Name: Kalıtsal Transthyretin Ala97Ser genetik analizini amiloidoz ile ilgili (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Öğrenin, kalıtsal transtiretin amiloidozu için Ala97Ser mutasyonunu PCR ve agaroz jel elektroforezi ile teşhis etmeyi. Bu yöntem, klinik laboratuvarlarda kolayca uygulanabilir ve erken tanıya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bayan Shin-eğlenceli Wu deneylerde yardımları için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışmada Chang Gung tıbbi araştırma programı (CMRPG3C0371, CMRPG3C0372, CMRPG3C0373) ve IRB 100-4470A3, 104-2462A3, Tayvan bir hibe tarafından desteklenmiştir.

Laboratuvarda yapılan test gereksinimleri, klinik laboratuvar iyileştirme değişiklikler (CLIA), 1988, kurumsal İnceleme Kurulu, Chang Gung Memorial Hastanesi tarafından onaylanmış yönetmelikleri uyarınca gerçekleştirilmiştir ve Üniversite (lisans no. 100 - 4470A3 ve 104-2462A3). Aydınlatılmış onam tüm hastalardan elde edildi.
1. kan numune toplama
<ol><li>Tam kan piyasada bulunan EDTA tedavi tüpler içine toplamak. Karışımı yavaşça ve işleme kadar kan örneği 4 ° C'de depolayın.</li>
</ol>2. DNA ekstraksiyon periferik kandan
Bir DNA ekstraksiyon kiti genomik DNA ekstraksiyon için kullanın (bkz. Tablo malzeme).
<ol><li>Çözüm 1 10 mL 4.0 mL kan örneği için ekleyin. Örnek 10 min için buz üzerinde kuluçkaya.</li>
	<li>2.000 x g 4 ° C'de 5 min için de örnek santrifüj kapasitesi Kaldırmak ve süpernatant dikkatli atın. Pelet çözüm 1 3 mL resuspend.</li>
	<li>Örnek 4 ° C'de 5 min için 2.000 x g de tekrar santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. Pelet çözüm 2 3 mL resuspend.</li>
	<li>10 µL 100 µg/mL nihai bir konsantrasyon almak ve iyice karıştırın pronase hisse senedi çözüm (225 mg/mL) ekleyin. 37 ° C'de gecede kuluçkaya.</li>
	<li>Buz 10 dakika süreyle Ekle 0.8 mL çözüm 3 örnek tüp soğuk ve 3 - 5 kez tersine çevirin. Örnek 5 min için buz yerleştirin.</li>
	<li>Örneği ' 3000 x g 4 ° C'de 15 dakika santrifüj kapasitesi Dikkatle süpernatant 15 mL steril konik santrifüj tüpü aktarın.</li>
	<li>6 µL 20 µg/mL nihai bir konsantrasyon almak için RNase hisse senedi çözüm (10 mg/mL) ekleyin. 15 dakika 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>İzopropil alkol ve mix 2.5 mL iyice yavaşça DNA çökelti birkaç kez ters çevirme tarafından ekleyin (beyaz, topaklanmış malzeme ipliklerini oluşturacak). Bir büyük geçişli damlalıklı kullanarak, DNA precipitant yeni bir 1,5 mL santrifüj tüpü aktarın.</li>
	<li>4 ° C'de 3 min için 12.000 x g, santrifüj Süpernatant dikkatli atın. Yıkama DNA Pelet 500 µL % 70 etanol ekleyerek.</li>
	<li>1 dk. için 12.000 x g, santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. Hava kuru DNA Pelet oda sıcaklığında. GKD2O 100 µL ekleyin ve 15 dakika DNA resuspend 65 ° C'de kuluçkaya.</li>
</ol>3. genomik DNA miktar
Bir spektrofotometre kullanın (miktar ve kalite genomik DNA'ın algılamak için Malzemeler tablobkz:).
<ol><li>Spektrofotometre makineye bağlı olan bilgisayarda oturum. Yazılımını açın.</li>
	<li>Spektrofotometre makine başlatın:<ol>
<li>"Nükleik asit" spektrofotometre yazılım'ı tıklatın.</li>
		<li>Ayaklı bir tek kullanımlık kağıt mendil ve arıtılmış su ile temizleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Spektrofotometre boş:<ol>
<li>Kaide arıtılmış su 2 µL yükleyin.</li>
		<li>Spektrofotometre üst kol aşağı indirin ve "Boş" Bunu ayarlamak için tıklatın.</li>
		<li>Bittiğinde, üst kol lift ve ayaklı bir bezle kurulayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ölçü örnek:<ol>
<li>"DNA-50" örnek türü tıklatın.</li>
		<li>DNA örneği kaide üzerinde 2 µL yükleyin.</li>
		<li>Üst kol aşağı indirin ve "A260/A280 oranı ve örnek konsantrasyonunu ölçmek için ölçü birimi"'ı tıklatın.</li>
		<li>Kaide arasında her çalışma bir silme ve arıtılmış su ile temizleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>"Print Screen" verileri toplamak üzere tıklatın.</li>
</ol>4. Genetik analizlerle mutasyonların
Hedef DNA PCR4ile yükseltmek. PCR 25 µL tepki olarak gerçekleştirmek bir DNA polimeraz kullanarak karışımı kiti ( Tablo malzemelerigörmek). Tablo 1 TTR gen intronic astar gösterir.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Gen</td>
			<td>Astar sıra</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exon1</td>
			<td>F: 5'-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3' R: 5'-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exon2</td>
			<td>F: 5'-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3' R: 5'-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exon3</td>
			<td>F: 5'-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3' R: 5'-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exon4</td>
			<td>F: 5'-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3' R: 5'-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3'</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1. TTR gen intronic astar. (NCBI başvuru sıra: NC_000018.10)
<ol><li>Reaktifleri 0.2 mL PCR tüp Tablo 2 ' de ekleyin.</li>
</ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Bileşenleri</td>
			<td>Birim (µL)</td>
			<td>Son konsantrasyonu</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 x arabellek</td>
			<td>2.5</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2 (25 mM)</td>
			<td>1.5</td>
			<td>1.5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>360 GC artırıcı</td>
			<td>1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>360 DNA polimeraz</td>
			<td>0,2</td>
			<td>2 U/reaksiyon</td>
		</tr>
<tr>
<td>dNTP Mix (25 mM her)</td>
			<td>2</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Astar F (10 µM)</td>
			<td>1</td>
			<td>0.4 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Astar R (10 µM)</td>
			<td>1</td>
			<td>0.4 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNA (100 ng)</td>
			<td>2</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>PCR-sınıf su</td>
			<td>13,8</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Toplam hacim</td>
			<td>25</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2. PCR reaksiyon koşulları.
<ol start="2"><li>Karışımı yavaşça ve kısaca tüm bileşenleri tüp alt toplamak için benchtop santrifüj üzerinde santrifüj kapasitesi. Tüp bir thermocycler yerleştirin.</li>
	<li>PCR 30 döngüleri için gerçekleştirin. 30 denatürasyon adıma, her döngü oluşur 94 ° c, astar için 30 tavlama s s 58 ° C ve polimeraz uzantısı için 45 s 72 ° c (bkz. Tablo 3).</li>
</ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Adım</td>
			<td>Sıcaklık (° C)</td>
			<td>Zaman</td>
			<td>döngüsü</td>
		</tr>
<tr>
<td>İlk denatürasyon</td>
			<td>95</td>
			<td>5 dk</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNA denatürasyon adım</td>
			<td>94</td>
			<td>30 s</td>
			<td>30 döngüleri</td>
		</tr>
<tr>
<td>Astar tavlama adım</td>
			<td>58</td>
			<td>30 s</td>
			<td>30 döngüleri</td>
		</tr>
<tr>
<td>Polimeraz uzantısı adım</td>
			<td>72</td>
			<td>45 s</td>
			<td>30 döngüleri</td>
		</tr>
<tr>
<td>Yazı uzama adım</td>
			<td>72</td>
			<td>10 dk</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>PCR sonu Bisiklete binme</td>
			<td>4</td>
			<td>Belirsiz</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 3. PCR ürünleri yükseltecek koşulları Bisiklete binme.
<ol start="4"><li>PCR ürünü jel elektroforez ile görselleştirme tarafından doğrula:<ol>
<li>% 1.2 özel jel hazırlayın:<ol>
<li>100 mL 0.5 ile 1,2 g özel tozu karışımı bir mikrodalga şişesi x TBE. Mikrodalga fırında 2 dk kadar özel tamamen çözülür. Özel karışımı ile 55 ° c sakin</li>
			<li>Etidyum bromür çözüm (10 mg/mL) 2 µL özel karışıma ekleyin ve karışımı yavaşça. Yaklaşık 5-7 mm bir jel tepsisine özel karışımı dökün, sonra comb(s) yere ekleyin. (En az 30 dk) kuvvetlendirmek ve dikkatli bir şekilde çıkarın comb(s) izin verir.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Örnekleri yüklemek ve bir özel jel çalıştırmak:<ol>
<li>Jel ve tepsi Elektroforez hücreye yerleştirin. 0,5 ile Elektroforez hücreyi doldurmak jel kaplı kadar x TBE.</li>
			<li>Dikkatle 2 yük µL 100 bp DNA'ın moleküler boyutu marker olarak jel tek şeritli içine merdiven ( Tablo malzemelerigörmek). Ek şerit içine yük boya/örnek karışımı (1 µL 6 x yükleme boya ile PCR ürünü karışımı 5 µL).</li>
			<li>Güç kaynağı açın. 25 dk için jel 100 V çalıştırın.</li>
			<li>Jel Elektroforez hücreden kaldırın. DNA parçalarının UV bir görüntüleme sistemi ışığı altında görselleştirin.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. DNA sıralama
<ol><li>PCR ürünleri ticari bir seti kullanarak arındırmak ve ticari olarak veya bir Otomatik Sekanslama ile sıra ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
	<li>Nükleotit dizileri nükleotit veritabanları10nükleotit sorguya karşılaştırmak için NCBI patlama sunucuya gönderin. Sonuçlar görüntülenir sonra sıra hizalamaları gerçekleştirmek ve beklenen mutasyon tanımlar.</li>
</ol>

<ol><li>Planté-Bordeneuve, V., Said, G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22094129">Familial amyloid polyneuropathy.</a> The Lancet Neurology. 10 (12), 1086-1097 (2011).</li>
<li>Planté-Bordeneuve, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+treatment+of+transthyretin+familial+amyloid+polyneuropathy+with+tafamidis%3A+a+clinical+and+neurophysiological+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Long-term treatment of transthyretin familial amyloid polyneuropathy with tafamidis: a clinical and neurophysiological study.</a> Journal of Neurology. 264 (2), 268-276 (2017).</li>
<li>Nichols, W. C., Benson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hereditary+amyloidosis%3A+detection+of+variant+prealbumin+genes+by+restriction+enzyme+analysis+of+amplified+genomic+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Hereditary amyloidosis: detection of variant prealbumin genes by restriction enzyme analysis of amplified genomic DNA sequences.</a> Clinical Genetics. 37 (1), 44-53 (1990).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+Chain+Reaction%3A+Basic+Protocol+Plus+Troubleshooting+and+Optimization+Strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).</li>
<li>Hsu, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+expressions+of+hereditary+Transthyretin+Ala97Ser+related+Amyloidosis+%28ATTR%29+in+Taiwanese%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurology%22%5BJournal%5D)">Phenotypic expressions of hereditary Transthyretin Ala97Ser related Amyloidosis (ATTR) in Taiwanese.</a> BMC Neurology. 17 (1), 178(2017).</li>
<li>Barroso, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+safety+and+efficacy+of+tafamidis+for+the+treatment+of+hereditary+transthyretin+amyloid+polyneuropathy%3A+results+up+to+6+years%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Long-term safety and efficacy of tafamidis for the treatment of hereditary transthyretin amyloid polyneuropathy: results up to 6 years.</a> Amyloid. 24 (3), 194-204 (2017).</li>
<li>Rapezzi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+profile+and+differential+diagnosis+of+hereditary+transthyretin-related+amyloidosis+with+exclusively+cardiac+phenotype%3A+an+Italian+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Disease profile and differential diagnosis of hereditary transthyretin-related amyloidosis with exclusively cardiac phenotype: an Italian perspective.</a> European Heart Journal. 34 (7), 520-528 (2013).</li>
<li>Mariani, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotype-phenotype+correlation+and+course+of+transthyretin+familial+amyloid+polyneuropathies+in+France%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Genotype-phenotype correlation and course of transthyretin familial amyloid polyneuropathies in France.</a> Annals of Neurology. 78 (6), 901-916 (2015).</li>
<li>Hammarström, P., Jiang, X., Hurshman, A. R., Powers, E. T., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-dependent+denaturation+energetics%3A+A+major+determinant+in+amyloid+disease+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sequence-dependent denaturation energetics: A major determinant in amyloid disease diversity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, suppl 4 16427-16432 (2002).</li>
<li>Johnson, M., Zaretskaya, I., Raytselis, Y., Merezhuk, Y., McGinnis, S., Madden, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NCBI+BLAST%3A+a+better+web+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">NCBI BLAST: a better web interface.</a> Nucleic Acids Research. 36, Web Server issue 5-9 (2008).</li>
<li>Fox, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+sequencing+for+the+detection+of+actionable+mutations+in+solid+and+liquid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Next generation sequencing for the detection of actionable mutations in solid and liquid tumors.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).</li>
<li>Date, Y., Nakazato, M., Kangawa, K., Shirieda, K., Fujimoto, T., Matsukura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+three+transthyretin+gene+mutations+in+familial+amyloidotic+polyneuropathy+by+analysis+of+DNA+extracted+from+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Neurological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Detection of three transthyretin gene mutations in familial amyloidotic polyneuropathy by analysis of DNA extracted from formalin-fixed and paraffin-embedded tissues.</a> Journal of the Neurological Sciences. 150 (2), 143-148 (1997).</li>
<li>Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-BLAST%3A+a+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinformatics. 13, 134(2012).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+cloning%3A+A+laboratory+manual%22">Molecular cloning: A laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2012).</li>
<li>Buckingham, L., Flaws, M. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuckingham%2C+L+%22Molecular+diagnostics%3A+Fundamentals%2C+methods%2C+and+clinical+applications%22">Molecular diagnostics: Fundamentals, methods, and clinical applications</a>. , F.A. Davis Co. Philadelphia. (2012).</li>
<li>Tan, S. C., Yiap, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA%2C+RNA%2C+and+Protein+Extraction%3A+The+Past+and+The+Present%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">DNA, RNA, and Protein Extraction: The Past and The Present.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2009, (2009).</li>
<li>Rapezzi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+cardiac+amyloidoses%3A+disease+profiles+and+clinical+courses+of+the+3+main+types%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Systemic cardiac amyloidoses: disease profiles and clinical courses of the 3 main types.</a> Circulation. 120 (13), 1203-1212 (2009).</li>
<li>Gertz, M. A., Dispenzieri, A., Sher, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25311231">Pathophysiology and treatment of cardiac amyloidosis.</a> Nature Reviews Cardiology. 12 (2), 91-102 (2015).</li>
<li>Vrana, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+diagnosis+and+typing+of+systemic+amyloidosis+in+subcutaneous+fat+aspirates+by+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Clinical diagnosis and typing of systemic amyloidosis in subcutaneous fat aspirates by mass spectrometry-based proteomics.</a> Haematologica. 99 (7), 1239-1247 (2014).</li>
<li>Nakamura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+new+transthyretin+variant+%28Ile49%29+in+familial+amyloidotic+polyneuropathy+using+electrospray+ionization+mass+spectrometry+and+nonisotopic+RNase+cleavage+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Heredity%22%5BJournal%5D)">Identification of a new transthyretin variant (Ile49) in familial amyloidotic polyneuropathy using electrospray ionization mass spectrometry and nonisotopic RNase cleavage assay.</a> Human Heredity. 49 (4), 186-189 (1999).</li>
<li>Ueda, M., Ando, Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25228988">Recent advances in transthyretin amyloidosis therapy.</a> Translational Neurodegeneration. 3, 19(2014).</li>
<li>Brown, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+testing+improves+identification+of+transthyretin+amyloid+%28ATTR%29+subtype+in+cardiac+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Genetic testing improves identification of transthyretin amyloid (ATTR) subtype in cardiac amyloidosis.</a> Amyloid. 24 (2), 92-95 (2017).</li>
<li>Tasaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+wild-type+and+mutated+transthyretins%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of wild-type and mutated transthyretins.</a> Annals of Clinical Biochemistry. 53 (4), 508-510 (2015).</li>
<li>Plante-Bordeneuve, V., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17698792">Diagnostic pitfalls in sporadic transthyretin familial amyloid polyneuropathy (TTR-FAP).</a> Neurology. 69 (7), 693-698 (2007).</li>
<li>Hsu, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+prospective%2C+observational+study+of+patients+with+uncommon+distal+symmetric+painful+small-fiber+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A prospective, observational study of patients with uncommon distal symmetric painful small-fiber neuropathy.</a> PLoS ONE. 12 (9), 0183948(2017).</li>
<li>Salvi, F., Pastorelli, F., Plasmati, R., Bartolomei, I., Dall'Osso, D., Rapezzi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotypic+and+phenotypic+correlation+in+an+Italian+population+of+hereditary+amyloidosis+TTR-related+%28HA-TTR%29%3A+Clinical+and+neurophysiological+aids+to+diagnosis+and+some+reflections+on+misdiagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Genotypic and phenotypic correlation in an Italian population of hereditary amyloidosis TTR-related (HA-TTR): Clinical and neurophysiological aids to diagnosis and some reflections on misdiagnosis.</a> Amyloid. 19, suppl 1 58-60 (2012).</li>
<li>Suhr, O. B., Lundgren, E., Westermark, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+mutation%2C+two+distinct+disease+variants%3A+Unravelling+the+impact+of+transthyretin+amyloid+fibril+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">One mutation, two distinct disease variants: Unravelling the impact of transthyretin amyloid fibril composition.</a> Journal of Internal Medicine. 281 (4), 337-347 (2017).</li>
<li>Vilà-Rico, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+post-translational+modifications+in+human+serum+transthyretin+associated+with+familial+amyloidotic+polyneuropathy+by+targeted+LC-MS+and+intact+protein+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of post-translational modifications in human serum transthyretin associated with familial amyloidotic polyneuropathy by targeted LC-MS and intact protein MS.</a> Journal of Proteomics. 127, 234-246 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Protokol içinde iki önemli adım vardır. İlk olarak, beyaz kan hücreleri yeterli sayıda için hemodiluted numune kaçınılmalıdır11olmalıdır. İkinci olarak, uygun PCR astar kullanımı güvenilir sonuçlar12elde etmek için esastır. Primer-BLAST web aracı astar4,13tasarlamak için kullanılır; en az 40 baz çifti 4 TTR ekzonlar her tarafında örtülmelidir. Ayrıca astar özgüllük kontrol etmek için NCBI üzerinde patlama çalıştırın...

Transthyretin (TTR) Amiloidoz (ATTR) kalıtsal sistemik amiloidoz1en sık görülen ve transthyretin (TTR) gen2' deki bir otozomal baskın devralınan mutasyon neden olabilir. TTR mutasyonlar tetrameric protein yapısı istikrarsızlaştırmak ve amiloid liflerinde2' ye yeniden monomerleri içine onun ayrılma için kurşun. 100'den fazla amyloidogenic TTR mutasyonlar bildirilen dünya çapında1olmuştur. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemleri ile Genetik analizlerle TTR nokta mutasyon varlığını doğrulamak ve radioactively etiketli probları southern blot3ile karşılaştırıldığında kullanımı kaçınarak dahil olmak üzere avantajlara sahip. PCR çok sayıda modern Bilimler4alanlara uygulanan hızlı, kolay, ucuz ve güvenilir bir tekniktir.
Bu ilerici ve ölümcül hastalığın erken tanı onun fenotipik heterojenite verilen zordur. Dikkat ve daha geniş tanıma ATTR yanı sıra gelişmekte olan tedaviler5erken belirtileri üzerinde artan ile TTR genetik testi de dahil olmak üzere uygun Diagnostik araştırmalar bu nedenle prognoz geliştirmek için kritik olan araçlardır. Ayrıca, farklı mutasyon özelliği farklı alellerle, yasi, ilerleme, hastalık şiddeti, medyan sağkalım karaciğer nakli veya TTR stabilizatörleri2,6, etkinliği kalıpları ile ilişkili olan ve genetik danışmanlık7,8,9büyük etkiler değişken derece tutulumu, nörolojik ve kardiyoloji. Ayrıca, son derece hassas bir genetik test ATTR iki farklı tür ayıran tek araçtır: kalıtsal (mutant) ve vahşi türü (mutant olmayan form, Senil sistemik amiloidoz, SSA)7. Terapiler yaygın olarak2farklı olduğundan ATTR, türleri onaylamak için zorunludur. Bu nedenle, TTR genetik test kademeli protokolü tanımlamak için artan bir zorunluluk yoktur.
Ala97Ser, Tayvan, en yaygın endemik mutasyon örnek olarak kullanarak mutasyon tespit etmek için moleküler yaklaşım ayr›ca gösterilecektir. Değişiklikleri DNA ekstraksiyon adımda kullanılan üç çözümleri azaltmak ve DNA yeterli miktarda verir. Bu iletişim kuralı, bölgeler de dahil olmak üzere 5' akıntıya karşı 3' aşağı, organizatör, intron, tüm 4 TTR ekzonlar analiz edildi ve çevrilmeyen bölgeler (UTR) değil sıralı.

<table><tbody><tr><td>EDTA ile tedavi edilmiş tüpler</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA Ekstraksiyon Kiti</td><td>Stratagen</td><td>200600</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND2000 spektrofotometre ve nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Hassas Görev Silecekleri</td><td>Kimberly-Clark</td><td>Kimtech Science Kimwipes</td><td></td></tr><tr><td>AmpliTaq Gold 360 DNA Polimeraz kiti</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4398823</td><td></td></tr><tr><td>TTR gen intronik primerleri&nbsp;</td><td>Ekson1</td><td>F: 5'-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ekson1</td><td>R: 5'-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ekson2</td><td>F: 5'-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ekson2</td><td>R: 5'-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ekson3</td><td>F: 5'-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ekson3</td><td>R: 5'-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ekson4</td><td>F: 5'-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ekson4</td><td>R: 5'-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3'</td><td></td></tr><tr><td>termodöngüleyici</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>GeneAmp PCR Sistemi 9700</td><td></td></tr><tr><td>elektroforez hücresi ve nbsp;</td><td>ADVANCE</td><td>Mupid-2plus</td><td></td></tr><tr><td>DNA merdiveni</td><td>Protech</td><td>PT-M1-100</td><td></td></tr><tr><td>boya</td><td>BioLabs</td><td>B7021</td><td></td></tr><tr><td>AlphaImager EC</td><td>Alpha Innotech</td><td>AlphaImager EC</td><td></td></tr><tr><td>otomatik sıralayıcı&nbsp;</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>3730xl DNA Analiz Cihazı</td><td></td></tr></tbody></table>

kalıtsal transthyretin ala97ser genetik analizini amiloidoz ile ilgili

Genetic Analysis of Hereditary Transthyretin Ala97Ser Related Amyloidosis

Genetik test kalıtsal transthyretin en güvenilir sınava amiloidoz ilgili ve transthyretin Amiloidoz (ATTR) çoğu durumda yapılmalıdır olduğunu. ATTR heterojen fenotipleri ile nadir ama ölümcül bir hastalıktır; Bu nedenle, tanı bazen gecikir. İle artan ilgi ve erken belirtileri ATTR yanı sıra gelişmekte olan tedaviler üzerinde daha geniş tanıma, transthyretin (TTR) genetik de dahil olmak üzere uygun Diagnostik araştırmalar, türleri onaylamak için test etmek ve bu nedenle ATTR türevleri vardır prognoz geliştirmek için temel. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemleri ile Genetik analizlerle onaylamak TTR nokta mutasyonlar varlığı çok daha hızlı ve daha güvenli Güney leke gibi geleneksel yöntemleri. Burada, biz ATTR Ala97Ser mutasyon, Tayvan en yaygın endemik mutasyon genetik onay göstermek. Protokol dört ana adımları kapsar: toplama tüm kan örneklerini, DNA ekstraksiyon, PCR ile tüm 4 TTR ekzonlar Genetik Analizi ve DNA sıralamanın.

Özel jel elektroforez iki hasta ve beklenen boyutlarda bir 454 bp PCR ürünü exon 4 TTR gen (Şekil 1) için de dahil olmak üzere, bir sağlıklı tek tek ortaya bantları.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57743/57743fig1.jpg"> Resim 1 . PCR tasvir jel elektroforez güçlendirilmiş TTR gen. Normal: sağlıklı bir birey. Lane M: 100 bp ...

Burada, Ala97Ser, en yaygın endemik mutasyon Tayvan, örnek olarak kullanarak nokta mutasyon kalıtsal transthyretin amiloidoz tanısı için varlığını doğrulamak için bir protokol mevcut.

Kalıtsal Transthyretin Ala97Ser genetik analizini amiloidoz ile ilgili

Genetic testing is the most reliable test for hereditary transthyretin related amyloidosis and should be performed in most cases of transthyretin ...

Transtiretin amiloidozun erken belirtilerine ve yeni ortaya çıkan tedavilere artan ilgiyle, transtiretin amiloidozun tiplerini ve varyantlarını doğrulamak için uygun çalışmalar prognozu iyileştirmek için esastır. Bu protokolün temel avantajı, bu testin uygulanabilir olması ve klinik laboratuvarda kolayca uygulanabilmesidir. Protokole başlamak için bir DNA ekstraksiyon kiti edinin, daha önce elde edilen 4.0 mililitre kan örneğine 10 mililitre çözelti ekleyin ve örneği 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.İnkübasyondan sonra, numuneyi dört santigrat derecede beş dakika boyunca 2000 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve atın. Peletleri üç mililitre birinci çözelti içinde yeniden askıya alın.Numuneyi 2000 G'de tekrar dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Peletleri üç mililitre çözelti ikide yeniden askıya alın.Daha sonra, mililitre başına 100 mikrogramlık bir nihai konsantrasyon elde etmek için 10 mikrolitre Pronase stok çözeltisi ekleyin ve içeriği iyice karıştırın. DNA'yı gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, tüpü 10 dakika buz üzerinde soğutun.Numuneye 0.8 mililitre çözelti üç ekleyin ve üç ila beş kez ters çevirin. Ardından, numuneyi beş dakika boyunca buzun üzerine koyun. Numuneyi 3000 G'de dört santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin.Süpernatanı dikkatlice 15 mililitrelik steril konik santrifüj tüpüne aktarın ve mililitre başına 20 mikrogramlık bir nihai konsantrasyon elde etmek için altı mikrolitre RNase stok çözeltisi ekleyin. Numuneyi inkübe edin, tüpe 2,5 mililitre izopropil alkol ekleyin ve beyaz topaklaştırıcı materyal iplikleri olarak görünen DNA'yı çökeltmek için tüpü birkaç kez hafifçe ters çevirin. Büyük çaplı bir pipet ile çökeltiyi yeni bir 1,5 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın.Çökeltiyi dört santigrat derecede üç dakika boyunca 12.000 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice atın. Daha sonra 500 mikrolitre% 70 etanol ekleyerek DNA peletini yıkayın.DNA'yı bir dakika boyunca 12.000 G'de santrifüjleyin ve süpernatanı atın. DNA peletini oda sıcaklığında havayla kurutun. 100 mikrolitre DDH2O ekleyin ve DNA'yı yeniden süspanse etmek için numuneyi 65 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin.Bir DNA polimeraz kiti kullanarak 25 mikrolitrelik bir reaksiyon karışımında PCR gerçekleştirin. Reaktifleri 0,2 mililitrelik bir PCR tüpüne ekleyin. İçeriği nazikçe karıştırın ve kısa bir süre tezgah üstü santrifüjde santrifüjleyin.Tüpü bir termal döngüleyiciye yerleştirin. PCR'yi 94 santigrat derecede 30 saniye boyunca bir denatürasyon adımı ile 30 döngü boyunca gerçekleştirin, 58 santigrat derecede 30 saniye boyunca primer etkinleştirme ve 72 santigrat derecede 45 saniye boyunca polimeraz uzatması gerçekleştirin. Mikrodalgaya uygun bir şişede 1.2 gram agaroz tozunu 100 mililitre 0.5 XTBE ile karıştırarak% 1.2'lik bir agaroz jeli hazırlayın.Agaroz tamamen eriyene kadar çözeltiyi iki dakika mikrodalgada pişirin. Agaroz karışımını 55 santigrat dereceye kadar soğutun. Agaroz karışımına iki mikrolitre etidyum bromür çözeltisi ekleyin ve hafifçe karıştırın.Karışımı yaklaşık beş ila yedi milimetreye kadar bir jel tepsisine dökün. Ardından tarağı yerleştirin. Jelin en az 30 dakika katılaşmasına izin verin.Jel katılaştıktan sonra tarağı dikkatlice çıkarın. Jeli ve tepsiyi elektroforez hücresine yerleştirin. Jel kaplanana kadar elektroforez hücresini 0,5 XTBE ile doldurun.100 baz çifti DNA merdiveninin iki mikrolitresini, moleküler boyut belirteci olarak jelin bir şeridine dikkatlice yükleyin. Boya ve numune karışımını ek şeritlere yükleyin. Güç kaynağını açın ve jeli 100 voltta 25 dakika çalıştırın.Jeli elektroforez hücresinden çıkarın. Son olarak, DNA parçalarını bir görüntüleme sisteminde UV ışığı altında görselleştirin. İki hastanın ve bir sağlıklı bireyin agaroz jel elektroforezi, TTR geninin ekzon dördü için 454 baz çifti PCR ürünü dahil olmak üzere beklenen boyutlarda bantlar ortaya koymaktadır.Dizi kromatogramları, TTR geninin ekzon dördünde G için bir nükleotid T ikamesi ortaya çıkardı ve iki hastada yanlış anlamlı bir mutasyon ve 97 amino asit pozisyonunda bir alanin-serin ikamesi ile sonuçlandı. Bu videoyu izledikten sonra, kalıtsal transtirenin amiloidozunun tanısı için nokta mutasyonlarının varlığının nasıl doğrulanacağını iyi anlamalısınız.

genetic-analysis-hereditary-transthyretin-ala97ser-related

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Atomik kuvvet mikroskobunu biyopanlama teknolojisi ile birlikte kullanarak, düşük konsantrasyonlarda bile herhangi bir biyolojik materyalde bulunan hastalığa özgü protein varyantlarına karşı antikorlar elde etmek için negatif ve pozitif bir biyopanlama sistemi oluşturduk.  Amyotrofik Lateral Sklerozda rol oynayan TDP-43 protein varyantlarına karşı antikor elde etmede başarılı olduk.

Amyotrofik Lateral Skleroz TDP-43 Türevleri karşı Morfoloji Özel Reaktifler İzolasyonunda Roman Atomik Kuvvet Mikroskobu Tabanlı biopanning

İnsan hastalıklarıyla ilişkili gen ailelerini anlamak için fareyi model sistem olarak kullanan bir ters genetik yaklaşım sunulmuş ve sonraki fare fenotipleme programı açıklanmıştır. İlgilenilen bir gen olan HtrA2'de kusurlu fareler Parkinson semptomları gösterdiğinden, fenotipleme rejimi nörolojik kusurları tanımlamaya odaklanır.

Yaşlanma İnsan Hastalıkları karıştığı Genler Eğitim için kullanılır Genetiği Değiştirilmiş Fareler için Fenotiplendirme Rejimi

Bu protokol, bir NLS-NES-GFP proteininin nükleer ithalatında gerçek zamanlı değişikliği niceleyerek motor nöron benzeri NSC-34 hücrelerindeki nükleositoplazmik taşınım oranını duyarlı bir şekilde ölçmek için bir yöntem açıklamaktadır.

Motor Nöron benzeri NSC-34 Hücrelerinde Gerçek Zamanlı Nükleositoplazmik Taşınımı Ölçüm Testi

Amiloid birikimi farklı hastalıklar özelliğidir ve birçok farklı organları afflicts. Bu kağıt Işıksaçan konjuge oligothiophene floresan Floresans mikroskobu teknikleri ile birlikte boyama uygulaması açıklanır. Bu boyama yöntemi algılama ve klinik ve bilimsel kurulumları protein toplamları keşfi için güçlü bir araç temsil eder.

Amiloid doku Imaging ile Işıksaçan konjuge Oligothiophenes Hyperspectral tarafından Confocal mikroskobu ve floresan ömür boyu görüntüleme lekeli

Hedeflenen yeni nesil sıralama Hastalıkları Araştırma ve Klinik teşhis giderek daha popüler hale geliyor zaman ve maliyet-etkin bir yaklaşımdır. Burada açıklanan protokol sıralaması için gerekli karmaşık iş akışı ve hastalık katkıda genetik varyantların tanımlamak için kullanılan Biyoinformatik işlem sunar.

Hedef yeni nesil sıralama ve Biyoinformatik boru hattı anayasal hastalığı genetik belirleyicileri değerlendirmek için

Mevcut çalışma, biz C924T genotip analiz etmek için bir metodoloji tarif. Protokol üç aşamadan oluşmaktadır: DNA ekstraksiyon, amplifikasyon Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) ve özel jel kısıtlama parça uzunluk polimorfizmi (RFLP) analizi.

Thromboxane A2 reseptör gen C924T polimorfizmi çalışmak için bir yöntem

Amino asit düzeyi parazit sinyal analizi arka plan için verilen bir popülasyonun genetik varyasyon normalleştirilmiş bir belirli amino asit pozisyonda genetik varyasyon yaygınlığı belirler. Bu varyant "sıcak noktalar" frekans nadir versiyonlarının bir nüfus (gürültü) bulundu yukarıda yükselir bir protein sıra (sinyal) içinde tanımlanması için sağlar.

Varyant patojenitesi Amino asit düzeyi parazit sinyal analizi genetik varyasyon kullanarak olasılığını belirleme

Nörodejeneratif hastalıklar için kan bazlı biyobelirteçler büyük ölçekli klinik çalışmaların uygulanması için gereklidir. Güvenilir ve doğrulanmış bir kan testi küçük bir örnek hacmi yanı sıra daha az invaziv örnekleme yöntemi, uygun fiyatlı ve tekrarlanabilir olmalıdır. Bu makale, yüksek iş itimatlı kapiller elektroforez immünoassay'In potansiyel biyomarker gelişimi için kriterleri karşıladığını göstermektedir.

İnsan Trombositlerinde Amotrofik Lateral Sklerozun Potansiyel Biyobelirteçlerini Aramak İçin Kapiller Elektroforez İmmünoassay Kullanımı

Klinik çalışmamızda bulunan ailesel kalıtsal kardiyomiyopati ailesine dayanarak, bu mutasyonu doğrulamak için CRISPR / Cas9 aracılı genom mühendisliği aracılığıyla fare MYH7 lokusunda bir nokta mutasyonu (G823E) olan bir C57BL / 6N fare modeli oluşturduk.

Ailesel Hipertrofik Kardiyomiyopatide MYH7 Mutasyonu Gly823Glu'nun Patogenezinin Bir Fare Modeli Kullanılarak İncelenmesi

Burada, ABD Çevre Koruma Ajansı Türler Arası Duyarlılığı Tahmin Etmek için Dizi Hizalama (SeqAPASS) aracının en son sürümünü kullanmak için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, protein korumasını hızlı bir şekilde analiz etmek ve türler arasında kimyasal duyarlılığın özelleştirilebilir ve kolayca yorumlanabilir tahminlerini sağlamak için çevrimiçi aracın uygulanmasını göstermektedir.

Protein Korunumunun Hızlı Değerlendirilmesi için Türler Arasında Tahmin Etmek İçin Dizi Hizalamasının Gösterilmesi Duyarlılık Aracı

Burada, insan γ-sekretazı yeniden yapılandıran bir maya sistemini tarif ediyoruz. Bu sistem, aktiviteyi etkileyen mutasyonların tanımlanmasına ve incelenmesine ve γ-sekretaz inhibitörlerinin (GSI'ler) taranmasına izin verir. Ailesel Alzheimer hastalığı mutantlarının fonksiyon kaybı özelliklerini kullanarak, γ-sekretaz modülatörlerini (GSM'ler) taramak mümkündür.

Saccharomyces cerevisiae Amiloid Beta Üretimini Etkileyen Genleri, Mutasyonları ve Kimyasalları γ-Sekretaz ile Taramak için Alzheimer Hastalığı Modelleri

Öğrenin, kalıtsal transtiretin amiloidozu için Ala97Ser mutasyonunu PCR ve agaroz jel elektroforezi ile teşhis etmeyi. Bu yöntem, klinik laboratuvarlarda kolayca uygulanabilir ve erken tanıya yardımcı olur.

Kalıtsal Transthyretin Ala97Ser genetik analizini amiloidoz ile ilgili

Daha fazla video keşfet