AtHIRD11 içsel bozukluğu ve bağlama kapiller Jel Elektroforez ve benzeşme kapiler Elektroforez Metal iyonları doğru Analizi

Bu yöntem, metal demir bağlanmasına bağlı konformasyonel değişiklikler gibi intrinsik bozukluk proteinlerinin tektoniği ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı çok az ekipman gerektirmesi ve sonuçların çok hızlı bir şekilde elde edilebilmesidir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Matthias Stein olacak.

Başlamak için, poliamid dış kaplamalı ve 50 mikronluk bir iç çapa sahip çıplak erimiş bir silika kılcal damarı 33 ve 30 santimetre uzunluklarda kesmek için bir cam plaka üzerinde bir cam kesici kullanın. CGE deneyi için kılcal damarın bir ucundan 24,5 santimetre mesafede ve ACE deneyi için kılcal damarın bir ucundan 21,5 santimetre mesafede bir santimetre genişliğinde bir algılama penceresinin ortasını işaretlemek için bir kalem kullanın. Bir kaynak makinesi kullanarak, poliamid dış kaplamayı her işaretten önce ve sonra 0,5 santimetre yakın.

Benzer şekilde, kılcal damarların her iki ucundaki kaplamanın bir santimetresini çıkarmak için kaynak makinesini kullanın. Ardından, kılcal damarların uçlarını ve algılama pencerelerini temizlemek için etanol ve yumuşak bir doku kullanın. Algılama penceresi çıkışın yanında olacak şekilde CE sistemine bir kılcal damar takın.

Çözeltileri hazırladıktan sonra, metin protokolüne göre, 10 mililitrelik bir şırıngayı doldurmak için 250 mikromolar kalsiyum klorür çözeltisi kullanın. Daha sonra şırıngaya 0,2 mikronluk bir PVDF filtre takın ve atmak için 2 mililitre çözeltiyi filtreden itin. 10 şişeyi izin verilen maksimum hacme kadar doldurmak için şırıngada kalan kalsiyum klorürü kullanın.

Her şişeyi 250 mikromolar kalsiyum klorür çözeltisi giriş şişesi olarak etiketleyin. Daha sonra, kalsiyum klorür çözeltisini kullanarak 10 şişeyi yarıya kadar doldurun. Her birini 250 mikromolar kalsiyum klorür çözeltisi çıkış şişesi olarak işaretleyin.

Daha sonra, diğer metal tuzu içeren çözeltilerle, şişeleri benzer şekilde doldurun. Ek olarak, her bir giriş ve çıkış şişesi çifti için, benzer bir giriş ve çıkış şişesi seti hazırlamak için 30 mikromolar Tris Tamponu kullanın. 60 mikromolar asetanilit EOF işaretleyici ile 10 şişeyi doldurun.

Ardından, bir şişeyi doldurmak için mililitre başına bir miligram numune çözeltisi kullanın. Analizi hazırladıktan sonra, metin protokolüne göre, CGE deneyleri için numune çözeltisini hidrodinamik olarak enjekte ederek ve girişte dört dakika boyunca 0,1 bar uygulayarak ayırma işlemini çalıştırın. Ardından, kılcal damarın her iki ucuna 25 dakika boyunca negatif 16,5 kilovolt ve 2,0 bar basınç uygulayın.

Ligandsız ölçümler için metodu hazırladıktan sonra, önce 0.1 molar EDTA solüsyonu kullanarak kılcal damarı 2.5 bar'da 1 dakika boyunca durulamak için metodu ligandlarla ölçümler için hazırlayın. Ardından kılcal damarı durulamak için deiyonize su kullanın. Daha sonra, 2,5 bar'da 1,5 dakika durulamak için ligand solüsyonu kullanarak kılcal damarı dengeleyin.

Daha sonra, asetanilid çözeltisini 0.05 bar'da 6 saniye boyunca enjekte edin ve giriş ve çıkış şişelerini ligand içeren tampon şişelerine değiştirin. Asetanilid solüsyonunu kılcal damarın ucundan daha fazla içeri itmek için 2,4 saniye boyunca 0,05 bar uygulayın. 6 dakika boyunca 10.0 kilovolt uygulayın ve 200 nanometre dalga boyunda varlık asetanilid tepe noktasını tespit edin.

Kılcal damarı EDTA deiyonize su ve ligand çözeltisi ile duruladıktan sonra, daha önce olduğu gibi, protein örneğini enjekte edin ve giriş ve çıkış şişelerini taze ligand içeren tampon şişelerine değiştirin. Alternatif olarak, ligandlı ve ligandsız ölçüm yapmayı tekrarlayın. Ardından, alkali toprak ligand çözeltilerini kullanarak yöntemi tekrarlayın.

Son olarak, aynı yöntemi gerçekleştirmek için aşağıdaki çözümleri kullanın. Ardından, çeşitli protein metal iyon etkileşimleri için yük boyutu oranlarındaki değişimi hesaplayın. Burada, CGE deneyleri sırasında elde edilen AtHIRD11 numunesi için elektroferogram gösterilmektedir.

Peptit boyutu soldan sağa doğru artar. Dört numaralı tepe en büyük kütleye sahiptir ve bozulmamış proteini gösterir. Daha küçük tepeler, iki ve üç, daha küçük safsızlıkları temsil eder.

Bu şekil, ACE deneyleri sırasında asetanilid için elektroferogramı temsil eder. Asetanilid çözeltisi, safsızlık içermemesi gerektiğinden yalnızca bir yüksek tepe gösterir. Tepe maksimumu için algılama süresi, elektroozmotik akışın göç süresini gösterir ve etkileşimin hesaplanması için kullanılır.

ACE deneyi sırasında AtHIRD11 örneğinin bu elektroferogramı, SDS ve metal iyonlarının yokluğunda gerçekleştirildi. CGE elektroferogramından elde edilen iki safsızlığın yanı sıra, proteinin kendisiyle ilgili en az beş tepe noktası mevcuttur. Tepe altı için çeşitli metal iyonlarının varlığında ölçülen göç süresi kaymalarının grafiksel bir değerlendirmesi burada gösterilmektedir.

RF üzerinden hesaplanan Delta R değeri ile temsil edilir. Her sonuç, protein metal iyon komplekslerinin sorumluluğundaki genel değişimin gösterdiği gibi, değeri ve işareti ile ne kadar güçlü bir kaymanın meydana geldiğini gösterir. Bir kez ustalaştıktan sonra, teknik, düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse, CGE etkileşimi de dahil olmak üzere sekiz saat içinde bir etkileşim ortağı için yapılabilir. Bu prosedürü denerken, bozunma ürünleri zamanla artabileceğinden uzun süreli ölçümler için protein çözeltilerini değiştirmeyi ve daha kesin sonuçlar elde etmek için Tris Tampon çözeltilerini değiştirmeyi unutmamak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, bir kılcal damarın nasıl kesileceğini ve temizleneceğini iyi anlamanın yanı sıra, içsel düzensiz proteinlerin bağlanma davranışını değerlendirmek için bir afinite kılcal elektroforez yöntemi kurmalısınız.