Name: CRISPR/Cas9 gen düzenleme yapmak koşullu mutantlar, insan sıtma parazit P. falciparum için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Öğrenin, CRISPR/Cas9 ile P. falciparum'da koşullu mutant oluşturma yöntemini. Bu teknik, protein fonksiyonlarını ortaya çıkararak sıtma paraziti biyolojisini anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Muthugapatti Kandasamy Georgia Üniversitesi (UGA) Biyomedikal mikroskobu temel teknik yardım için ve Juan Jose Lopez-Rubio pUF1-Cas9 ve pL6 plazmidleri paylaştığınız için teşekkür ederiz. Bu eser UGA başlangıç fon için VM, m. ve bize Ulusal Sağlık Enstitüleri Mart Dimes Vakfı (fesleğen O'Connor Starter bilim adamı Araştırma Ödülü) hibe verir kemerler Vakfı Ödülü D.W.C. ve H.M.K., tarafından desteklenmiştir (R00AI099156 ve R01AI130139) VM için ve (T32AI060546) H.M.K. için

P. falciparum sürekli kültür insan RBCs kullanımı gerektirir ve biz ticari satın alınan ünite kan tüm tanımlayıcıları çıkardı ve anonimleştirilir faydalanır. Kurumsal değerlendirme Komitesi ve biyogüvenlik Office Georgia Üniversitesi, bizim protokolleri gözden geçirilmiş ve onaylanmış bizim laboratuarda kullanılan tüm iletişim kuralları.
1. bir gRNA sıra seçimi
<ol><li>CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/) gidin ve ' Fasta hedef 'seçin. 'Hedef'altında 200 baz çifti 3' sonundan itibaren açık okuma çerçevesi bir genin (ORF) ve 200 baz çifti başlar, Gen 3' UTR-yapıştırın. 'In'altında 'P. falciparum' seçin (3D 7 v3.0) ve ' CRISPR/Cas9 ' 'Using'altında seçin. Sonra ' hedef siteleri bulmak 'tıklayın.</li>
	<li>Bir gRNA serisi bu değişiklik siteye en yakın ve en az sayıda hedef kapalı siteleri olan en verimli gRNA vererek sunulan seçenekler arasından seçin. Not: DNA Cas9 alımı için gereken bir Protospacer bitişik motifi (PAM in), hemen ters yönde oldukları için potansiyel gRNA dizileri tanımlanır. PMK-U6 gRNA ifade, sürücüler vektör klonlanmış sıra 20 üsleri olduğunu hemen ters yönde, PAM. S. pyogenes Cas9 için belirli PAM nükleotid dizisi NGG ve pMK-U6 klonlanmış sıra dahil edilmemesini. Not: CHOPCHOP görsel olarak gRNA dizileri, yeşil, daha az ideal seçenekler, amber ve kırmızı en kötü seçeneklerinde en iyi seçenekleri görüntüleme yer alıyor. CHOPCHOP her gRNA sıra literatürde bulunan en güncel parametreler kullanılarak hesaplanır bir verimlilik puan verir ve onlar gRNA tarafından tanınan hedef kapalı siteleri tahmin. İki ya da üç gRNA dizileri için belirli bir gen uygun gRNA en iyi bulmak için denenmesi gerekebilir.</li>
	<li>GRNA sıra ve tersi tamamlayıcı Polyacrylamide jel elektroforez saf oligos satın alabilirsiniz. Hedef PfHSP70x kullanılan gRNA sırası Şekil 1Badımında bulunabilir. Not: Bu oligo 15 sıra ve ligasyonu bağımsız (dilim) pMK-U6 vektör16klonlama için gerekli olan çift gRNA ifade plazmid için homolog içermelidir.</li>
</ol>2. gRNA sıra pMK-U6 içine klonlama
<ol><li>
BtgZI ile pMK U6 sindirmek.
	<ol>
<li>PMK-U6 Özet 10 μg 5 μL 60 ° C'de 3 h için BtgZI enzim (5000 adet/mL) ile Enzim üreticinin Protokolü reaksiyon koşulları için izleyin.</li>
		<li>3 h kuluçka dönemi sonra BtgZI bir ek 3 μL plazmid tam sindirim sağlamak için tepki ekleyin. Bir ek 3 h, hala doğru reaksiyon koşulları sağlamak için üreticinin yönergelerini takip için sindirmek.</li>
		<li>Sindirilir pMK U6 reaksiyon gelen arındırmak için üreticinin yönergelerine göre sütunlara göre PCR temizleme seti kullanın.</li>
		<li>% 0.7 özel jel kullanarak sindirilir DNA ayırmak ve 4200-baz çifti grup ayıklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
GRNA sıra içeren oligos tavlamak.
	<ol>
<li>100 μM nükleaz ücretsiz su kullanarak bir konsantrasyon için sayfa saf oligos sulandırmak.</li>
		<li>Her oligo 10 μL 10 x arabellek ( Tablo malzemelerigörmek) 2 2.2 μL ile birleştirin. Toplam reaksiyon birim 22,2 μL olduğundan emin olun.</li>
		<li>Bir thermocycler programda tavlama gRNA çalıştırın: adım 1: 95 ° C, 10 min; Adım 2: 95 ° C, 1 0.6 sıcaklık bir azalma ile s ° C/döngüsü; Adım 3: adım 2, 16 kere; git Adım 4: 85 ° C, 1 dk; Adım 5: 85 ° C, 1 s, sıcaklık bir azalma 0,6 ° C/döngüsü; Adım 6: adım 5, 16 kere; gidin Adım 7: 75 ° C, 1 dk; Adım 8: 75 ° C, 1 0.6 sıcaklık bir azalma ile s ° C/döngüsü; Adım 9: 16 kez adım 8, git. Adım 10-21: sıcaklık 25 ° C; ulaşıncaya kadar 4 – 9 adımda kullanılan yordamı yineleyin adım 22:25 ° C, 1 dak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tavlanmış gRNA oligos BtgZI sindirilmiş ve jel saf pMK U6 plazmid yerleştirin.
	<ol>
<li>Sindirilir pMK-U6 birleştirmek 100 ng 10 arabellek 2.1 ve 3 μL tavlanmış gRNA oligos, x 1 μL ile. Nükleaz ücretsiz su ile 9.5 μL birime artırın.</li>
		<li>T4 polimeraz 0.5 μL ekleyin ve reaksiyon 2.5 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
		<li>Buz ve 10 dakikadır kuluçkaya tepki taşıyın.</li>
		<li>Hemen tepki yetkili E. coli bakteri üreticinin yönergelerine uygun içine 5 μL dönüşümü. Lysogeny suyu (LB) ağar kaplamalar 100 μg/mL ampisilin içeren bakteri plaka.</li>
		<li>37 ° C'de bir gecede büyümek sonra kolonileri seçin ve DNA ile bir piyasada bulunan plasmid miniprep kit ayıklamak dönüştürülmüş bakteri izin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Homoloji bölgelerinde onarım şablon tasarımı
<ol><li>
Tasarım kalkan mutasyonlar genom entegre DNA'ın yeniden kesme önlemek için Homoloji onarım şablon içinde. Not: Cas9 bir ara onarım şablon ile teşvik değil PAM değiştirmek için sessiz bir mutasyon tanıtan bir kalkan mutasyon genellikle oluşur. Bu protokol için kullanılan Cas9 nükleotid dizisi "NGG", "N" herhangi bir nükleotit nerede için PAM gerekli. Mümkünse, bir A, C veya t G nükleotit birini değiştirmek<ol>
<li>PAM'yi sessizce mutasyona uğramış olamaz Eğer PAM7,8' e bitişik 6 baz çifti içine en az 2 Sessiz mutasyonlar tanıtmak. Not: Bu mutasyonlar onarım şablon tanınması gRNA tarafından önlemek ve Cas9/gRNA tarafından onarılan locus karmaşık yeniden kesme önlemek. Kalkan mutasyonlar Homoloji bölgeye DNA mutasyon içeren astar ile yükseltecek tarafından tanıttı olabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ORF Homoloji bölge onarım şablon için yükseltmek.
	<ol>
<li>PCR kullanarak, 800 baz çifti 3' sonundan itibaren hedef Gene'in ORF yükseltmek. Bu amplicon kodonu dışlamak için kullanılan astar tasarım.</li>
		<li>Bu amplicon SacII ve AfeI ile DNA ligasyonu tepki veya dilim16yoluyla sindirilmiş pHA -glmS içine ekleme için astar tasarım.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
3' UTR Homoloji bölge onarım şablon için yükseltmek.
	<ol>
<li>PCR kullanarak, hemen ardından kodonu hedef gen 800 baz çifti yükseltmek. Bu amplicon HindIII ve NheI ile bir DNA ligasyonu tepki veya dilim16üzerinden sindirilmiş pHA -glmS içine ekleme için tasarım astar. Not: P. falciparum genom içeriğini lisesinde UTRs gibi bölgelerde amplifikasyon zorlaştırabilir. PCR kullanarak alternatif bir yaklaşım Homoloji bölgeleri sentezleme.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. klonlama Homoloji bölgelere onarım plazmid
<ol><li>
ORF Homoloji bölge pHA -glmSyerleştirin.
	<ol>
<li>PHA -glmS SacII ve AfeI, enzim üretici yönergelerine göre sindirmek. ORF Homoloji bölge PCR ürünü kullanma dilim16sindirilir plazmid takın.</li>
		<li>Yetkili E. coli adım 2.3.4 ve 2.3.5 seslendirilen dönüşümü.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
3' UTR Homoloji bölge ORF Homoloji bölge içeren bir pHA-glmS plazmid takın (bkz. Adım 4.1).
	<ol>
<li>HindIII ve NheI ile plazmid enzim üretici yönergelerine göre sindirmek. 3' UTR Homoloji bölge amplicon dilim16kullanılarak sindirilir plazmid yerleştirin.</li>
		<li>Yetkili E. coli dönüştürmek ve plazmid DNA (adım 2.3.4 ve 2.3.5) ayıklayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Hizlandirici DNA Transfection için
<ol><li>40 μg her pMK-U6, pUF1-Cas9 ve pHA -glmS DNA (için toplam DNA'ın 120 μg) steril 1.5 mL microcentrifuge tüp içine ekleyin.</li>
	<li>1/10th eklemek DNA 3 M sodyum asetat su (pH 5.2) tüp hacmi ve iyi bir girdap kullanarak karıştırarak (Örneğin, adım 5.1 hacmindeki 100 μL olsaydı eklemek sodyum asetat 10 μL).</li>
	<li>% 100 etanol hacmi 2,5 kat tüp ve de en az 30 için bir girdap kullanarak karıştırın s (Örneğin, 5.1 ses 100 μL olsaydı Ekle % 100 etanol 250 μL).</li>
	<li>Tüp buz veya 30 dakika-20 ° C'de ekleyin.</li>
	<li>Tüp 18.300 x g 4 ° C'de 30 dk için de santrifüj kapasitesi</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde süpernatant tüpünden çıkarın. Pelet rahatsız etmeyin.</li>
	<li>% 70 etanol hacmi 3 kez tüp ve kısaca bir girdap kullanarak karıştırın (Örn., 5.1 ses 100 μL olsaydı % 70 etanol 300 μL eklemek).</li>
	<li>Tüp 18.300 x g 4 ° C'de 30 dk için de santrifüj kapasitesi Not: Bu adımı biyolojik güvenlik kabin steril koşullarda gerçekleştirilmesi gerekiyor.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde süpernatant tüpünden çıkarın. Pelet rahatsız etmeyin. Tüp açık bırakın ve Pelet 15dk için kurumasını bekleyin.</li>
	<li>Transfection için gerekinceye kadar zarlarını DNA-20 ° C'de depolayın.</li>
</ol>6. tam kan Transfection için hazırlık üzerinden insan RBCs yalıtma
<ol><li>Steril 50 mL konik tüpler (yaklaşık 25 mL tüp başına) içine aliquot taze kan.</li>
	<li>1,088 x g 12 dk için de tüpler santrifüj kapasitesi ile santrifüj fren 4'e ayarlayın.</li>
	<li>Süpernatant ve buffy kat Aspire edin. RBC Pelet eksik RPMI eşit bir hacmi ile resuspend. Not: Eksik RPMI RPMI 1640 10,32 mikron timidin, 110.2 mikron hypoxanthine, 1 mM sodyum pyruvate, 30 mM sodyum bikarbonat, 5 mM HEPES, 11.1 mM glikoz ve %0.02 (v/v) gentamisin ile ilave tarafından hazırlanmıştır.</li>
	<li>6.2-6.3 adımları iki kez tekrarlayın. Son yıkama sonra RBCs eşit birimlere eksik RPMI resuspend ve tüpler 4 ° C'de depolayın</li>
</ol>7. transfecting RBCs CRISPR/Cas9 Plasmid'ler ile (aseptik yapılması)
Not: P. falciparum kültürler diğer raporları17' açıklandığı gibi korunur. %3 O2, % 3 CO2ve % 94'ü N2 altında 37 ° C'de tüm kültürler aksi belirtilmedikçe korumak. Kan bu protokol için kullanıldığı her yerde 6. adımda hazırlanan saf kırmızı kan hücreleri için yönlendiriyordur. Olarak genellikle bir düşüş parazit nükleer silahların yayılmasına karşı büyük kan kanı kullanılan 6 hafta, eski olmamalıdır. Aşağıdaki adımlar, önceden yükleme RBCs DNA ve parazit kültür transfected hücrelere ekleme açıklar. Bu yapıları18,19transfecting ile uyumlu diğer kurulan transfection kurallarıdır.
<ol><li>Su (120 mM KCl, 0.15 mM CaCl2, 2 mM EGTA, 5 mM MgCl2, 10 mM K2HPO4, 25 mM HEPES, pH 7,6) 1 x cytomix arabellekte hazırlayın. 0,22 mikron filtre kullanarak filtre olarak sterilize et.</li>
	<li>DNA için 1 x cytomix 380 μL adım 5 ve çözülmeye girdap çöktürülmüş ekleyin. 10 dakika, vortexing her 3 dakikada 10 için 1 x cytomix çözülmeye DNA izin s.</li>
	<li>Steril 15 mL konik tüp RBCs 300 μL birleştirmek (% 50 hematokrit, adım 6) ile 4 mL 1 x cytomix eksik RPMI içinde.</li>
	<li>Adım 7,3 870 x g 3 dk de RBCs santrifüj kapasitesi ve süpernatant RBC Pelet kaldır.</li>
	<li>RBC Pelet adım 6.2 DNA/cytomix karışımı ile ve 0.2 cm Elektroporasyon küvet transfer resuspend.</li>
	<li>Electroporate aşağıdaki koşullar kullanarak RBCs: 0,32 kV, 925 μF, "Yüksek kap" ayarlı direnç kapasitans ayarla "Sonsuz".</li>
	<li>Elektroporasyon içeriği tam RPMI (cRPMI) için bir 15 mL konik içeren 5 mL küvet aktarın. 870 x g 20 ° C'de 3 dk de tüp santrifüj kapasitesi ve süpernatant dikkatle boşaltmak. Not: cRPMI % 0.25 (w/v) lipid zengini Sığır serum albümin ilavesi ile eksik RPMI olarak aynı yöntemi ile hazırlanır.</li>
	<li>Pelet 4 ml cRPMI ve bir 6-iyi doku kültürü plaka bir kuyuda transfer resuspend. Bir yüksek-schizont kültürün 400 μL ekleyin (7-%10 schizont parasitemia idealdir) transfected RBCs için. Not: Parasitemia parazit bulaşmış RBCs yüzdesi olarak tanımlanır.</li>
	<li>Ertesi gün, kültür cRPMI 4 mL ile yıkayın. 870 x g 3 dk de kültür santrifüj kapasitesi ve süpernatant Aspire edin. Kültür 4 mL cRPMI resuspend.</li>
	<li>Adım 7,6, tamamladıktan sonra 48 h kültür cRPMI 4 mL ile yıkayın. 1 mikron içeren cRPMI kültür resuspend DSM1 Cas9 plazmid için seçin.</li>
	<li>
Parazitler artık kan yayması tarafından görünür hale gelene kadar her gün cRPMI ile kültürler yıkama devam edin. Bu noktadan sonra taze cRPMI artı 1 mikron ile kültür orta yerine DSM1 her 48 h.
	<ol>
<li>Bir kan yayma, kültür 150 μL 0.6 mL santrifüj tüpüne pipet yapmak. Hücreleri tarafından Santrifüjü 1.700 x g 30 de cips s.</li>
		<li>Süpernatant Aspire edin. Bir pipet pelleted hücreleri bir cam slayt aktarmak için kullanın. İlk slayt için 45 ° açıyla düzenlenen ikinci bir cam slayt kullanarak, kan damlacık yayma. Üreticinin protokolüne göre piyasada bulunan bir boyama seti kullanarak slayt leke.</li>
		<li>Bir 100 X yağı daldırma amacı istimal parazitler görüntüleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>5 gün başlayan sonrası transfection (7,6. adım) kaldırmak 2 mL kültür kültür ortamında resuspended RBCs ile. Taze orta arka 2 mL ekleyin (cRPMI artı 1 mikron DSM1) ve % 2 hematokrit kana. Bir kez bir hafta öncesine kadar parazitler yeniden, taze kan ince kan yayması (adım 7,11) tarafından belirlenen bu şekilde ekleyin. Not: Tümleştirme başarılı olursa, parazitler genellikle kültüründe bir ay sonrası transfection tarafından yeniden görünür.</li>
	<li>Bir kez parazitler reemerge, DSM1 uyuşturucu basıncı kaldır. Alternatif olarak, parazitleri dışarı klonlanmış sonra uyuşturucu basınç kaldırın.</li>
</ol>8. kontrol parazitler için onarım şablon entegrasyon
<ol><li>Parazitler daha ince kan yayması tarafından görünür olduğunda, DNA uygun bir seti kullanarak kültüründen izole et.</li>
	<li>
PCR değiştirilmiş bölge hedefli locus başarıyla değiştirildi ve değiştirilmemiş vahşi tipi odağı (vahşi tipi parazitler gösterge) tespit ise belirlemek için genomunun yükseltmek için kullanın.
	<ol>
<li>Onarım şablon entegre etmiş parazitler algılamak için klonlanmış Homoloji bölge dışında ORF başında oturur ileri bir astar kullanın. İçinde 3'-UTR'nin oturur ters bir astar kullanın. Not: Bu amplifikasyon HA Etiketler ve glmS ribozyme dizileri içerir, amplicons entegre parazitler gelen vahşi tipi parazitler içinde güçlendirilmiş aynı bölgede daha uzun olacaktır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. seyreltme sınırlayarak parazitler klonlama
<ol><li>
Parazit kültürünün seri dilutions adımı 7,13 0.5 parazitler/200 μL son bir konsantrasyon elde etmek için gerçekleştirin. 200 μL seyreltilmiş kültürünün bir 96-iyi doku kültürü tabak wells için ekleyin. Not: çünkü parasitemia enfekte RBCs yüzdesi olarak tanımlanır ve hematokrit tanımlanmış numarası (% 2) Ayrıca, parazitler birim hacim başına sayısı kolayca anlaşılmaktadır.<ol>
<li>1 mL cRPMI %5 parasitemia ve % 2 hematokrit, kültür hazırlamak (Bu parasitemia ve hematokrit düzeylerinde kültürü 1 x 107 parazitler/mL içerir).</li>
		<li>CRPMI ile bu kültür 1: 100 oranında seyreltin. Yine cRPMI ile 1: 100 oranında seyreltin.</li>
		<li>1: 400 oranında seyreltin. Bu seyreltme 25 mL cRPMI ve 1 mL kan kültür 62.5 μL ekleyerek gerçekleştirin. Bu seyreltme 0.5 parazitler/200 μL istenen konsantrasyon sonuçlanır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Parazitler wells için yapılan tespit olana klonlama plaka korumak.
	<ol>
<li>Her 48 h, 96-şey plaka ortamda ile taze orta yerine.</li>
		<li>Haftada bir kez, klonlama plaka (adım 9.1) başlayan sonra 5 gün başlayarak, her kuyudan 100 μL kaldırın ve geri 100 μL taze orta + kan (%2 hematokrit) ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Parazit içeren herhangi bir kuyu tanımlayın.
	<ol>
<li>96-şey plaka için yaklaşık 20 dk kan plaka içinde bir açıyla yerleşmek izin, bir 45 ° açıyla yerleştirin.</li>
		<li>96-şey plaka üzerinde bir ışık kutusu yerleştirin. Parazit içeren wells asitleştirme parazitler tarafından orta nedeniyle parazit ücretsiz Wells pembe medyaya göre renkli, sarı bir medya içermediğine dikkat edin.</li>
		<li>Serolojik pipet kullanarak, parazit içeren wells içeriğini parasitemia genişlemesi izin vermek için bir 24-iyi doku kültürü plaka taşı.</li>
		<li>PCR analiz 8. adımda açıklandığı gibi kullanarak, bu klonal parazit satırları doğru tümleştirme için denetleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>10. nakavt parazitler Glucosamine ve Western Blot analizi yoluyla onay ile davranarak protein
<ol><li>-20 ° C'de depolanan bir 0, 5 M GlcN (glucosamine) hisse senedi çözüm hazırlamak</li>
	<li>Ve GlcN huzurunda büyümeye izin GlcN glmS parazit kültürler için ekleyin. Not: Son konsantrasyon ve zamanlama GlcN tedavi deney ve parazit hatta bağlıdır. Yani hassasiyeti bileşiği belirlemek için bir Aralık GlcN konsantrasyonları ebeveyn parazit zorlanma maruz GlcN parazit büyüme, etkileyebilir. Çoğu zaman, bir konsantrasyon 2.0-7.5 mm GlcN kullanılan13,14,20' dir.</li>
	<li>Protein örnekleri13GlcN tedavi parazitleri izole et.</li>
	<li>
Protein örnekleri western blot analizi için protein13' te indirimleri algılamak için kullanır.
	<ol>
<li>Üreticinin yönergelerine uygun bir anti-HA antikor HA glmS öğesini protein algılamak için kullanır. PfEF1α gibi bir yükleme denetim HA gruba karşılaştırın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22World+Malaria+Report%22">World Malaria Report</a>. , World Health Organization. Geneva. (2017).</li>
<li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenic+basis+of+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).</li>
<li>Florentin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PfClpC+Is+an+Essential+Clp+Chaperone+Required+for+Plastid+Integrity+and+Clp+Protease+Stability+in+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">PfClpC Is an Essential Clp Chaperone Required for Plastid Integrity and Clp Protease Stability in Plasmodium falciparum.</a> Cell Reports. 21 (7), 1746-1756 (2017).</li>
<li>Muralidharan, V., Oksman, A., Pal, P., Lindquist, S., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum+heat+shock+protein+110+stabilizes+the+asparagine+repeat-rich+parasite+proteome+during+malarial+fevers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum heat shock protein 110 stabilizes the asparagine repeat-rich parasite proteome during malarial fevers.</a> Nature Communications. 3, 1310(2012).</li>
<li>Muralidharan, V., Oksman, A., Iwamoto, M., Wandless, T. J., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asparagine+repeat+function+in+a+Plasmodium+falciparum+protein+assessed+via+a+regulatable+fluorescent+affinity+tag%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+the+USA%22%5BJournal%5D)">Asparagine repeat function in a Plasmodium falciparum protein assessed via a regulatable fluorescent affinity tag.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences the USA. 108 (11), 4411-4416 (2011).</li>
<li>Beck, J. R., Muralidharan, V., Oksman, A., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTEX+component+HSP101+mediates+export+of+diverse+malaria+effectors+into+host+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PTEX component HSP101 mediates export of diverse malaria effectors into host erythrocytes.</a> Nature. 511 (7511), 592-595 (2014).</li>
<li>Ghorbal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 819-821 (2014).</li>
<li>Wagner, J. C., Platt, R. J., Goldfless, S. J., Zhang, F., Niles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+CRISPR-Cas9-mediated+genome+editing+in+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient CRISPR-Cas9-mediated genome editing in Plasmodium falciparum.</a> Nature Methods. 11 (9), 915-918 (2014).</li>
<li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096(2014).</li>
<li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+in+Genome+Editing+and+Beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).</li>
<li>Kirkman, L. A., Deitsch, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+variation+and+the+generation+of+diversity+in+malaria+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Antigenic variation and the generation of diversity in malaria parasites.</a> Current Opinion in Microbiology. 15 (4), 456-462 (2012).</li>
<li>Lee, A. H., Symington, L. S., Fidock, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Repair+Mechanisms+and+Their+Biological+Roles+in+the+Malaria+Parasite+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">DNA Repair Mechanisms and Their Biological Roles in the Malaria Parasite Plasmodium falciparum.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 469-486 (2014).</li>
<li>Cobb, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Exported+Chaperone+PfHsp70x+Is+Dispensable+for+the+Plasmodium+falciparum+Intraerythrocytic+Life+Cycle%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">The Exported Chaperone PfHsp70x Is Dispensable for the Plasmodium falciparum Intraerythrocytic Life Cycle.</a> mSphere. 2 (5), (2017).</li>
<li>Prommana, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+knockdown+of+Plasmodium+gene+expression+using+the+glmS+ribozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+One%22%5BJournal%5D)">Inducible knockdown of Plasmodium gene expression using the glmS ribozyme.</a> Public Library of Science One. 8 (8), e73783(2013).</li>
<li>Ganesan, S. M., Falla, A., Goldfless, S. J., Nasamu, A. S., Niles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+RNA-protein+modules+integrated+with+native+translation+mechanisms+to+control+gene+expression+in+malaria+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Synthetic RNA-protein modules integrated with native translation mechanisms to control gene expression in malaria parasites.</a> Nature Communications. 7, 10727(2016).</li>
<li>Li, M. Z., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+homologous+recombination+in+vitro+to+generate+recombinant+DNA+via+SLIC%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC.</a> Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).</li>
<li>Drew, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+food+vacuole+plasmepsins+are+activated+by+falcipains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Plasmodium food vacuole plasmepsins are activated by falcipains.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (19), 12870-12876 (2008).</li>
<li>Wu, Y., Sifri, C. D., Lei, H. -H., Su, X. -Z., Wellems, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+Plasmodium+falciparum+within+human+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Transfection of Plasmodium falciparum within human red blood cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 92, 973-977 (1995).</li>
<li>Janse, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transfection+of+Plasmodium+berghei+facilitates+novel+selection+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">High efficiency transfection of Plasmodium berghei facilitates novel selection procedures.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 145 (1), 60-70 (2006).</li>
<li>Counihan, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum+parasites+deploy+RhopH2+into+the+host+erythrocyte+to+obtain+nutrients%2C+grow+and+replicate%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum parasites deploy RhopH2 into the host erythrocyte to obtain nutrients, grow and replicate.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>Klemba, M., Beatty, W., Gluzman, I., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+plasmepsin+II+to+the+food+vacuole+of+the+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Trafficking of plasmepsin II to the food vacuole of the malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Journal of Cell Biology. 164 (1), 47-56 (2004).</li>
<li>Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHOPCHOP+v2%3A+a+web+tool+for+the+next+generation+of+CRISPR+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Resesarch%22%5BJournal%5D)">CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering.</a> Nucleic Acids Resesarch. 44 (W1), W272-W276 (2016).</li>
<li>Peng, D., Tarleton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EuPaGDT%3A+a+web+tool+tailored+to+design+CRISPR+guide+RNAs+for+eukaryotic+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Genomes%22%5BJournal%5D)">EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens.</a> Microbial Genomes. 1 (4), e000033(2015).</li>
<li>Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Gene+Disruption+in+Diverse+Strains+of+Toxoplasma+gondii+Using+CRISPR%2FCAS9%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9.</a> mBio. 5 (3), (2014).</li>
<li>Janssen, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+gene+modification+and+gene+knock+out+in+the+human-infective+parasite+Trichomonas+vaginalis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated gene modification and gene knock out in the human-infective parasite Trichomonas vaginalis.</a> Scientific Reports. 8 (1), 270(2018).</li>
<li>Spillman, N. J., Beck, J. R., Ganesan, S. M., Niles, J. C., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chaperonin+TRiC+forms+an+oligomeric+complex+in+the+malaria+parasite+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The chaperonin TRiC forms an oligomeric complex in the malaria parasite cytosol.</a> Cellular Microbiology. 19 (6), (2017).</li>
<li>Brancucci, N. M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophosphatidylcholine+Regulates+Sexual+Stage+Differentiation+in+the+Human+Malaria+Parasite+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lysophosphatidylcholine Regulates Sexual Stage Differentiation in the Human Malaria Parasite Plasmodium falciparum.</a> Cell. , (2017).</li>
<li>Ng, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9-modified+pfmdr1+protects+Plasmodium+falciparum+asexual+blood+stages+and+gametocytes+against+a+class+of+piperazine-containing+compounds+but+potentiates+artemisinin-based+combination+therapy+partner+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9-modified pfmdr1 protects Plasmodium falciparum asexual blood stages and gametocytes against a class of piperazine-containing compounds but potentiates artemisinin-based combination therapy partner drugs.</a> Molecular Microbiology. 101 (3), 381-393 (2016).</li>
<li>Lim, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UDP-galactose+and+acetyl-CoA+transporters+as+Plasmodium+multidrug+resistance+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">UDP-galactose and acetyl-CoA transporters as Plasmodium multidrug resistance genes.</a> Nature Microbiology. , (2016).</li>
<li>Adjalley, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+Plasmodium+falciparum+sexual+development+reveals+potent+transmission+blocking+activity+by+methylene+blue%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of Plasmodium falciparum sexual development reveals potent transmission blocking activity by methylene blue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (47), E1214-E1223 (2011).</li>
<li>Sidik, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Genome-wide+CRISPR+Screen+in+Toxoplasma+Identifies+Essential+Apicomplexan+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes.</a> Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).</li>
<li>Amberg-Johnson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+inhibition+of+apicomplexan+FtsH1+disrupts+plastid+biogenesis+in+human+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22elife%22%5BJournal%5D)">Small molecule inhibition of apicomplexan FtsH1 disrupts plastid biogenesis in human pathogens.</a> elife. 6, (2017).</li>
<li>Crawford, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid-free+CRISPR%2FCas9+genome+editing+in+Plasmodium+falciparum+confirms+mutations+conferring+resistance+to+the+dihydroisoquinolone+clinical+candidate+SJ733%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+One%22%5BJournal%5D)">Plasmid-free CRISPR/Cas9 genome editing in Plasmodium falciparum confirms mutations conferring resistance to the dihydroisoquinolone clinical candidate SJ733.</a> Public Library of Science One. 12 (5), e0178163(2017).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

CRISPR/Cas9 P. falciparum olarak uygulanması hem verimliliği artan ve asıl olayın asalağın genom, genetik manipülasyon önceki yöntemlerine göre değiştirmek için gereken süreyi azalmıştır. Bu kapsamlı protokol koşullu mutantlar CRISPR/Cas9 P. falciparumkullanarak oluşturmak için gereken adımları açıklar. Yöntemi özellikle HA -glmS mutantlar üretimi için tasarlanmış olsa da, bu strateji ihtiyaçları, genler, gen renkleri çakıştırmama ve giriş noktası mutasyonların etiketleme de dahil olmak üzere ç...

Sıtma Plasmodiumcinsi protozoon parazitler tarafından neden yıkıcı bir hastalıktır. P. falciparum, en ölümcül insan sıtma parazit, her yıl, yaklaşık 445.000 ölümler çoğunlukla beş1yaşın altındaki çocuklarda neden olur. Plasmodium parazitleri bir sivrisinek vektör ve omurgalı bir ana bilgisayar içeren karmaşık bir yaşam döngüsü var. Ne zaman virüslü bir sivrisinek bir kan yemek alır insanlar ilk bulaşabilir. O zaman, parazit nerede büyür, gelişir ve yaklaşık bir hafta için böler karaciğer işgal etti. Bu işlem sonra parazitleri kan dolaşımına nerede kırmızı kan hücrelerinde (RBCs) eşeysiz çoğaltma geçmesi, serbest bırakılır. Büyüme parazit RBCs içinde sıtma2ile ilişkili klinik belirtiler doğrudan sorumlu.
Yakın zamana kadar transgenik P. falciparum üretim zahmetli bir süreç, birkaç tur birçok ay sürdü ve yüksek başarısızlık oranı olan ilaç seçimi içeren oldu. Bu zaman alan yordamı relieson rasgele DNA nesil bölgenin ilgi ve parazit endojen yeteneğine rağmen genomunu onarmaya tatili homolog onarım3,4,5,6 . Son zamanlarda, kümelenmiş düzenli olarak Interspaced palindromik tekrar/Cas9 (CRISPR/Cas9) genom düzenleme başarıyla P. falciparum7,8' kullanılmıştır. Bu yeni teknoloji sıtma araştırma giriş yapılmış bu ölümcül Plasmodium parazitler biyoloji anlayış ilerleyen için kritik. CRISPR/Cas9 Kılavuzu RNA'ların (gRNAs) faiz gen için homolog genlerin özel hedefleme için sağlar. GRNA/Cas9 karmaşık gen gRNA yoluyla tanır ve Cas9 sonra tamir mekanizmaları organizma9,10inisiyasyon zorlama iki iplikçikli mola tanıtır. P. falciparum homolog olmayan son katılma yoluyla DNA sonları onarmak için makine eksik olduğundan, Homolog rekombinasyon mekanizmaları kullanır ve Cas9/gRNA-indüklenen onarmak için transfected homolog DNA şablonları entegre iki iplikçikli ara11,12.
Burada, bir protokol P. falciparum koşullu devirme mutantların üretimi için CRISPR/Cas9 genom düzenleme kullanarak mevcut. Protokol glmS ribozyme PfHsp70x koşullu olarak devirme protein düzeyleri için kullanımı gösterilmiştir (PF3D7_0831700), bir koruyucuya ihraç P. falciparum tarafından ev sahibi RBCs13,14. GlmS ribozyme (ki glucosamine-6-fosfat hücrelerdeki dönüştürülür) glucosamine ile tedavi tarafından protein14bir azalma önde gelen onun ilişkili mRNA ayırmak için etkinleştirilir. Bu iletişim kuralı kolayca istikrarsızlık etki alanları veya RNA aptamers4,5,15gibi diğer koşullu devirme araçlarını kullanmak için adapte edilebilir. Bizim iletişim kuralı dizileri tarafından çevrili sıra kodlama hemagglutinin (HA) etiketi ve glmS ribozyme oluşan bir onarım plazmid nesil bu PfHsp70x açık okuma çerçevesi (ORF) ve 3' UTR homolog ayrıntılardır. Ayrıca gRNA sürücü ifade için ikinci bir plazmid nesil açıklar. Bir ifade Cas9, sürücüler üçüncü ile birlikte bu iki plazmit RBCs transfected ve P. falciparum parazitler genom değiştirmek için kullanılır. Son olarak, biz bir polimeraz zincir tepkimesi (PCR) tarif-entegrasyon-in etiket ve glmS ribozyme doğrulamak için teknik dayalı. Bu son derece uyarlanabilir ve/veya sıtma parazit biyoloji yeni görüşler üretmek için bizim yetenek geliştirme herhangi bir P. falciparum genlerin tam nakavt için iletişim kuralıdır.

<table><tbody><tr><td>Gene Pulser Xcell Elektroporatör</td><td>Bio-Rad</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell Elektroporatör</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2086</td><td>Ayrı ayrı sarılmış olanları satın alıyoruz</td></tr><tr><td>Sodyum Asetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889-250g</td><td></td></tr><tr><td>DSM1</td><td>Hediyesi Akhil Vaidya laboratuvarı</td><td>Ganesan'dan et al. Mol. Biyokimya. Parazitol. 2011 177:29-34</td><td></td></tr><tr><td>TPP Doku Kültürü 6 Kuyulu Plakalar</td><td>MIDSCI</td><td>TP92006</td><td></td></tr><tr><td>TPP 100 mm Doku Kültürü Kapları (12 mL Plaka)</td><td>MIDSCI</td><td>TP93100</td><td></td></tr><tr><td>TPP Doku Kültürü 96 Kuyulu Plakalar</td><td>MIDSCI</td><td>TP92096</td><td></td></tr><tr><td>TPP Doku Kültürü 24 Kuyulu Plakalar</td><td>MIDSCI</td><td>TP92024</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2</td><td>New England Biolabs</td><td>#B7002S</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2.1</td><td>New England Biolabs</td><td>#B7202S</td><td></td></tr><tr><td>BtgZI</td><td>New England Biolabs</td><td>#R0703L</td><td></td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs</td><td>#R0157L</td> HindIII-HF New England Biolabs#R3104S <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Afe1</td><td>New England Biolabs</td><td>#R0652S</td><td></td></tr><tr><td>Nhe1-HF</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td></td>#R3131L</tr><tr><td>T4 DNA Polimeraz</td><td>New England Biolabs</td><td>#M0203S</td><td></td></tr><tr><td>500 mL Steritop şişe üstü filtre ünitesi</td><td>Millipore</td><td>SCGPU10RE</td><td>İhtiyaçlarınıza uygun herhangi bir boyutta kullanabilirsiniz</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378-100G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500g</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902-500g</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</sub</td><td>>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-100g</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Fisher</td><td>P288-500</td><td></td></tr><tr><td>Muralidharan Laboratuvarı tarafından üretilen</td><td></td> HEPES sigma-Aldrich H4034-500g<td></td> pMK-U6 n/a Muralidharan Lab n/a <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> tarafından üretilen pHA-glmS Muralidharan Lab n/a tarafından üretilen <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jose-Juan Lopez-Rubio Laboratuvarı'ndan</td> <td>pUF1-Cas9</td> Hediyesi <td>Ghorbal et al. Nature Biotech 2014</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum piruvat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280-100G</td><td></td></tr><tr><td>Hipoksantin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9636-25G</td><td></td></tr><tr><td>Gentamisin Reaktifi</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>Timidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1895-1G</td><td></td></tr><tr>PL6-eGFP <td>Muralidharan Laboratuvarı Tarafından Üretilen</td><td>PL6-eGFP BSD</td> Muralidharan Laboratuvarı <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Jel ve PCR Temizleme</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.250</td><td></td> Tarafından Üretilen gRNA</tr><tr><td>Albumax I</td><td>Life Technologies</td><td>N/A</td><td>Parazitlerin en iyi şekilde ne yetiştireceğini öğrenmek için birkaç parti denemek isteyeceksiniz</td></tr><tr><td>İnsan Kırmızı Kan Hücreleri</td><td>Interstate Blood Bank, Inc</td><td>E-posta gönderin veya sipariş için doğrudan arayın</td><td>Genellikle O + kan</td></tr><tr><td>3D7 parazit hattı</td> kullanırız <td>İstek üzerine temin edilebilir</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Lizojen Et Suyu (LB)</td> <td>Fisher</td><td>BP1426-2</td><td>Kendiniz yapabilirsiniz, tam olarak bu</td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>Fisher</td><td>BP1760-25'i</td> kullanmanıza gerek yoktur <td>Suda 100mg / ml'de 1000X stok yapıyoruz ve -20C</td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>Clonetech</td><td>R050A</td><td></td></tr><tr><td>Anti-EF1alpha'da</td> saklıyoruz <td>Dr. Daniel Goldberg'in Laboratuvarı</td><td>St. Louis'deki Washington Üniversitesi</td><td>Batı lekeleri için tercih ettiğiniz yükleme kontrolünü kullanabilirsiniz. Bu sadece laboratuvarımızda kullandığımız</td></tr><tr><td>Sıçan Anti-HA Klonu 3F10, monoklonal</td><td>Roche tarafından üretilen, Sigma tarafından satılan,</td><td>11867423001</td><td>Tercih ettiğiniz anti-HA antikoru</td></tr><tr><td>0.6 mL tüpleri</td> kullanabilirsiniz <td>Fisher</td><td>AB0350</td><td></td></tr><tr><td>Fisher HealthCare* PROTOKOL* Hema 3* Manuel Boyama Sistemi (Fiksatif+Solüsyon I ve II)</td><td>Fisher</td><td>22-122-911</td><td>Giemsa boyasını</td></tr> <tr><td>da kullanabilirsinizFisherfines Premium Buzlu Mikroskop Slaytları - Boyut: 3 x 1 inç.</td><td>Balıkçı</td><td>12-544-3</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr/cas9 gen düzenleme yapmak koşullu mutantlar, insan sıtma parazit p. falciparum için

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

Sıtma morbidite ve mortalite dünya çapında önemli bir nedenidir. Öncelikle tropikal ve subtropikal bölgelerde yaşayanlar etkiler, bu hastalığı enfeksiyon için Plasmodium parazit neden olur. Daha etkili mücadele sıtma ilaçlara gelişimi bu karmaşık parazit biyoloji anlayışımız geliştirerek hızlandırılabilir. Bu parazitler genetik manipülasyon biyolojilerinin anlama anahtarıdır; Ancak, tarihsel olarak P. falciparum genom işlemek zor olmuştur. Son zamanlarda, sıtma parazit, etiketleme, koşullu protein nakavtlar nesil ve silme genlerin daha kolay protein için izin içinde CRISPR/Cas9 genom düzenleme kullanılmıştır. CRISPR/Cas9 genom düzenleme alanı sıtma araştırmanın ilerleyen için güçlü bir araç olduğu ispatlanmıştır. Burada, glmSüretmek için CRISPR/Cas9 yöntemi açıklamak- P. falciparumkoşullu devirme mutantlar dayalı. Bu yöntem son derece gen basılmasını ve genetik manipülasyon, protein etiketleme de dahil olmak üzere, diğer türleri için uyarlanabilir.

Kullanılan bu yöntem yanı sıra bir kalkan mutasyon örneği plazmid şematik resim 1' de gösterilmiştir. Transfection sonra mutant parazitler nasıl bir örnek olarak, HA -glmS yapı entegrasyonu denetimi PCR sonuçlarını Şekil 2' de gösterilir. Klonlama bir tabak temsilcisi bir görüntüsünü parazitler huzurunda orta renk değişimi göstermek için Şekil 3 ' te gösterilmiştir. Bir ayirt tahlil ve weste...

Biz glmSoluşturmak için bir yöntem tarif- Plasmodium falciparum CRISPR/Cas9 genom düzenleme kullanarak koşullu devirme mutantlar dayalı.

CRISPR/Cas9 gen düzenleme yapmak koşullu mutantlar, insan sıtma parazit P. falciparum için

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Bu yöntem, insan sıtma paraziti, P.Falciparum biyolojisinde anahtar sorulara cevap yardımcı olarak, koşullu nakavt yoluyla protein fonksiyonu ortaya çıkarmak için yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, önceki yöntemlere göre koşullu mutantların nispeten kolay nesil sağlar olmasıdır. Başlamak için Chop Chop'a gidin ve Fasta Target'Under Target'ı seçin, bir genin açık okuma çerçevesinin üç ana ucundan 200 baz çiftini ve genin üç ana UTR'sinin başlangıcından itibaren 200 baz çiftini yapıştırın.In'select P.Falciparum'un altında ve CRISPR/Cas9'under'ı seçin'Next' seçeneğini tıklatın, sunulan seçeneklerden Hedef Siteleri Bul'Select'in bir gRNA dizisini seçin, modifikasyon sitesine en yakın ve hedef dışı en az siteye sahip olan en verimli gRNA'yı tercih edin. Satın gRNA dizisi ve poliakrilamid jel elektroforez saf oligos olarak ters kompleman. PfH-sp70x'i hedeflemek için kullanılan gRNA dizisi metin protokolünde bulunabilir.Steril 1,5 milimetrelik bir santimetrelik santimetrelik tüpe pMK-U6, pUF1-Cas9 ve pHA-glmS DNA'sının her birini 40 mikrogram ekleyin. Suya üç azı lı sodyum asetat DNA hacminin onda birini tüpüne ekleyin ve bir girdap kullanarak iyice karıştırın. Daha sonra, tüpe yüzde 100 etanol hacmi 2,5 kat ekleyin ve en az 30 saniye boyunca bir girdap kullanarak iyice karıştırın.Tüpü buza veya eksi 20 derecede 30 dakika yerleştirin. Sonra, tüpü 18, 300 kez G'de 30 dakika 4 santigrat derecede santrifüj edin. Santrifüjden sonra, peleti rahatsız etmeden süpernatantı tüpten dikkatlice çıkarın.Tüpe yüzde 70 etanol hacminin üç katını ekleyin ve bir girdap kullanarak kısa bir süre karıştırın. Tüpü 18, 300 kez G'de 4 santigrat derecede 30 dakika santrifüj edin. Yine, dikkatle pelet rahatsız etmeden tüpten supernatant çıkarın.Tüpü açık bırakın ve peletin 15 dakika kurumasını bekleyin. Çökelmiş DNA'yı transfeksiyon için gerekli olana kadar eksi 20 derecede saklayın. Transfect RBC'ler için, metin protokolünde açıklandığı gibi 1X sitomix arabelleği ve eksik ve eksiksiz RPMI hazırlayın.Filtre 0,22 mikron filtre kullanarak arabellek sterilize. Çözünmek için DNA ve girdap için 1X sitomix 380 mikrolitre ekleyin. DNA'nın 1X sitomikte 10 dakika boyunca erimesine izin verin, her üç dakikada bir 10 saniye girdap.Steril bir, 15 mililitre konik tüp, 1X sitomix dört mililitre ile tamamlanmamış RPMI izole insan RbCs 300 mikrolitre birleştirir. RBC'leri 870 kez G'de üç dakika santrifüj edin. Sonra RBC pelet supernatant çıkarın.DNA-sitomik karışımı ile RBC pelet yeniden askıya ve 0.2 santimetre elektroporasyon cuvette aktarın. Metin protokolünde listelenen koşulları kullanarak RBC'leri porate. Elektroporasyondan sonra, içindekileri cuvette'den beş mililitre tam RPMI içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.Tüpü 870 kez G'de 20 santigrat derecede üç dakika santrifüj edin. Sonra, supernatant decant. Şimdi, peleti dört mililitre lik tam RPMI'de yeniden askıya alıp altı kuyulu doku kültürü plakasında ki bir kuyuya aktarın.Aktarılan RBC'lere 400 mikrolitre yüksek schizont kültürü ekleyin. Ertesi gün, tam RPMI dört mililitre ile kültür yıkayın.Kültürü 870 kez G'de üç dakika santrifüj edin. Süpernatant aspire. Dört mililitre tam RPMI kültürü yeniden askıya alın.48 saat sonra, tam RPMI dört mililitre ile kültür yıkayın. Daha sonra, Cas9 plazmid için seçmek için bir mikromolar DSM1 içeren tam RPMI kültürü yeniden askıya. Bu noktadan sonra, taze tam RPMI artı bir mikromolar DSM1 her 48 saatte bir kültür ortamı değiştirin.Parazitler artık kan yayma ile görünür kadar tam RPMI ile her gün kültürleri yıkamaya devam edin. Bir kan bulaşması yapmak için, pipet kültür 150 mikrolitre bir 0.6 mililitre santrifüj tüp içine. Hücreleri santrifüj ile 30 saniye boyunca 1, 700 kez G'de peletledıktan sonra, süpernatanttan aspirasyon.Peletli hücreleri cam bir slayta aktarmak için bir pipet kullanın. İlk slayt için 45 derecelik açıyla düzenlenen ikinci bir cam slayt kullanarak, kan damlacık smear. Üreticinin protokolüne göre ticari olarak kullanılabilen bir boyama kiti kullanarak slaydı lekeleyin.Parazitleri 100 kez yağ daldırma amacı kullanarak görüntüleyin. Transfeksiyon sonrası beş gün başlayarak, kültür ortamında yeniden askıya alınan KÇ'ler ile kültürün iki mililitresini çıkarın. %2 hematokrit taze orta ve kan iki mililitre geri ekleyin.Parazit yeniden ortaya çıkana kadar haftada bir kez bu şekilde taze kan ekleyin, ince kan yayma tarafından belirlenen. 200 mikrolitre başına 0,5 parazit son konsantrasyonu elde etmek için parazit kültürünün seri seyreltme gerçekleştirin. 96 kuyulu doku kültürü plakasının kuyularına seyreltilmiş kültürün 200 mikrolitresini ekleyin.Parazitler kuyularda tespit edilene kadar klonlama plakasını koruyun. Her 48 saatte bir, 96 kuyulu tabaktaki ortayı taze orta ile değiştirin. Haftada bir kez, klonlama plakası başladıktan beş gün sonra, her kuyudan 100 mikrolitre çıkarın ve taze orta artı kan 100 mikrolitre geri ekleyin.Parazit içeren kuyuları belirlemek için, 96 kuyulu plakayı yaklaşık 20 dakika boyunca 45 derecelik bir açıyla yerleştirin ve kanın plaka içinde bir açıyla yerleşmesini bekleyin. Daha sonra, 96-kuyu plakasını bir ışık kutusuna yerleştirin. Parazit içeren kuyuların, parazitsiz kuyuların pembe ortamına kıyasla, parazitsiz kuyuların pembe ortamına göre sarı renkli ortam içerdiğine dikkat edin.Serolojik pipet kullanarak, parazit içeren kuyuların içeriğini parazitin genişlemesine izin vermek için 24 kuyulu doku kültürü plakasına taşıyın. PCR çözümlemesi kullanarak, doğru tümleştirme için bu klonal parazit hatlarını kontrol edin. Bir immünüffloresans tahsin sonuçları burada gösterilmiştir, PfH-sp70x başarılı HA etiketleme gösteren.PfH-sp70x glmS parazitleri bir çekirdek belirteci olarak DAPI ile ve HA antikorları ile sabit ve lekeli idi. Membran ilişkili histidin zengin protein bir, konak RBC protein ihracatı bir belirteç. Burada glukozamin ile tedavi sonrası PfH-sp70x protein düzeyinin Western Blot analizi gösterilmiştir. Beklendiği gibi, tedavi süresince protein düzeyi azalır.Bu teknik, parazitoloji alanında araştırmacıların sıtma parazitinin biyolojisindeki temel soruları araştırmalarının önünü açsA. P.Falciparum'un kan yoluyla bulaşan bir patojen olduğunu ve bu işlemi gerçekleştirirken uygun kişisel koruyucu ekipmanın takılması gerektiğini unutmamak gerekir.

crisprcas9-gene-editing-to-make-conditional-mutants-human-malaria

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Detaylar, Toxoplasma gondii'de bir ilaca direnç genini tanımlamak için bütün genom dizisi tabanlı bir genetik harita ile QTL haritalamasının nasıl kullanılacağı ve bunun, bir genomik hedefi verimli bir şekilde düzenleyen CRISPR / Cas9 sistemi ile nasıl doğrulanabileceği üzerine sunulmaktadır; bu durumda Ilaç direnci geni.

QTL Haritalama ve CRISPR / Cas9 Düzenlemesi, bir İlaç Direnç Geninin Belirlenmesi için<emToksoplasma gondii</em

CRISPR/Cas9 kullanarak hedeflenen gen düzenleme büyük ölçüde anlayış genlerin biyolojik fonksiyonların kolaylaştırdı. Burada, biz oncogenic faaliyetlerini incelemek için model calreticulin mutasyonların sitokin bağımlı hematopoetik hücreler için CRISPR/Cas9 metodoloji kullanmaktadır.

CRISPR/Cas9 kullanarak Gene sitokin bağımlı hematopoetik hücreler Mutant Calreticulin Oncogenic etkinliğini araştırmak için düzenleme

Burada, CRISPR/Cas9 sistemini kullanarak , Trypanosoma cruzi 'nin ekstrellüler amastigote içine bir gen nakavt tanıtmak için bir protokol açıklanmaktadır. Büyüme fenotipi ya akenik amastigote kültürün hücre sayımı ya da ana hücre istilasından sonra hücreli formları proliferasyonu ile takip edilebilir.

CRISPR/Cas9 sistemi kullanılarak Trypanosoma cruzi 'Nin Amastigote aşamasına doğrudan bir gene Knockout tanıtımı

CRISPR/Cas9, model olmayan organizmalarda gen fonksiyonunu karakterize etmek için giderek daha fazla kullanılmaktadır. Bu protokol, enjeksiyon karışımlarının hazırlanmasından sivrisinek embriyolarının elde ve enjektesine kadar Culex pipiens'innakavt hatlarının nasıl oluşturulacağını ve enjekte edilen sivrisineklerin ve bunların istenen mutasyonlar için soylarının nasıl arka, çapraz ve taramadan geçeceğini açıklar.

CRISPR/Cas9 Kullanarak Boş Mutasyonlar Oluşturmak için Culex Sivrisineklerinin Embriyolarının Hazırlanması ve EnjekteSi

Bu protokol, CRISPR/Cas9 hedefli mutajenizin kum sineklerindeki adımlarını detaylandırıyor: embriyo toplama, enjeksiyon, böcek yetiştirme ve tanımlamanın yanı sıra ilgi çekici mutasyonların seçimi.

CRISPR/Cas9 Mutagenesis için Kum Sineği (Phlebotomus papatasi) Embriyo Mikroenjeksiyonu

Bu protokolün amacı, C. elegans genomunun monte edilmiş ribonikleoprotein kompleksleri ve tarama için dpy-10 co-CRISPR işaretleyicisi kullanılarak sorunsuz CRISPR/Cas9 düzenlemesini sağlamaktır. Bu protokol, C. elegans'ta eklemeler, silmeler, gen değiştirmeleri ve kodon ikameleri de dahil olmak üzere çeşitli genetik değişiklikler yapmak için kullanılabilir.

CRISPR/Cas9 C. elegans rbm-3.2 Geninin dpy-10 Co-CRISPR Tarama İşaretçisi ve Monte Edilmiş Ribonikleoprotein Kompleksleri kullanılarak düzenlenmesi.

Protokol, φC31 sistemini kullanarak Anopheles sıtma sivrisineklerinin genomunda bölgeye yönelik değişikliklerin nasıl eldeılacağını açıklar. Açıklanan değişiklikler, attP taşıyan yerleştirme hatlarının genomunda transgenik kasetlerin hem entegrasyonunu hem de değişimini içerir.

Sıtma Anopheles Vektörlerinde SiteYe Yönelik φC31 Aracılı Entegrasyon ve Kaset Değişimi

Bu makalede, CRISPR/Cas9 tarafından indüklenen indellerin hızlı tanımlanması ve sivrisinek Aedes aegypti'deki mutant çizgilerinin yüksek çözünürlüklü eriyik analizi kullanılarak seçilmesi için bir protokol ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Sivrisinek Aedes aegypti'de Yüksek Çözünürlüklü Eriyik Analizi Kullanarak CRISPR/Cas9 Mutagenesis'i Takip Eden Indel Tespiti

Bu protokol, zSpRY-ABE8e kullanarak kesin bir zebra balığı hastalığı modeli oluşturmak için PAM sınırlaması olmadan verimli adenin baz düzenlemesinin nasıl gerçekleştirileceğini açıklar.

zSpRY-ABE8e ile İnsan Genetik Hastalığının Zebra Balığı Modellemesi için Verimli PAM-Less Temel Düzenleme

Kimyasal genetik, bir kapı bekçisi kalıntısının, hedef lokusta farklı bir yan zincir içeren bir amino asit ile değiştirilmesini içerir. Burada, cdpk1'in hipomorfik bir alelini içeren mutant bir parazit oluşturduk ve mutant arka planda parazit tarafından benimsenen telafi edici yolları belirledik.

Bitki Benzeri Kinazların Hipomorfik Alelini Barındıran Mutant Bir Sıtma Parazitinde Telafi Edici Yolların Gelişimini Anlamak

Burada, CRISPR-Cas9 teknolojisini kullanarak sivrisinek A. aegypti'de embriyonik mikroenjeksiyon yoluyla genom düzenleme için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.

Sarı Humma Sivrisineği Aedes aegypti'de CRISPR-Cas9 Kullanılarak Genom Düzenleme

Öğrenin, CRISPR/Cas9 ile P. falciparum'da koşullu mutant oluşturma yöntemini. Bu teknik, protein fonksiyonlarını ortaya çıkararak sıtma paraziti biyolojisini anlamaya yardımcı olur.

CRISPR/Cas9 gen düzenleme yapmak koşullu mutantlar, insan sıtma parazit P. falciparum için

Daha fazla video keşfet