Lazer-yakalama mikrodiseksiyon optimizasyonu gelen insan dokusu taze donmuş enterik gangliyon yalıtım için
June 14th, 2018
Bu iletişim kuralı, enterik gangliyon lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) kullanarak sabitlenmemiş, taze rezeke insan bağırsak dokusundan izole yüksek bütünlük RNA örnekleri almak için hedeftir. Bu protokol flaş donmuş örnekleri insan bağırsak dokusu, cryosectioning, ethanolic boyama ve dehidratasyon, LCM, hazırlanıyor içerir ve RNA çıkarma.
Bu yöntem, yetişkin insanların bağırsaklarındaki enterik gangliyonların ekspresyon profili gibi enterik sinir sistemi ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, RNA kalitesini maksimum düzeyde korurken insan enterik gangliyonlarından yüksek RNA verimi elde etmek için kullanılabilmesidir. 20 santimetre uzunluklarda kesilmiş bağırsak dokusu ile başlayın.
İlk olarak, yağ ve bağ dokusunu kesin. Mienterik pleksusta yapısal hasara yol açabilecek serozayı çentiklemekten kaçının. Daha sonra, kesilmiş numunenin tüm uzunluğu boyunca, tercihen mezenterik bağlantı bölgesinde uzunlamasına bir kesi yapın.
Daha sonra, taeniae coli'yi kolondan ayırın ve atın, böylece doku düzleşebilir. Şimdi, bağırsağı, mukoza tarafı aşağı bakacak şekilde, soğutulmuş bir kesme tahtasına serin. Ardından, dokunun tüm uzunluğu boyunca 1,25 santimetre genişliğinde şeritler kesin.
Kesildikleri gibi, her bir parçayı geçici depolama için soğutulmuş doku saklama solüsyonuna aktarın. Ardından, her şeridi iki ila 1,5 santimetre uzunluğunda segmentler halinde kesin. Bir şeridi segmentlere ayırdıktan sonra, segmentleri kurulayın.
Dokunun çok kuru olması önemlidir, bu nedenle donduğunda doku üzerinde buz kristalleri oluşmaz. Şimdi, kurumuş doku parçalarını, mukoza tarafı yukarı bakacak şekilde soğuk, tek kullanımlık plastik bir kalıba yerleştirin. Ardından, sıkışan hava kabarcıklarını gidermek için kavisli forseps kullanarak her parçayı düzleştirin.
Dokular düzleştikçe genişleyecektir. Doku segmentlerini düzleştirdikten sonra, dondurmadan önce kalınlıklarını değerlendirin. Gerekirse, bağırsak numunesi orijinal kalınlığına yaklaşana kadar numunenin kenarlarını içeri doğru itin.
Şimdi, yüklü taban kalıbını kuru buz ve 2-metilbütan bulamacına aktarın. Doku 30 ila 60 saniye içinde tamamen donmalıdır. Ardından, kuru buz üzerinde bekletilmiş soğuk mendiller kullanarak kalıbın altını hemen kurulayın.
Şimdi, örneği kontrol edin. Düz görünmeyen örnekleri not edin. Ardından, kalıbı kullanmadan önce önceden etiketlenmiş ve soğutulmuş alüminyum folyoya sarın.
Ardından, dehidrasyonu en aza indirmek için folyoyu bir plastik örtü tabakası ile örtün. Numuneleri eksi 80 santigrat derecede saklanana kadar buz üzerinde tutun. Gerekli malzemeleri hazırladıktan sonra, üç ila beş milimetrelik bir TFM höyüğünü büyük bir kriyostat numune tutucusuna dökün ve bağırsak numunesini hemen seroza tarafı yukarı bakacak şekilde TFM'ye aktarın.
Oda sıcaklığında birkaç saniye bekledikten sonra, numune tutucuyu kuru buza aktarın ve üzerini toz haline getirilmiş kuru buzla kaplayın. Dilimlemeden önce, TFM'nin myenterik pleksus düzleminin altında olduğundan emin olun. Ardından, numune tutucuyu kriyostat numune kafasına monte edin ve numuneyi kriyostat bıçağı ile hizalayın.
Myenteric pleksus düzlemini kesme bıçağına paralel hale getirin. Şimdi, myenterik pleksusa ulaşana kadar seroza ve uzunlamasına kas boyunca sekiz mikronluk kesitler yapın. Mienterik pleksusu bulmak için bir numune monte edin ve %1 kristal menekşe gibi sulu bir boya ile boyayın.
Devam etmek için, uzunlamasına ve dairesel kas katmanları arasındaki bağlantıyı tanımlayın. Bölümlemenin başlangıcında, seroza bağ dokusunun varlığı ile işaretlenecektir. Seroza boyunca kalan bir miktar mezenterik yağ da mevcut olabilir.
Daha sonra, dış uzunlamasına kas tabakasının tabakası görünür hale gelir Uzunlamasına ve dairesel kas tabakaları arasındaki sınıra ulaşıldığında, enterik ganglionların bir kısmı gözlenecektir. Sonraki birkaç bölümde, myenterik pleksus, tek bir bölümde geniş gangliyon alanlarının bulunmasıyla çok belirgin hale gelecektir. Şimdi, lazer yakalama mikrodiseksiyonu için seri kesitler toplayın.
PEN slaytlarını kriyostatta beş ila 10 saniye soğutun ve bunları bölümleri monte etmek için kullanın. En iyi bölümlerde çok sayıda nöron ve glia olacaktır. Şimdi, metin protokolünde açıklandığı gibi bölümleri boyamaya ve ardından kurutmaya devam edin.
Hazırlık olarak, LCM mikroskop aşamasına bir LCM kapağı kartuşu yerleştirin. Ardından, örnek slaydı sahne alanına yükleyin ve slaydın genel bakış görüntüsünü elde edin. LCM için istenen konumu belirleyin ve slayta bir kapak yükleyin.
Ardından, kızılötesi lazeri hizalayın ve 20 ila 30 mikron çapında bir yakalama noktası için lazerin gücünü ve süresini ayarlayın. Ardından, toplanacak istenen gangliyonları ana hatlarıyla belirtin. Kapaktaki yeşil bir daire olarak görüntülenen toplanabilir alanın sınırları içinde kaldığınızdan emin olun.
Bir UV kesme izi ile özetlenen ganglionların her biri için, IR noktalarını, her 100 ila 500 mikronda en az bir IR noktası olacak şekilde ayarlayın, böylece kapak numuneden kaldırıldığında ganglionların tümünün toplanmasını sağlayın. Ardından, işaretli tüm gangliyonların toplanmasına devam etmek için IR UV Cut düğmesine basın. Koleksiyonlar tamamlandıktan sonra, kapağı yeni bir konuma taşıyın ve toplama işlemini tekrarlayın.
Bu 60 ila 80 dakika boyunca tekrarlanabilir. LCM kapağına yeterli ganglion yüklendiğinde, bir kalite kontrol istasyonuna aktarın. Kapakta kalıntı varsa, RNA kullanımı için hazırlanmış ince uçlu bir boya fırçası kullanarak silin.
Çıkarılması zor kalıntılar için bir pipet ucu kullanın. Ardından, kapağı 230 mikrolitre RNA lizis tamponu ile doldurulmuş 0,5 mililitrelik bir mikrofüj tüpüne sabitleyin. Kapağı ters çevirin, kısaca girdap yapın ve ardından numuneyi oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
Daha sonra, numuneyi 5.000 g veya daha hızlı bir şekilde beş dakika santrifüjleyin ve ardından mikrofüj tüpünü kuru buza aktarın. Numune artık RNA ekstraksiyonu için hazırdır. Örnek başına iki enterik gangliyon kapağı çekerken, RNA-Seq için yeterli olan bir nanogramdan daha fazla RNA elde edildi ve RNA mükemmel kalitedeydi.
Gösterilen örneğin RNA bütünlüğü 8.3'tür. Bütünlük numaraları 7.5 ve 6.9 olan örnekler de toplanmıştır. Toplamda, hazırlanan tüm numunelerin %95'inden fazlası RNA-Seq için yeterince iyi olmuştur.
RNA-Seq veri setlerinin kalitesi, bir biyoinformatik boru hattı kullanılarak değerlendirildi. Uç yanlılığı, örneklerin başarılı bir şekilde sıralandığını ve yalnızca mütevazı bir üç asal uç yanlılığına sahip olduğunu gösterir. Bir gen biyotip grafiği, dizileme sonuçlarının büyük ölçüde tutarlı olduğunu göstermektedir.
Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, RNA-Seq için yeterli kalite ve miktardaki enterik gangliyonlardan RNA'nın biyolojik kopyalarını sekiz ila 12 saat gibi kısa bir sürede toplamak için kullanılabilir. Bu prosedürü denerken, insan bağırsak örneklerinin mümkün olduğunca düz bir şekilde dondurulması önemlidir. Bu, lazer yakalama mikrodiseksiyonu ile hızlı ve kolay bir şekilde işlenen insan enterik gangliyonlarının çok büyük kesitlerini toplayabilmenizi sağlayacaktır.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) kullanılarak taze kesilmiş insan bağırsak dokusundan izole edilen enterik gangliyonlardan yüksek bütünlüklü RNA çıkarma protokolünü ortaya koymaktadır. Yöntem, insan bağırsaklarında enterik sinir sisteminin ifade profillerini araştırmayı amaçlamaktadır ve gastrointestinal sistemdeki sinir fonksiyonları hakkındaki anlayışımızı geliştirmektedir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Moleküler Biyoloji
- Gastroenteroloji
Arka Plan
- Enterik sinir sistemi, gastrointestinal fonksiyonda kritik bir rol oynamaktadır.
- Gen ekspresyon profillerini incelemek için yüksek kaliteli RNA gereklidir.
- Lazer yakalama mikrodiseksiyon, hücresel yapıların kesin izolasyonunu sağlar.
- Bu teknik, sağdurum dokudan detaylı moleküler analizlerin yapılmasını kolaylaştırır.
Çalışmanın Amacı
- İnsan enterik gangliyonlarından yüksek verimde RNA elde etmek.
- Dokunun zarar görmesini en aza indirerek RNA kalitesini korumak.
- İnsan enterik sinir sistemindeki gen ekspresyon profillerini değerlendirmek.
Kullanılan Yöntemler
- İnsan doku örneklerinden enterik gangliyonların lazer yakalama mikrodiseksiyonu (LCM).
- Taze kesilmiş bağırsak dokusu, gangliyonları izole etmek için işlenmiştir.
- Kritik aşamalar kriosekleme, boyama ve dehidrasyonu içermiştir.
- RNA çıkarma, yüksek RNA bütünlüğünü elde etmek için LCM tekniklerini takip etmiştir.
Ana Sonuçlar
- Protokol, sekanslama için 1 nanogramdan fazla yüksek kaliteli RNA vermiştir.
- RNA bütünlük sayıları, RNA-Seq için mükemmel RNA kalitesini göstermiştir.
- Numunelerin %95'ten fazlası sekanslama analizlerine yeterliydi.
Sonuçlar
- Bu çalışma, insan enterik gangliyonlarından RNA izole etmek için etkili bir yöntem göstermiştir.
- Sonuçlar, enterik sinir sisteminin moleküler mekanizmalarına daha derin bir kavrayış sağlamaktadır.
- Bu yöntemin gastrointestinal bozukluklar ve sinir fonksiyonları üzerindeki araştırmalar için önemli etkileri vardır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Laser-capture microdissection (LCM) enables precise isolation of enteric ganglia from human intestinal tissue, providing high-integrity RNA for transcriptomic analysis. This approach supports target validation in gastrointestinal neuroscience by delivering disease-relevant molecular data from primary human tissue. The method reduces biological noise and enhances predictive confidence in early discovery workflows focused on enteric nervous system pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating pure populations of enteric ganglia for RNA-seq analysis.
- Operational Value: Preserves RNA integrity while minimizing contamination from surrounding tissue layers.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking through direct measurement of gene expression in disease-relevant human neural tissue.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, high-quality RNA inputs suitable for reproducible transcriptomic assays.
- Operational Value: Uses PEN-membrane slides and ethanol-compatible dyes to improve capture efficiency and RNA yield.
- Scientific Value: Enables quantitative dependent variable measurements (e.g., RNA integrity number) for assay qualification.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant human tissue data that bridges discovery and preclinical validation.
- Operational Value: Yields sufficient RNA quantity (>1 ng per sample) for downstream sequencing applications.
- Scientific Value: Supports translational biomarker discovery by enabling profiling of enteric nervous system targets in human tissue.
Pipeline & Workflow Integration
The LCM workflow fits within the discovery biology phase, enabling hypothesis testing and pathway clarification prior to lead identification. It generates quantitative molecular readouts that inform go/no-go decisions in target selection. The method produces reusable, standardized tissue preparations that support enterprise-scale screening campaigns.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by isolating pure neuronal populations for molecular profiling.
- Screening: Delivers standardized, high-integrity RNA samples enabling reliable compound effect measurements.
- Analytics: Provides RNA integrity number (RIN) and yield metrics to assess sample quality before sequencing.
- Translational Research: Connects human tissue data to preclinical models through conserved gene expression patterns.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable protocol for isolating neural tissue across multiple tissue blocks and experimental conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in neural target validation.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized tissue preparation, staining, and LCM parameters.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid acquisition of human-validated molecular data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on human enteric nervous system expression profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, cryosectioning, and laser-capture microdissection.
- Dependent on cryostat, LCM system, and RNA-compatible staining reagents (e.g., Cresyl Violet).
- Necessitates standardized protocols for tissue flattening, freezing, and section orientation.
- Must account for tissue variability across donors and intestinal regions when scaling.
- Limited by RNA degradation risks if samples are not processed rapidly or kept sufficiently dry.
