Name: Fare modelleri Glomerular hastalığı böbrek fonksiyonlarının değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Öğrenin, fare modellerinde glomerüler hastalık için fonksiyonel ve yapısal fenotip değerlendirmesi yapmayı. Bu yöntem, böbrek patolojisinin mekanistik analizini ve VEGF rolünün incelenmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser İngiliz kalp Vakfı, Richard Bright VEGF araştırma güven ve MRC tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Humtstrom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+structural+kidney+damage+in+spontaneously+hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Development of structural kidney damage in spontaneously hypertensive rats.</a> Journal of Hypertension. 30 (6), 1087-1091 (2012).</li>
<li>Kitada, M., Ogura, Y., Koya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+of+diabetic+nephropathy%3A+their+utility+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nephrology+and+Renovascular+Disease%22%5BJournal%5D)">Rodent models of diabetic nephropathy: their utility and limitations.</a> International Journal of Nephrology and Renovascular Disease. 14 (9), 279-290 (2016).</li>
<li>Tesch, G. H., Lim, A. K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21147843">Recent insights into diabetic renal injury form the db/db mouse model of type 2 diabetic nephropathy.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (2), F301-F310 (2011).</li>
<li>Fogo, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+FSGS%3A+lessons+for+pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Animal models of FSGS: lessons for pathogenesis and treatment.</a> Seminars in Nephrology. 23 (2), 161-171 (2003).</li>
<li>Stevens, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28574576">VEGF-A165b protects against proteinuria in a mouse model with progressive depletion of all endogenous VEGF-A splice isoforms from the kidney.</a> Journal of Physiology. 595 (19), 6281-6298 (2017).</li>
<li>Cosgrove, D., Kalluri, R., Miner, J. H., Segal, Y., Borza, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+a+mouse+model+to+study+the+molecular+pathobiology+of+Alport+glomerulonephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Kindey+International%22%5BJournal%5D)">Choosing a mouse model to study the molecular pathobiology of Alport glomerulonephritis.</a> Kindey International. 71 (7), 615-618 (2007).</li>
<li>Kujal, P., Vernerova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5%2F6+nephrectomy+as+an+experimental+model+of+chronic+renal+failure+and+adaptation+to+reduced+nephron+number%5BTitle%5D)+AND+%22Ceskoslenska+Fysiologuie%22%5BJournal%5D)">5/6 nephrectomy as an experimental model of chronic renal failure and adaptation to reduced nephron number.</a> Ceskoslenska Fysiologuie. 57 (4), 104-109 (2008).</li>
<li>Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ureteral+obstruction+as+a+model+of+renal+interstitial+fibrosis+and+obstructive+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy.</a> Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).</li>
<li>Oltean, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF165b+overexpression+restores+normal+glomerular+water+permeability+in+VEGF164-overexpressing+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">VEGF165b overexpression restores normal glomerular water permeability in VEGF164-overexpressing adult mice.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (7), F1026-F1036 (2012).</li>
<li>Salmon, A. H., Neal, C. R., Bates, D. O., Harper, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor+increases+the+ultrafiltration+coefficient+in+isolated+intact+Wistar+rat+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor increases the ultrafiltration coefficient in isolated intact Wistar rat glomeruli.</a> Journal of Physiology. 570 (Pt 1), 141-156 (2006).</li>
<li>Zheng, F., Striker, G. E., Esposito, C., Lupia, E., Striker, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+differences+rather+than+hyperglycemia+determine+the+severity+of+glomerulosclerosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Strain differences rather than hyperglycemia determine the severity of glomerulosclerosis in mice.</a> Kidney International. 54 (6), 1999-2007 (1998).</li>
<li>Betz, B., Conway, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+on+the+use+of+animal+models+in+diabetic+nephropathy+research%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Diabetes+Reports%22%5BJournal%5D)">An update on the use of animal models in diabetic nephropathy research.</a> Current Diabetes Reports. 16 (18), (2016).</li>
<li>Savin, V. J., Terreros, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filtration+in+single+isolated+mammalian+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Filtration in single isolated mammalian glomeruli.</a> Kidney International. 20 (2), 188-197 (1981).</li>
<li>Neal, C. R., Crook, H., Bell, E., Harper, S. J., Bates, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+glomeruli+by+electron+microscopy+reveals+a+distinct+restrictive+urinary+subpodocyte+space%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of glomeruli by electron microscopy reveals a distinct restrictive urinary subpodocyte space.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 16 (5), 1223-1235 (2005).</li>
<li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blot%3A+technique%2C+theory%2C+and+trouble+shooting%5BTitle%5D)+AND+%22North+American+Journal+of+Medicine+%26+Science%22%5BJournal%5D)">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> North American Journal of Medicine & Science. 4 (9), 429-434 (2012).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).</li>
<li>Adembri, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sepsis+induces+albuminuria+and+alterations+in+the+glomerular+filtration+barrier%3A+a+morphofunctional+study+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Sepsis induces albuminuria and alterations in the glomerular filtration barrier: a morphofunctional study in the rat.</a> Critical Care. 15 (6), R277(2011).</li>
<li>Ma, S. T., Liu, D. L., Deng, J. J., Niu, R., Liu, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+arctiin+on+glomerular+filtration+barrier+damage+in+STZ-induced+diabetic+nephropathy+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Phytotherapy+Research%22%5BJournal%5D)">Effect of arctiin on glomerular filtration barrier damage in STZ-induced diabetic nephropathy rats.</a> Phytotherapy Research. 27 (10), 1474-1480 (2013).</li>
<li>Oltean, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor-A165b+is+protective+and+restores+endothelial+glycocalyx+in+diabetic+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor-A165b is protective and restores endothelial glycocalyx in diabetic nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 26 (8), 1889-1904 (2015).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocyte-specific+overexpression+of+GLUT1+surprisingly+reduces+mesangial+matric+expansion+in+diabetic+nephropathy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Podocyte-specific overexpression of GLUT1 surprisingly reduces mesangial matric expansion in diabetic nephropathy in mice.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 299 (1), F91-F98 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu iletişim kuralı bir tam böbrek iş-up bu fare modelleri glomerular hastalığı, böbrek ve tek bir fare elde edilecek glomerular fonksiyonu ile ilgili bilgiler çok miktarda etkinleştirme gerçekleştirilmesi gerektiğini açıklar. Her yöntemin kritik adımlarda glomerular işlevi, böbrekler geçirgenliği (uACR ve plazma kreatinin ölçümleri), bir bütün olarak değerlendirilmesi de dahil olmak üzere ayrıntılı işlevsel, yapısal ve mekanik analiz için izin geçirgenliği bireysel glomeruli (glomerular LpA / Vben), yapısal değişiklikler (PAS, Trichrome mavi ve EM) protein yerelleştirme (Eğer) ve glomerular gen ekspresyonu (RT-PCR ve Western blot). Bu yöntemler fare modelleri böbrek hastalığının glomerular işlevinde tam değerlendirilmesi anahtarıdır.
GFB geçirgenliği değerlendirirken konvansiyonel uACR veya 24 h albümin atılımı oranı etkili ölçü17,18kullanmak için birçok çalışma seçtiniz. Bu teknikler olanak GFB geçirgenliği bir bütün olarak değerlendirilmesi, ancak bu bireysel glomerular geçirgenliği değerlendirme ve glomeruli arasında varyasyon için izin vermiyor. Önceki çalışmalarda glomerular LpA ölçümü bulduk / Vi GFB geçirgenliği5,9değişikliklere daha duyarlı bir önlem olarak. Nitekim, bu yazıda gösterdi temsilcisi sonuçlarında 14 hafta VEGF-A KO, VEGF-A KO X Neph-VEGF-165b fareler VEGF-A KO fareler için karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha düşük bir uACR var A indüksiyon sonrası; Ancak, bu sonuç glomerular Lpiçinde A yansıtılmamış / nerede VEGF-A165b önemli ölçüde engel olmayın Vben ölçümleri, GFB geçirgenliği (resim 1 ve Şekil 2)5' te artırır. Bu böbrek geçirgenliği ve bireysel glomeruli geçirgenliği değerlendirmek için birden fazla deneyleri kullanmanın önemini gösterir. Ayrıca, glomerular LpA / Vben oncometric tahlil öneriyor aynı böbrek üzerinden bireysel glomeruli geçirgenliği büyük ölçüde değişebilir, özellikle içinde hastalık modelleri5,10, 19. glomerular LpA ölçme için bir sınırlama / Vben onu yalnızca deneysel son nokta; gerçekleştirilebilir Böylece, normal uACR ölçümleri deneysel son nokta bir göstergesidir için gereklidir.
Fonksiyonel fenotip değerlendirme ek olarak, mevcut yöntemi de yapısal ve ultrastructural fenotip değerlendirilmesi teşvik eder. Bu yapılabilir gibi PAS, trichrome, lekeleri ve gümüş lekeleri; bir seçim kullanma Her glomerular morfoloji farklı yönlerini değerlendirmek için. Kez fare modelleri için geçerli, glomerular hastalığın akut modellerinde olduğunu eğitimli bir böbrek patolog olmadıkça bu lekeler kullanarak büyük yapısal anormallikler tespit etmek zor olabilir. Bu nedenle, EM taşıyan GBM, endotel fenestrae boyutu ve sayısı ve podocyte özellikleri gibi parametreleri nicel ölçüm sağlar GFB ultrastructure değerlendirmek için önerilmektedir. Böyle ölçümleri gerçekleştirmek için minimum eğitim gerektiren ve hücre-türleri/yapıların bir hastalığı modelinde etkilenen belirlemek için Dedektif sağlar. Glomerular hastalığın hafif bir model olmak için VEGF-A KO fare bulundu temsilcisi sonuçlarında gösterilen örnekte, böylece, hiçbir büyük yapısal anormallikler PAS boyama üzerine hazır bulundu. Ancak, podocyte özgü VEGF-A KO GBM, podocytes ve endotel hücreleri değişiklikler glomerular ultra-yapısı5incelerken neden. Ne yazık ki, mevcut yönteminde açıklanan EM böbrek hazırlanması da GFB19geçirgenliği üzerinde önemli etkileri olduğu bilinmektedir endotel glycocalyx tespiti etkinleştirmez. Doğru glycocalyx derinlik ölçmek için böbrek Oltean ve ark19' açıklandığı gibi sıvı-sabit % 2.5 oxazolidin endotel glycocalyx etiketleme için % 1 Alcian mavi ile olmalıdır.
Fonksiyonel ve yapısal fenotip değerlendirildi sonra farklı genler ve yollar ifade/harekete geçirmek şekillerinin sonra glomeruli özel olarak tespit edilebilir. Önceki Ultra yapısal değerlendirme türleri/glomerular yapıları dahil, podocyte veya endotel özel genler/yollar muayene olup olmadığını gösteren hücre ile ilgili biraz bilgi verebilir misiniz. Örneğin, VEGF-A KO fareler temsilcisi sonuçlarından, (şekil 3D) endotel fenestrae numarasını bir azalma gözlenmiştir; Bu nedenle, VEGF-A yolu dahil olmak için bilinen bir endotel işaretleyici glomerular protein ifadesi incelenmiş; VEGFR-2 (Şekil 4B)5. Proteinlerin glomeruli ifadesi ek olarak, onların yerelleştirme da kullanarak görüntülenmeyecektir. Eğer artan GLUT1 ile podocin ortak yerelleştirme Zhang ve ark20tarafından bir çalışmada, podocytes tarafından yapılan GLUT1 podocyte özgü overexpression teyit edildi.
Glomerular işlevini değerlendirmek için literatürde sunulan alternatif yöntemleri ile karşılaştırıldığında fare modelleri glomerular hastalığı böbrek işlevinde değerlendirmek için bu kağıt belirtilen yöntem kullanımı tamamen üzerinden değerlendirilmek üzere glomerular fenotip sağlar. birden çok yönleri. Bu yöntemi kullanarak, araştırmacı böbrek fenotip modeli belirlemek ve mekanizma neden fenotip geliştirir olarak değerlendirmek mümkün. Mekanizması bu hayati bilgileri hastalığının bu modeller potansiyel terapötik caddeleri incelerken gereklidir. Bu yöntem kolayca hastalık fenotipleri ve potansiyel tedavi glomerular işlevi her iki değerlendirme içine gelecek araştırmalar için uygulanabilir.
Sonuç olarak, bir tam böbrek iş-up fare modelleri glomerular hastalığı, böbrek ve tek bir fare elde edilecek glomerular fonksiyonu ile ilgili bilgiler çok miktarda etkinleştirme için bu genel ve uyarlanabilir protokolünü açıklar. Yöntemler glomerular hastalığı tüm fare modelleri uygulanabilir glomerular işlevinin ayrıntılı işlevsel, yapısal ve mekanik analiz için olanak sağlar.

İnsan böbrek hastalığı taklit etmek için fare modelleri kullanımını giderek yaygın hale geliyor. Fare modelleri gibi kendiliğinden hipertansif fareler (SHR)1, streptozotocin (STZ) spontan modelleri içerir-indüklenen diyabetik sıçan ve fareler2ve db/db yazın II diyabetik farelerin3, genetik modeller gibi birincil podocyte özgü fokal segmental glomerular skleroz (FSGS)4, podocyte özgü vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF-A) knock-out (VEGF-A KO) modeli5, modeller ve Alport sendromu6modelleri ve elde 5/6 nefrektomi7 ve tek taraflı üreteral obstrüksiyon (UUO) model8gibi modelleri. Bu modeller glomerular işlevinde farklı yönlerini değerlendirmek için çeşitli teknikler kullanılabilir. Böbrek hastalığı fare modellerinde glomerular işlevi tam olarak değerlendirmek için gerçekleştirilmesi gereken kapsamlı bir iş-up göstermek için bu yöntemi kağıt amacı budur.
Bu yöntemin kullanılması arkasındaki mantığı birden çok yönleri tam olarak değerlendirilecek glomerular fenotip sağlar olduğunu. Bu glomerular geçirgenliği, protein ve su, glomerular yapısal anormallikler ve ifade/yapıştırma mRNA'ların ve proteinler normal glomerular fonksiyonu için temel değişiklikler için değerlendirme içerir. Bu yöntemi kullanarak, araştırmacı böbrek fenotip modeli belirlemek ve mekanizma neden fenotip geliştirir olarak değerlendirmek mümkün. Bu hastalığın bu modeller potansiyel terapötik caddeleri incelerken gerekli olan mekanizma üzerinde hayati bilgi yok.
Literatürde, glomerular hastalığı fenotip idrarda albümin artan bir düzeyde tarafından belirlendiği yerde bir fare modeli ile sunulmak üzere ortak bir durum. Ancak, glomerular işlevi belirlemek için tek bir yöntem her zaman etkili değildir önermek kanıt yoktur; üriner albümin atılımı oranı ya da üriner albümin kreatinin oranı (uACR) ölçme sadece toplam böbrek fonksiyonları üzerine ve bilgiler değil, bireysel glomeruli sağlar. Önceki çalışmalarda geçirgenliği farklı glomeruli aynı böbrek5,9,10değişebilir gösterdi. Buna ek olarak, bireysel glomeruli geçirgenliği değerlendirilmesi glomerular işlevi değerlendirme, daha duyarlı bir yoludur; bireysel glomerular Su geçirgenliği ölçüm tekniği (LpA / Vben) glomerular işlevinde uACR9ölçme daha değişiklikler daha duyarlı olmak göstermiştir. Bu tahlil fare modelleri dirençli proteinüri, bu c57BL/6 arka plan11gibi için bu faydalıdır. Mevcut yöntemi kağıdın hem toplam böbrek geçirgenliği albümin için hem de bireysel glomerular geçirgenliği su inceliyor avantajdır.
Glomerular yapısal anormallikler incelenmesi kez lekeleri gibi periyodik asit Schiff (PAS), trichrome, ve gümüş lekelerin bir pil tarafından değerlendirilir. Bunlar bir skor yöntemi ile böbrek hastalığı düzeyini değerlendirmek eğitimli bir böbrek patolog etkinleştirin. Her ne kadar tüm iyi yöntemleri, glomerular makro yapısındaki değişikliklerden her zaman içinde gözlenir değil akut böbrek yaralanma12modelleri. Bu yöntem yukarıda açıklanan böbrek Histoloji teknikleri yerine getiren ek olarak, glomerular ultra-yapısı da elektron mikroskobu (EM) değerlendirilmek ki öneriyor. Lekeli glomerulus nispeten normal ışık mikroskop altında normal bakabilirsiniz; Ancak, EM, glomerular membran (GBM) genişliğinde küçük değişiklikler ile değerlendirmesi üzerine podocyte ayak işlem efasman, endotel fenestrations ve alt-podocyte alan kapsama analiz. Bu nedenle, glomerular ultra-yapısı ve mikro-yapısı değerlendirildi da glomerular disfonksiyon mekanizmasının belirlemek için hayati önem taşımaktadır.
Glomerular yapısal anormallikler değerlendirme ek olarak, mRNA ve protein ifade ve yapıştırma yanı sıra protein harekete geçirmek (Örneğin, fosforilasyon) değişiklikleri daha da glomerular hastalığı mekanizmaları aydınlatmak için incelenmesi gerekir. Glomerular hastalığı ararken veya örneğin, KO/aşırı-expressing bir gen glomerular hücreleri, örneğin podocyte özgü VEGF-A KO fare5' i gibi özellikle de bu protein ve mRNA değişiklikleri yalnızca içinde incelenir önemlidir glomerular hücreler ve değil bütün böbrek. Bu iletişim kuralı glomeruli fare böbrek korteks izole edilmiştir ve sonra protein/RNA izole bir yöntem açıklanır. Bu hastalık modeli glomeruli içinde protein/mRNA bozukluk belirli analiz sağlar.
Bu iletişim kuralı bir tam böbrek iş-up bu fare modelleri glomerular hastalığı, böbrek ve tek bir fare elde edilecek glomerular fonksiyonu ile ilgili bilgiler çok miktarda etkinleştirme gerçekleştirilmesi gerektiğini açıklar. Yöntemler glomerular hastalığı tüm fare modelleri uygulanabilir glomerular işlevinin ayrıntılı işlevsel, yapısal ve mekanik analiz için olanak sağlar.

<table><tbody><tr><td>Metabolik Kafesler</td><td>Harvard Aparatı</td><td>52-6731</td><td></td></tr><tr><td>Tris tamponlu salin (10x)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T5912-1L</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümini</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>Fare Albümini ELISA Kantitasyon Seti</td><td>Bethyl Laboratuvarları</td><td>E90-134</td><td></td></tr><tr><td>TMB ELISA Yüzey çözeltisi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>Sülfürik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>SPECTRstar nano</td><td>BMG Labtech</td><td>SPECTRstar nano veya eşdeğeri</td><td></td></tr><tr><td>RNAlater stabilizasyon çözeltisi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>%4-15 prekast protein jeli</td><td>BIORAD</td><td>4568084</td><td></td></tr><tr><td>4x Laaemmli Numune tamponu</td><td>BIORAD</td><td>161-0747</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot hücresi</td><td>BIORAD</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris çalışan tampon</td><td>BIORAD</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Parlak Mavi Boya</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>Kreatinin Arkadaşı</td><td>Exocell</td><td>1012 Şerit Plaka</td><td></td></tr><tr><td>Gluteraldehit Çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Kakodilat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0250</td><td></td></tr><tr><td>10x Fosfat Tamponlu Tuzlu</td><td>Su ThermoFisher Scientific</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Asetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Fosfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Bikarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum Sülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum Klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>D (+) Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Kan Alma tüpleri</td><td>BD</td><td>367835</td><td></td></tr><tr><td>23-25G İğne</td><td>BD</td><td>PMC0735</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Cam Flakon</td><td>Thomas Scientific</td><td>0914X10</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 10 ml Polipropilen Tüpler</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10110101</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml Tüpler</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10681894</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Doku Kalıpları</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22-363-553</td><td></td></tr><tr><td>Fare Cerrahi Disection Kiti</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13-005-204</td><td></td></tr><tr><td>Optimal Kesme Ortamı</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>%4 Paraformaldehit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>Cam Kılcal Borular</td><td>Harvard Aparatı</td><td>EC1 64-0770</td><td></td></tr><tr><td>Bristol Üniversitesi'nde İnşa Edilen</td><td>Glomerüler Geçirgenlik Teçhizatı</td> - ticari olarak mevcut değil <td>LpA teçhizatının alıntılanması: Salmon et al. 2006; J. Physiol</td><td></td></tr><tr><td>Paslanmaz Çelik Elekler</td><td>Cole-Parmer</td><td>WZ-59984</td><td></td></tr><tr><td>Periyodik Asit-Schiff (PAS) Boyama Sistemi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>395B-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksilen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3136</td><td></td></tr><tr><td>Ksilen</td><td>MerckMillipore</td><td>108298</td><td></td></tr><tr><td>Çoklu Hazırlık Slaytları</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0425-72EA</td><td></td></tr><tr><td>Montaj Ortamı</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8030</td><td></td></tr><tr><td>Osmiyum tetroksit çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>Aradite Reçine</td><td>Agar Scientific</td><td>CY212</td><td></td></tr><tr><td>Uranil Asetat</td><td>Agar Bilimsel</td><td>AGR1260A</td><td></td></tr><tr><td>Kurşun Sitrat</td><td>Agar Bilimsel</td><td>AGR1210</td><td></td></tr><tr><td>Kriyostat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>örneğin 957000H</td><td></td></tr><tr><td>Hidrofobik Kalem</td><td>Abcam</td><td>ab2601</td><td></td></tr><tr><td>Nefrin (1243-1256) Antikor</td><td>Acris</td><td>BP5030</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Podocin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0372-200UL</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor İkincil Antikor</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A32732</td><td></td></tr><tr><td>DAPI Vector</td><td>Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>NP40 Hücre Lizis Tamponu</td> ile Vectashield Montaj Ortamı <td>ThermoFisher Scientific</td><td>FNN0021</td><td></td></tr><tr><td>Halt Proteaz ve Fosfataz İnhibitörü Kokteyli</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78437X4</td><td></td></tr><tr><td>10x Transfer Tamponu</td><td>BIORAD</td><td>1610734</td><td></td></tr><tr><td>PVDF Membran</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC2002</td><td></td></tr><tr><td>HRP-Konjuge İkincil Antikorlar</td><td>Abcam</td><td>ab6721</td><td></td></tr><tr><td>Western Blotting Fisher için ECF Substratı</td><td></td><td>10713387</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV Ters Transkriptaz</td><td>New England Biolabs</td><td>M053S</td><td></td></tr><tr><td>Oligo dT</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18418012</td><td></td></tr><tr><td>Rastgele Primerler</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>48190011</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18427088</td><td></td></tr><tr><td>Ribonükleaz İnhibitörü</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>DEPC Su</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9915G</td><td></td></tr><tr><td>Floresan Işık Miskroskobu</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J Analiz Yazılımı</td><td>Image J</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR Thermocycler</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM Mikroskobu</td><td>Britannica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fare modelleri glomerular hastalığı böbrek fonksiyonlarının değerlendirilmesi

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

İnsan böbrek hastalığı taklit etmek için fare modelleri kullanımını giderek yaygın hale geliyor. Bizim araştırma diyabetik nefropati ve podocyte özgü VEGF-bir knock-out fareler glomerular işlev değerlendirmesi üzerine odaklanmıştır; Bu nedenle, bu protokol tam böbrek iş-up bizim laboratuarımızda glomerular hastalığı, böbrek ve tek bir fare elde edilecek glomerular fonksiyonu ile ilgili bilgiler çok miktarda etkinleştirme bu fare modelleri değerlendirmek için kullanılan açıklar. Glomerular işlevini değerlendirmek için literatürde sunulan alternatif yöntemleri ile karşılaştırıldığında glomerular fenotip birden çok yönleri tam olarak değerlendirilmek üzere bu makalede açıklanan yöntemi kullanımını etkinleştirir. Bu yöntemi kullanarak, araştırmacı böbrek fenotip modeli belirlemek ve mekanizma neden fenotip geliştirir olarak değerlendirin. Mekanizması bu hayati bilgileri hastalığının bu modeller potansiyel terapötik caddeleri incelerken gereklidir. Glomerular filtrasyon bariyer ölçüm üriner albümin kreatinin oranı ve bireysel glomerular Su geçirgenliği hem yapısal ve ultra yapısal muayene ile ayrıntılı işlevsel değerlendirme yöntemleri izin Periyodik asit Schiff leke ve elektron mikroskobu kullanarak. Ayrıca, genlerin dysregulated mRNA ve protein düzeyinde analizini glomerular işlevinin mekanik çözümleme sağlar. Bu iletişim kuralı glomerular hastalığı tüm fare modelleri için uygulanan yöntemler genel ancak uyarlanabilir özetliyor.

İdrar toplanan metabolik mağaraları vahşi türü (WT), indüklenebilir podocyte özgü VEGF-A knock (VEGF-A KO) dışarı ve VEGF-A KO X Neph-VEGF165b fareler tarafından kullanarak (insan VEGF-A165b izoformu içinde podocytes içinde aşırı hızlı VEGF-A KO fareler bir Kurucu şekilde). Ölçümü üriner albümin kreatinin oranı 0, 4, 10 ve 14 hafta sonra doksisiklin indüksiyon VEGF-A KO VEGF-A KO fareler ilerici albuminuria 10 WT littermate kontrollere göre hafta tarafından geliştirilmiştir. Mutlak değerler Şekil 2Ave temel bir Şekil 2Bher fare değerleri normalleştirilmiş görülebilir. Ancak, albuminuria içinde VEGF-A X Neph-VEGF-A165b fareler (resim 2), gözlenen değil o VEGF-A165gösteren b albuminuria5modelde koruyucudur.
Glomerular LpAVben bireysel glomeruli WT, VEGF-A KO ve VEGF-A X Neph-VEGF-A165b böbrekler elenmiş olarak ölçüldü. Ne zaman perifused % 8 BSA ile 3A rakamgösterilir nasıl bir glomerulus yakalanıyor ve büzülme örneği görülmektedir. Bu büzülme sonra glomerular LpA belirlemek için kullanılan / Vben her glomerulus (Şekil 3B) için. VEGF-A KO fareler vardı bir önemli ölçüde artış glomerular LpA / Vben 14 haftalık WT kontrol glomeruli için karşılaştırıldığında VEGF-KO indüksiyon post. Daha düşük olmasına rağmen farelerde VEGF-A X Neph-VEGF-A165b, artan glomerular LpA / Vben değil VEGF-A165b 14 hafta5aşırı ifade tarafından engel.
PAS böbrek korteks bölümlerini 14 hafta sonra VEGF-A KO indüksiyon boyama glomerular yapısal anormallikler farelerde VEGF-A KO veya VEGF-A X Neph-VEGF-A165b (Şekil 4A) olmadığını göstermiştir. Ancak, analiz üzerinden EM glomerular ultra yapısının VEGF-A KO fareler bir artan GBM genişliği geliştirilen, endotel fenestrae sayısı azalmıştır, SPS kapsama azalmıştır ve ortalama podocyte yarık genişliği arttı (Şekil 4 c-4F ). Ortalama podocyte ayak genişliği ve yırtmaçlı değişmemiştir (Şekil 3B ve 3 G) sayısı işlem. VEGF-A165b VEGF-A KO farelerde aşırı ifade değişiklikleri için GBM engelledi ve genişliği (Şekil 4 c ve 4F) kesti. Ancak, VEGF-A165b değişmiş fenestrae numarası ve SPS kapsama (Şekil 4 d ve 4E)5üzerinde bir etkisi vardı.
RT-PCR süzülen glomeruli çıkarılan RNA üzerinde gerçekleştirilen insan VEGF-A165b mRNA sadece VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b fareler (5A rakam) mevcut saptandı. Protein süzülen glomeruli ve Western blot yoluyla protein düzeyleri değerlendirmek ayıklanan VEGFR-2 glomerular protein ifadesi VEGF-A KO fareler, azaltılan hangi VEGF-A165b ( aşırı ifade tarafından engellendi bulundu Şekil 5B ve 5 C)5.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig1.jpg"> Şekil 1. Grafiksel kurulum glomerular geçirgenliği (LpA) teçhizat. (A) glomerulus yakaladı (B) üzerinde emme kullanarak bir tutucu içinde micropipette, hangi istikrar için bir takma üzerine sabitlenmiş. (C) dikdörtgen microslide. (D) 4 X amacı, bir video kamera ile mikroskop. (E) % 1 BSA çözüm 37 ° C'ye ısıttı. (F) % 8 BSA çözüm 37 ° C'ye ısıttı. (G) uzaktan dokunun taşıyan iki perifusate içeren satırların, hızlı perifusate Satım izin veren. (H) rotanın glomerulus Hidromasajlı Küvet microslide doğru perifusate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig2.jpg"> Şekil 2. Üriner albümin kreatinin oranı. (A) 0, 4, 10 ve 14 hafta sonra VEGF-A KO indüksiyon WT, VEGF-A KO ve VEGF-A X Neph-VEGF-A165b farelerde uACR değerlerinde. (B) her bireysel fare temel değerine (hafta 0) aynı uACR değerleri normalleştirilmiş. UACR anlamlı bir artış VEGF-A KO fareler hafta 10 ve 14 WT littermate kontrollere, VEGF-A X Neph-VEGF-A165b farelerde engelledi göre (* p &lt; 0,05; İki yönlü ANOVA, düzeltme çiftleri arasında karşılaştırma için; n = 4-12 fareler her zaman noktası; hata çubukları: standart hata ortalamaya [SEM]). Bu rakam Stevens ve ark5değiştirildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig3.jpg"> Şekil 3. Glomerular Su geçirgenliği ölçümü. (A) glomerulus emme; üzerinden micropipette üzerinde yakaladı perifusate % 1 BSA (AI) % 8 BSA (bütün) açık olduğundan ve glomerular büzülme görülmektedir. (B) önce ve % 8 BSA geçiş sonrası alınan ölçümlere glomerular LpA belirlemek için kullanılır / Vben. (C) VEGF-A KO fareler geliştirmek bir artan glomerular LpA / Vben 14 haftalık indüksiyon WT kontrollere göre VEGF-A KO post. Bu önemli ölçüde VEGF-A X Neph-VEGF-A165b farelerde engellendi değil (* p &lt; 0,05; Tek yönlü ANOVA, çiftleri arasında karşılaştırma için Bonferroni düzeltmesi; n = 4-9 fareler, 15-30 glomeruli; hata çubukları: SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig4.jpg"> Şekil 4. Glomerular yapısal analizi. (A) PAS böbrek korteks boyama WT, VEGF-A KO ve VEGF-A X Neph-VEGF-A165b fareler (AI - III)--dan glomeruli içinde yapısal anormallikler değil göstermek. EM VEGF-A KO glomeruli (AIV - VI) Ultra yapısal anormallikler ortaya koydu. (B) gruplar arasında ortalama FPW değişmedi. (C) GBM VEGF-A KO glomeruli, VEGF-A165b. fenestrae sayısı VEGF-A165b. (E) SPS kapsama tarafından değişmeden kaldı VEGF-A KO glomeruli içinde azalmıştır (D) tarafından engelleyen arttı yapıldı Ayrıca VEGF-A165b. yarık genişliği ortalama VEGF-A KO glomeruli artış oldu (F) tarafından değişmeden kaldı, VEGF-A KO glomeruli içinde azalmıştır değişmeden hangi VEGF-A165b (G) yarık numarası tarafından engellendi üç gruplar arasında (* p &lt; 0,05; Tek yönlü ANOVA, çiftleri arasında karşılaştırma için Bonferroni düzeltmesi; n = 3 fareler, 9 glomeruli; hata çubukları: SEM). Bu rakam Stevens ve ark5değiştirildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig5.jpg"> Şekil 5. mRNA ve protein ifade işaretleri. (A) RT-PCR gösterdi insan VEGF-A165b mRNA ifade yalnızca belirgin VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b fareler üzerinden süzülen glomeruli. (B) Western blot VEGFR-2 proteini ifade VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b glomeruli engelleyen aşağı VEGF-A KO glomeruli içinde düzenlenir olduğunu belirtti (* p &lt; 0,05; Tek yönlü ANOVA, çiftleri arasında karşılaştırma için Bonferroni düzeltmesi; n = 3 - 6 fareler; hata çubukları: SEM). Bu rakam Stevens ve ark5değiştirildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Bu iletişim kuralı bir tam böbrek iş-up glomerular hastalığı fare modellerinde yürütülmesi gereken açıklar. Yöntemler glomerular hastalığı tüm fare modelleri uygulanabilir glomerular işlevinin ayrıntılı işlevsel, yapısal ve mekanik analiz için olanak sağlar.

Fare modelleri Glomerular hastalığı böbrek fonksiyonlarının değerlendirilmesi

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

Bu yöntem, glomerülün fonksiyonel ve yapısal fenotipi ile ilgili glomerüler hastalık alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir ve böbrek patolojisinin mekanik analizine olanak tanır. Bu tekniğin temel avantajı, glomerüler hastalığın tüm derecelendirilmiş modellerine uyarlanabilir olmasıdır. İdrar albümin kreatinin oranının değerlendirilmesi için, altı ila sekiz haftalık bir erkek fareyi sessiz bir odada su ve zenginleştirme diyet yiyecekleri içeren metabolik bir fare kafesine yerleştirin.Altı saat sonra, fareyi normal yuvalarına geri koyun ve her kafesten en az 50 mikrolitre temel idrar örneği toplayın ve idrar toplama işlemini haftada bir ila ayda bir kez tekrarlayın. Deneysel bitiş noktasında, her hayvanın karnından böbrekleri toplayın ve organları buz gibi soğuk PBS'de yıkayın. Kortikal glomerülleri incelemek için, böbrek korteksinin bir kutbunu çıkarın ve bir milimetre küp parçaya bölün.Derin jukstamedüller glomerülleri incelemek için, medullanın küçük bir bölümünü çıkarın ve bir milimetre küp küp doğrayın. Daha sonra, dokunun her bir bölümünden alınan parçaları, beş mililitre% 2.5 glutaraldehit çözeltisi içeren ayrı elektron mikroskobu şişelerine yerleştirin ve örnekleri dört santigrat derecede saklayın. Kortikal ve juxtamedüller glomerüllerin histolojisi için, böbreğin üst üçte birini 24 saat boyunca dört santigrat derecede beş mililitre% 4 paraformaldehit içinde çıkarın ve sabitleyin.Daha sonra, sabit dokuyu parafine gömmeden önce 24 saat boyunca beş mililitre% 70 etanole aktarın. Kortikal ve medüller glomerüllerin immünofloro kimyasal analizi için, böbreğin üçte birini bir doku kalıbına yerleştirin ve dokuyu optimum kesme sıcaklığı bileşiğine batırın. Ardından, bileşik donana kadar kalıbı kuru buz üzerine yerleştirin ve numuneleri bölümlere ayrılana kadar 80 santigrat derecede saklayın.Protein analizi için, üç ila iki milimetre küp böbrek korteksi parçalarını 0,5 mililitrelik plastik tüplere yerleştirin ve numuneleri 80 santigrat derecede saklamak için sıvı nitrojen içinde dondurun. RNA analizi için uzun süreli doku depolaması için, az önce gösterildiği gibi üç ila iki kübik milimetre böbrek parçasının dondurulmasından sonra, 80 derece Santigrat depolama için beş hacim RNaz stabilizasyon çözeltisi ekleyin. Glomerül izolasyonu için, kalan böbrek dokusunu dilimleyin ve doku parçalarını, hemen eleme için% 1 sığır serum albümini veya BSA ile desteklenmiş beş mililitre memeli ringer çözeltisine yerleştirin.Glomerülleri izole etmek için, artan mikron gözenek boyutlarına sahip elekleri bir cam kabın üzerine istifleyin ve böbrek dilimlerini üstteki 425 mikron gözenek büyüklüğündeki eleğin üzerine yerleştirin. Daha sonra, böbrek dokusunu ilk elekten geçirmek için bir şırınga pistonu ve %1 BSA ile desteklenmiş taze buz gibi memeli halkaları çözeltisi kullanın. Böbrek parçaları itilirken, üst eleği çıkarın ve böbrek parçalarını sırayla her bir elekten geçirmeye devam edin.Sadece 100 ve 70 mikronluk elekler kaldığında, son iki elek tarafından tutulan glomerüler hasadı, buz üzerinde% 1 BSA ile desteklenmiş 10 mililitre taze memeli ringer çözeltisi ile 50 mililitrelik konik tüpe aktarın. Glomerül süspansiyonunun üç mililitresini iki adet 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpü arasına bölün ve glomerülleri santrifüjleme ile peletleyin. Süpernatanı çıkardıktan sonra, daha sonra protein ve RNA ekstraksiyonu için glomerülleri 80 santigrat derece depolama için sıvı nitrojen içinde dondurun.Ardından, kalan glomerül solüsyonunu, bir ışık mikroskobu aşamasında bir glomerüler su geçirgenlik teçhizatına enjeksiyon için 37 santigrat derecelik bir su banyosuna yerleştirin. Sağlam, bireysel bir glomerulusun yakalanması üzerine, bir Bowman kapsülünü ve boru şeklindeki parçaları mikropipet ile serbest bırakın, kayda başlayın ve glomerulusu% 1 BSA ile desteklenmiş taze zil çözeltisi ile perfüze edin. 30 saniye sonra, perfüzyonu konsantre %8 BSA zil çözeltisine geçirin.10 saniyelik perfüzyondan sonra, perfüzatı tekrar %1 BSA zil çözeltisine getirin ve kaydı durdurun. Glomerüler hücrelerin ve artık matrisin ayrıntılı görselleştirilmesi için, sabit, parafine gömülü böbrek korteks örneklerini bir saat boyunca 37 santigrat derecede kurutun, ardından ardışık ksilen ve azalan etanol daldırmaları ile deparafinizasyon yapın. Numuneleri damıtılmış suda beş dakika yeniden sulandırın ve slaytları bir duman kabininde periyodik asit çözeltisi içinde inkübe edin.Beş dakika sonra, slaytları 100 mililitre damıtılmış suda beş dakikalık üç yıkama ile durulayın, ardından Schiff reaktifinde 15 dakikalık bir inkübasyon yapın. İnkübasyonun sonunda, slaytları akan musluk suyunda beş dakika yıkayın ve akan musluk suyunda 15 dakika daha iyice durulamadan önce üç saniye hematoksilen ile lekeleyin. Ardından, slaytları artan etanol daldırmaları ve iki ardışık üç dakikalık ksilen daldırmaları ile kurutun.Havayla kurutulduktan sonra, slaytlar, glomerüler yapılarının 400x büyütmede bir ışık mikroskobu üzerinde değerlendirilmesi için ksilen bazlı montaj ortamı ile monte edilebilir. Vasküler endotelyal büyüme faktörü veya VEGF-A, nakavt fareler, vahşi tip altlık eşi kontrollerine kıyasla 10 hafta boyunca ilerleyici albüminüri geliştirirken, VEGF165b'yi aşırı eksprese eden nakavt hayvanları bu durumdan korunur. VEGF-A nakavt fareleri, VEGF-A165b'nin aşırı ekspresyonu ile kısmen kurtarılan, vahşi tip kontrollere kıyasla önemli ölçüde artmış glomerüler su geçirgenliğine sahiptir.VEGF-A nakavt farelerde böbrek korteks bölümlerinin periyodik asit Schiff boyaması, ışık mikroskobu analizi ile herhangi bir glomerüler yapısal anormallik ortaya çıkarmaz. Bununla birlikte, elektron mikroskobu analizi üzerine, nakavt fareler, artmış bir glomerüler bazal membran genişliği, azalmış bir endotelyal fenestra sayısı, azalmış bir subpodosit boşluğu kapsamı ve artmış bir ortalama podosit yarık genişliği gösterirken, ortalama yarık sayısı değişmeden kalmıştır. VEGF-A nakavt hayvanlarda VEGF165b aşırı ekspresyonu, glomerüler bazal membran ve yarık genişliğindeki değişiklikleri kurtarır.Bununla birlikte, VEGF165b aşırı ekspresyonu, değiştirilmiş fenestra sayılarını veya subpodosit alanı kapsamını etkilemez. Elenmiş glomerüllerden ekstrakte edilen RNA, VEGF165b'nin aşırı eksprese eden nakavt farelerinde insan VEGF165b mRNA ekspresyonunu doğrular, VEGF-A nakavt farelerinde azalmış VEGFR2 ekspresyonu ile ilişkilidir ve hayvanlarda vuruntuda VEGF165b aşırı ekspresyonu ile kurtarılır. Bu videoyu izledikten sonra, hem albümin hem de suya karşı glomerüler geçirgenliğin bir değerlendirmesi de dahil olmak üzere, bir murin glomerüler hastalık modelinin değerlendirilmesi için tam bir böbrek çalışmasının nasıl tamamlanacağını iyi anlamalısınız.

assessment-of-kidney-function-in-mouse-models-of-glomerular-disease

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Glomerüler filtrasyon hızı (GFR) ölçümü böbrek fonksiyonunun değerlendirilmesi için altın standarttır. Burada iki aşamalı bir üstel bozulma modeli ile plazma ve GFR hesaplanmasında tek bolus enjeksiyon, floresein izotiyosiyanat belirlenmesi (FITC)-inulin kullanarak bilinçli farelerde GFR belirlenmesinde sağlayan yüksek verimli yöntem açıklanmaktadır.

Bilinçli Farelerde Glomerüler Filtrasyon Hızı Ölçümü için bir Yüksek verimli Yöntemi

Biz fareler tabi olan orta ve ağır iskemi-reperfüzyon bağlı böbrek hasarı modelleri tanımlamak tek taraflı renal pedikül sırasıyla, eş zamanlı veya gecikmeli taraf nefrektomi takip sıkma. Bu modeller sürekli böbrek fonksiyon bozukluğu ve post-yaralanma fibrozis yol, ancak yaralanma şiddeti ve yaşam fare arka plan, yaş ve cerrahi ekipman bağlıdır.

Farelerde Akut Böbrek Hasarı ve Post Yaralanma Fibrozis iskemi-reperfüzyon Model

Burada açıklanan renal iskemi reperfüzyon yaralanmasının fare modeli, akut böbrek hasarı ile sonuçlanan iskemiyi indüklemek için kontrol dokusu ve sol renal pedikülün klemplenmesini sağlayan bir sağ nefrektomiden oluşur. Bu model, tüm adımların tek bir kesi ile gerçekleştirildiği bir orta hat laparotomi yaklaşımı kullanır.

Renal İskemi Reperfüzyon Hasarı: Yaralanma Fare Modeli ve Rejenerasyon

Burada, reddetme immünolojisini incelemek için bir protokol sunuyoruz. Sunulan cerrahi model, kısa bir ameliyat süresi ve özlü bir teknik rapor etti. Donör-alıcı suş kombinasyonuna bağlı olarak, nakledilen böbrek, interstisyel fibroz ve tübüler atrofi ile tanımlanan akut hücresel rejeksiyon veya kronik allogreft hasarı geliştirebilir.

Fare Böbrek Transplantasyonu: Allogreft Reddi Modelleri

Glomerüler filtrasyon hızının (GFR) belirlenmesi, genel böbrek fonksiyonunu değerlendirmek için altın standarttır. Bununla birlikte, bu parametreyi ölçmek için geleneksel prosedürler zahmetlidir ve büyük bir zaman yatırımı gerektirir. Burada, GFR'yi transkutanöz olarak belirlemek için daha hızlı ve minimal invaziv bir yöntem tanımlanmıştır.

Bilinçli Kemirgenler Böbrek Fonksiyon Transkutanöz Değerlendirmesi

Burada tarif biz bilinçli, glomerular filtrasyon debisi (GFR) ölçmek için bir protokol bir transdermal GFR monitör kullanarak fareler serbestçe hareket.

Farelerde Glomerular filtrasyon transdermal ölçümü

Bu makalede, fare böbreği izole kapsüllü glomeruli glomeruli glomerual hücre outgrowths kültürve analiz için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem parietal epitel hücre çoğalması ve göç ile ilgili yolları incelemek için kullanılabilir.

Parietal Epitel Hücre Aktivasyonunda Yer Alan Yolları Analiz Etmek Için Ex Vivo Analizi olarak Glomerüler Büyüme

Burada, uzun süreli üreter tıkanıklığının glomerüler dinamikler ve fonksiyon üzerindeki etkilerini ölçmek için Münih Wistar Fromter sıçanlarında yüzey glomerüllü 2-foton mikroskobu kullanan bir protokol sunuyoruz.

Kronik Tek Taraflı Üreter Tıkanıklığının Glomerüler Prosesler Üzerindeki Etkilerini Ölçmek için 2-Foton Mikroskobu Kullanılması

Bu protokol, murin ortak iliak arteriyovenöz fistül oluşumunun cerrahi adımlarını detaylandırır. Bu modeli hemodiyaliz erişimi ile ilişkili ekstremite patofizyolojisini incelemek için geliştirdik.

Hemodiyaliz Erişimi ile İlişkili El Disfonksiyonunun Bir Murine Modeli

Bu çalışma, CUBIC temizlenmiş fare böbreklerinden glomerülleri etiketlemek ve analiz etmek için kullanımı kolay, eksiksiz ve basit bir dizi yöntem sunmaktadır. Glomerulus sayısı ve hacmi gibi veriler, floresein izotiyosiyanat (FITC)-Dekstran, ışık tabakası floresan mikroskobu (LSFM) veya yaygın konfokal mikroskopi ve Imaris gibi yazılımlar kullanılarak kolay ve güvenilir bir şekilde elde edilebilir.

Fare Glomerüllerini Etiketlemek ve Analiz Etmek için Etkili ve Hızlı Bir Yöntem

Bu makale, örnek toplamadan bir gün önce yapılan kontralateral nefrektomi ile tek taraflı böbrek IRI kullanan iskemik CKD modelini sunmaktadır; bu protokol, serum tabanlı fonksiyonel değerlendirme, yüksek sağkalma ve tekrarlanabilir KBD patolojisini 28 ve 42 gün içinde mümkün kılarak mekanik ve girişimsel çalışmalar için çok yönlü bir platform sağlar.

Böbrek Iskemisi/Reperfüzyon Yaralanması Nedeniyle Akut Böbrek Hastalığına Geçişin Fare Modeli

Öğrenin, fare modellerinde glomerüler hastalık için fonksiyonel ve yapısal fenotip değerlendirmesi yapmayı. Bu yöntem, böbrek patolojisinin mekanistik analizini ve VEGF rolünün incelenmesini sağlar.

Fare modelleri Glomerular hastalığı böbrek fonksiyonlarının değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet