiyonel testler için kullanılabilir.

İnsan Frozen Gastrointestinal örneklerden CD 90+ fibroblast / miyofibroblastlar İzolasyonu

Bu iletişim kuralı, enterik gangliyon lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) kullanarak sabitlenmemiş, taze rezeke insan bağırsak dokusundan izole yüksek bütünlük RNA örnekleri almak için hedeftir. Bu protokol flaş donmuş örnekleri insan bağırsak dokusu, cryosectioning, ethanolic boyama ve dehidratasyon, LCM, hazırlanıyor içerir ve RNA çıkarma.

Lazer-yakalama mikrodiseksiyon optimizasyonu gelen insan dokusu taze donmuş enterik gangliyon yalıtım için

Burada, plazma zarı, sitoplazma ve yüksek hızlı Santrifüjü kullanmanıza gerek kalmadan U937 hücrelerinin mitokondri izole etmek için bir protokol mevcut. Bu tekniği yoluyla protein yerelleştirme immunoblotting sonraki incelenmesi için hücre altı fraksiyonları arındırmak için kullanılabilir.

Yüksek hızlı Santrifüjü yokluğunda U937 hücrelerinin hücre ayırma

Bu protokol, DNA hasarı değerlendirmek için kuyruklu yıldız testinde kullanılmak üzere nekropsi sırasında yüksek kaliteli dondurulmuş doku örnekleri hazırlamak için çeşitli prosedürler açıklar: 1) kıyılmış doku, 2) gastrointestinal sistemden kazınmış epitel hücreleri, ve 3) küp doku bir doku kıyma cihazı kullanarak homojenizasyon gerektiren örnekler.

DNA Hasarının Değerlendirilmesinde Kuyruklu Yıldız Testinde Donmuş Dokunun Kullanımı

Tümör içi heterojenlik gliomalar da dahil olmak üzere tümörlerin doğal bir özelliğidir. Tek çekirdek RNA ve ATAC dizileme çalışmaları için tek çekirdekleri taze donmuş glioma dokularından izole etmek için tamponlar ve gradyan santrifüjleme kombinasyonunu kullanan basit ve verimli bir protokol geliştirdik.

Tek Çekirdekli RNA-seq ve ATAC-seq için Taze Donmuş Beyin Tümörlerinden Çekirdek İzolasyonu

Bu fraksiyonasyon protokolü, araştırmacıların sitoplazmik, nükleer, mitokondriyal ve membran proteinlerini memeli hücrelerinden izole etmelerini sağlayacaktır. Son iki hücre altı fraksiyon, izopiknik yoğunluk gradyanı ile daha da saflaştırılır.

U937 Hücrelerinin İzopiknik Yoğunluk Degrade Saflaştırması ile Hücre Fraksiyonasyonu

Protokol, doku ayrışma koşulları, tek hücreli süspansiyonların dondurularak saklanması ve izole çekirdeklerin değerlendirilmesi dahil olmak üzere 10x Genomik platformunu kullanarak çoklu dizileme için katı tümör örneklerinden çekirdeklerin izolasyonuna güvenilir ve optimize edilmiş bir yaklaşım sağlar.

Çoklu Dizileme için Taze ve Dondurulmuş Katı Tümör Örneklerinden Optimize Edilmiş Çekirdek İzolasyonu

Bu çalışmada, intestinal manipülasyon ile oluşturulan postoperatif ileusun bir murin modeli tanımlanmıştır. Gastrointestinal geçiş fonksiyonu, patolojik değişiklikler ve immün hücre aktivasyonu ameliyattan 24 saat sonra değerlendirildi.

Ameliyat Sonrası İleus Murin Modeli

Öğrenin, gastrointestinal biyopsilerden sitoplazmik ve nükleer proteinleri ayırmak için hücre altı fraksiyonlama yöntemini. Taze ve donmuş örneklerle tekrarlanabilir protein lokalizasyon analizi yapın.

Taze ve donmuş Gastrointestinal örnekleri üzerinden hücre altı ayırma

Daha fazla video keşfet