Rejenerasyon Stentor içinde çalışma yöntemleri

Bu protokolün genel amacı, tek hücre düzeyinde rejenerasyonu incelemek için model organizma olarak kullanımları için Stentor'u büyütmektir. Bu yöntem, hücrelerin ayrı parçalardan nasıl yapılar oluşturduğu gibi hücre biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Stentor'un ana avantajları, yenilenebilen tek hücreler olmaları ve ameliyat yapmak için yeterince büyük olmalarıdır.

Genel olarak, bu protokolün zorlu kısmı, insanların hücrelerle bireyler olarak değil, kültürler olarak çalışmaya alışkın olmalarıdır. 5X büyütmede eğik ışık kullanarak stereo mikroskop altında Stentor örneği içeren Petri kabı arayarak başlayın. Stentor hücrelerinin bir alt tabakaya bağlandıklarında trompet benzeri bir şekil sergilediğine dikkat edin.

Bağlı olmasa da, yüzen Stentor hücreleri görünüşte daha az uzar. Bir mililitrelik bir pipet kullanarak, tek tek Stentor hücrelerini, piyasada bulunan en az 100 mikrolitre pastörize kaynak suyu içeren bir cam spot plakanın kuyusuna aktarın. Daha sonra Stentor hücrelerini çıkarmadan kuyudaki suyun yaklaşık% 90'ını çıkarın ve hücreleri yıkamak için kuyuya üç kez 500 mikrolitre taze pastörize kaynak suyu ekleyin.

Hücreleri beslemek için, önce bir Chlamydomonas kültüründen bir mililitrelik bir alikotu oda sıcaklığında üç dakika boyunca 2.095 g'da santrifüjleme için 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Pelet, ikinci bir santrifüjleme için bir mililitre pastörize kaynak suyunda yeniden süspanse edin, ardından 500 mikrolitre pastörize kaynak suyunda yeniden süspansiyon yapın. Klonal bir Stentor kültürüne ihtiyaç duyulursa, kültür başına 500 mikrolitre şartlandırılmış ortamı bir cam spot plakanın ayrı oyuklarına aktarın ve her bir ortam oyuğuna bir Stentor hücresi aktarın.

Her bir Stentor kültürünü her 48 saatte bir hazırlanan Chlamydomonas'tan beş mikrolitre ile besleyin ve kültürleri gölgeli bir alanda tutun. Her beslemeden önce yeni Stentor hücrelerinin sayısını sayın ve verilen Chlamydomonas hacmini buna göre ayarlayın. Her 96 saatte bir, Stentor'u her bir oyuğun menisküsünden ayırmak için kültür ortamını birkaç kez nazikçe pipetleyin ve herhangi bir hücreyi çıkarmadan ortamı kuyucuklardan dikkatlice aspire etmek için bir mililitrelik bir pipet kullanın.

Daha sonra her bir kuyucuğa 500 mikrolitre taze şartlandırılmış ortam ekleyin. En az bir kuyucuktaki hücre sayısı 20'yi aştığında, otoklavlanmış sterilize geniş ağızlı bir cam kavanoza 20 mililitre pastörize kaynak suyu ekleyin ve Stentor hücrelerini gösterildiği gibi her bir kuyucuğun dibinden dikkatlice ayırın. Tüm Stentor hücrelerini bir mililitrelik pipetle toplayın ve hücreleri yavaşça cam kavanoza aktarın.

Stentor yoğunluğunu mililitrede yaklaşık 20 hücrede tutmak için her 48 saatte bir kavanoza taze pastörize kaynak suyu ekleyin ve Stentor hücrelerini 200 ila 1.000 mikrolitre hazırlanmış Chlamydomonas ile besleyin. Kültür hacmi kavanozun kapasitesinin yaklaşık% 90'ına ulaştığında, kavanozun tüm içeriğini iki fincan cam kaba aktarın, yüksek hacimli Stentor kültürlerini 100 mililitre kültür başına iki mililitre hazırlanmış Chlamydomonas ile besleyin ve Stentor yoğunluğunu mililitre başına yaklaşık 20 hücrede tutmak için kültüre her dört ila beş günde bir pastörize kaynak suyu ekleyin. Haftada bir kez, anormal şekilli ve renksiz Stentor hücreleri ile birlikte kirletici mikroorganizmaları uzaklaştırmak için bir mililitrelik bir pipet kullanarak kültürleri rotiferler, mantar ve diğer büyümeler için 5X diseksiyon mikroskobu altında inceleyin.

Cam kap yaklaşık% 90 dolduğunda kültürü bölün, kültüre 25 mililitre pastörize kaynak suyu ekleyin ve Stentor'u gösterildiği gibi camdan ayırmak için 50 mililitrelik bir pipet kullanın. Daha sonra kültürün yaklaşık% 50'sini iki fincan yeni bir cam kaba taşıyın. Hücre parçalanması ile rejenerasyonu indüklemek için, önce kılcal tüplerden birkaç iğne yapmak için bir iğne çektirmesi kullanın.

Ardından, tanımlanmış bir trompet şekline, canlı mavi-yeşil renge sahip ve iki mikrolitrelik bir damlacıkta büyük vakuol içermeyen sağlıklı bir Stentor toplayın. Damlacığı bir slayt üzerine yerleştirin ve iki mikrolitre %4 metil selüloz ile Stentor'un hareketini yavaşlatın. Damlacığı bir diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin ve iğne kırılmasını önlemek için cam iğneyi kesme yüzeyine mümkün olduğunca paralel tutun.

Hücrenin ön ucunu hücrenin arka ucundan ayırmak için büzülmüş Stentor'a iğnenin yan tarafıyla hafifçe bastırın. Her iki parçanın da en az bir makronükleer düğüme sahip olduğunu onaylayın ve parçaları bir cam spot plakanın ayrı kuyucuklarına taşıyın. Membranlar bant ve oral aparat rejenerasyonunu indüklemek için, bir mililitre kültür ortamında 30 ila 60 Stentor hücresini bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve tüpteki tüm hücreleri tek bir 125 mikrolitre hacim çekişinde toplamak için 200 mikrolitrelik bir pipet kullanın.

Hücreleri 500 mikrolitre taze hazırlanmış% 25 sükroz içeren bir tüpe dağıtın ve bir kronometre başlatın. Tüpteki hücreleri rafta bir dakika boyunca döndürdükten sonra, tüm hücreleri 200 mikrolitrelik tek bir çizimde toplayın ve kronometre iki dakikalık sükroz tedavisi gösterene kadar hücreleri pipet ucunda tutun. Ardından, Stentor'u üç fiske sıkma yıkaması için bir mililitre pastörize kaynak suyu içeren bir mikrosantrifüj tüpüne çıkarın.

Rejenerasyonu görüntülemek için, 100 mikrolitre pastörize kaynak suyunu bir cam spot plakanın bir kuyusuna ekleyin ve dört mikrolitre kültür ortamında bir Stentor hücresi toplamak için 20 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanın. Damlacığı 22 x 22 milimetre karelik bir lamel ortasına bırakın ve önceki damlacığın etrafına dört damlacık daha yerleştirin. Lameli ters çevirin ve pastörize kaynak suyu ile yavaşça kuyunun üzerine yerleştirin.

Daha sonra yenilenen hücreleri uygun zaman çözünürlüğü ile bir ışık mikroskobu altında görüntüleyin. Sükroz yıkamasından hemen sonra meydana gelen rejenerasyonun birinci aşaması sırasında, Stentor hücreleri herhangi bir zar bandı olmayan gözyaşı damlaları gibi görünür. Üç ila altı saat sonra, bir membranlar bant belirir.

Bu aşama, ikinci aşama, üç ila dört saat daha sürer. Üçüncü aşama, membranllar bandın arka ucunda bir oral primordium göründüğünde ve her iki yapı da hücrenin ön ucuna doğru hareket etmeye başladığında meydana gelir. Bu aşama bir ila iki saat sürer.

Hem membranlar bant hem de oral aparat hücrenin ön ucuna ulaştığında, rejenerasyon tamamlanır ve hücre karakteristik Stentor trompet benzeri şekli benimsemiş olacaktır. Yığılmış bir kutu grafiğindeki her bir zaman noktasındaki her bir yenilenme aşamasındaki hücrelerin yüzdesini çizin. Hücre kesme ve sükroz muamelesinden sonra rejenerasyon süresinin ölçülmesi, hücre popülasyonunun herhangi bir belirli aşamaya ulaşması için geçen sürede bir saatlik bir yayılmayı ortaya çıkarır ve bu da belirli bir rejenere hücre popülasyonu içindeki rejenerasyon sürecinin zamansal heterojenliğini gösterir.

Bu videoyu izledikten sonra, Stentor'u nasıl kültürleyeceğinizi ve yenilenmelerini nasıl başlatacağınızı ve ölçeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürü denerken sabırlı olmayı unutmamak önemlidir. Stentor'un kültüre bölünmesi üç ila beş gün sürer ve Stentor rejenerasyon aşamalarını tanımlamak pratik gerektirir.

Bu teknik, hücre biyolojisi araştırmacılarının Stentor'daki rejenerasyonu keşfetmelerinin önünü açacak.