Fare modelleri Glomerular hastalığı böbrek fonksiyonlarının değerlendirilmesi

Bu yöntem, glomerülün fonksiyonel ve yapısal fenotipi ile ilgili glomerüler hastalık alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir ve böbrek patolojisinin mekanik analizine olanak tanır. Bu tekniğin temel avantajı, glomerüler hastalığın tüm derecelendirilmiş modellerine uyarlanabilir olmasıdır. İdrar albümin kreatinin oranının değerlendirilmesi için, altı ila sekiz haftalık bir erkek fareyi sessiz bir odada su ve zenginleştirme diyet yiyecekleri içeren metabolik bir fare kafesine yerleştirin.

Altı saat sonra, fareyi normal yuvalarına geri koyun ve her kafesten en az 50 mikrolitre temel idrar örneği toplayın ve idrar toplama işlemini haftada bir ila ayda bir kez tekrarlayın. Deneysel bitiş noktasında, her hayvanın karnından böbrekleri toplayın ve organları buz gibi soğuk PBS'de yıkayın. Kortikal glomerülleri incelemek için, böbrek korteksinin bir kutbunu çıkarın ve bir milimetre küp parçaya bölün

Derin jukstamedüller glomerülleri incelemek için, medullanın küçük bir bölümünü çıkarın ve bir milimetre küp küp doğrayın. Daha sonra, dokunun her bir bölümünden alınan parçaları, beş mililitre% 2.5 glutaraldehit çözeltisi içeren ayrı elektron mikroskobu şişelerine yerleştirin ve örnekleri dört santigrat derecede saklayın. Kortikal ve juxtamedüller glomerüllerin histolojisi için, böbreğin üst üçte birini 24 saat boyunca dört santigrat derecede beş mililitre% 4 paraformaldehit içinde çıkarın ve sabitleyin.

Daha sonra, sabit dokuyu parafine gömmeden önce 24 saat boyunca beş mililitre% 70 etanole aktarın. Kortikal ve medüller glomerüllerin immünofloro kimyasal analizi için, böbreğin üçte birini bir doku kalıbına yerleştirin ve dokuyu optimum kesme sıcaklığı bileşiğine batırın. Ardından, bileşik donana kadar kalıbı kuru buz üzerine yerleştirin ve numuneleri bölümlere ayrılana kadar 80 santigrat derecede saklayın.

Protein analizi için, üç ila iki milimetre küp böbrek korteksi parçalarını 0,5 mililitrelik plastik tüplere yerleştirin ve numuneleri 80 santigrat derecede saklamak için sıvı nitrojen içinde dondurun. RNA analizi için uzun süreli doku depolaması için, az önce gösterildiği gibi üç ila iki kübik milimetre böbrek parçasının dondurulmasından sonra, 80 derece Santigrat depolama için beş hacim RNaz stabilizasyon çözeltisi ekleyin. Glomerül izolasyonu için, kalan böbrek dokusunu dilimleyin ve doku parçalarını, hemen eleme için% 1 sığır serum albümini veya BSA ile desteklenmiş beş mililitre memeli ringer çözeltisine yerleştirin.

Glomerülleri izole etmek için, artan mikron gözenek boyutlarına sahip elekleri bir cam kabın üzerine istifleyin ve böbrek dilimlerini üstteki 425 mikron gözenek büyüklüğündeki eleğin üzerine yerleştirin. Daha sonra, böbrek dokusunu ilk elekten geçirmek için bir şırınga pistonu ve %1 BSA ile desteklenmiş taze buz gibi memeli halkaları çözeltisi kullanın. Böbrek parçaları itilirken, üst eleği çıkarın ve böbrek parçalarını sırayla her bir elekten geçirmeye devam edin.

Sadece 100 ve 70 mikronluk elekler kaldığında, son iki elek tarafından tutulan glomerüler hasadı, buz üzerinde% 1 BSA ile desteklenmiş 10 mililitre taze memeli ringer çözeltisi ile 50 mililitrelik konik tüpe aktarın. Glomerül süspansiyonunun üç mililitresini iki adet 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpü arasına bölün ve glomerülleri santrifüjleme ile peletleyin. Süpernatanı çıkardıktan sonra, daha sonra protein ve RNA ekstraksiyonu için glomerülleri 80 santigrat derece depolama için sıvı nitrojen içinde dondurun.

Ardından, kalan glomerül solüsyonunu, bir ışık mikroskobu aşamasında bir glomerüler su geçirgenlik teçhizatına enjeksiyon için 37 santigrat derecelik bir su banyosuna yerleştirin. Sağlam, bireysel bir glomerulusun yakalanması üzerine, bir Bowman kapsülünü ve boru şeklindeki parçaları mikropipet ile serbest bırakın, kayda başlayın ve glomerulusu% 1 BSA ile desteklenmiş taze zil çözeltisi ile perfüze edin. 30 saniye sonra, perfüzyonu konsantre %8 BSA zil çözeltisine geçirin.

10 saniyelik perfüzyondan sonra, perfüzatı tekrar %1 BSA zil çözeltisine getirin ve kaydı durdurun. Glomerüler hücrelerin ve artık matrisin ayrıntılı görselleştirilmesi için, sabit, parafine gömülü böbrek korteks örneklerini bir saat boyunca 37 santigrat derecede kurutun, ardından ardışık ksilen ve azalan etanol daldırmaları ile deparafinizasyon yapın. Numuneleri damıtılmış suda beş dakika yeniden sulandırın ve slaytları bir duman kabininde periyodik asit çözeltisi içinde inkübe edin.

Beş dakika sonra, slaytları 100 mililitre damıtılmış suda beş dakikalık üç yıkama ile durulayın, ardından Schiff reaktifinde 15 dakikalık bir inkübasyon yapın. İnkübasyonun sonunda, slaytları akan musluk suyunda beş dakika yıkayın ve akan musluk suyunda 15 dakika daha iyice durulamadan önce üç saniye hematoksilen ile lekeleyin. Ardından, slaytları artan etanol daldırmaları ve iki ardışık üç dakikalık ksilen daldırmaları ile kurutun.

Havayla kurutulduktan sonra, slaytlar, glomerüler yapılarının 400x büyütmede bir ışık mikroskobu üzerinde değerlendirilmesi için ksilen bazlı montaj ortamı ile monte edilebilir. Vasküler endotelyal büyüme faktörü veya VEGF-A, nakavt fareler, vahşi tip altlık eşi kontrollerine kıyasla 10 hafta boyunca ilerleyici albüminüri geliştirirken, VEGF165b'yi aşırı eksprese eden nakavt hayvanları bu durumdan korunur. VEGF-A nakavt fareleri, VEGF-A165b'nin aşırı ekspresyonu ile kısmen kurtarılan, vahşi tip kontrollere kıyasla önemli ölçüde artmış glomerüler su geçirgenliğine sahiptir.

VEGF-A nakavt farelerde böbrek korteks bölümlerinin periyodik asit Schiff boyaması, ışık mikroskobu analizi ile herhangi bir glomerüler yapısal anormallik ortaya çıkarmaz. Bununla birlikte, elektron mikroskobu analizi üzerine, nakavt fareler, artmış bir glomerüler bazal membran genişliği, azalmış bir endotelyal fenestra sayısı, azalmış bir subpodosit boşluğu kapsamı ve artmış bir ortalama podosit yarık genişliği gösterirken, ortalama yarık sayısı değişmeden kalmıştır. VEGF-A nakavt hayvanlarda VEGF165b aşırı ekspresyonu, glomerüler bazal membran ve yarık genişliğindeki değişiklikleri kurtarır.

Bununla birlikte, VEGF165b aşırı ekspresyonu, değiştirilmiş fenestra sayılarını veya subpodosit alanı kapsamını etkilemez. Elenmiş glomerüllerden ekstrakte edilen RNA, VEGF165b'nin aşırı eksprese eden nakavt farelerinde insan VEGF165b mRNA ekspresyonunu doğrular, VEGF-A nakavt farelerinde azalmış VEGFR2 ekspresyonu ile ilişkilidir ve hayvanlarda vuruntuda VEGF165b aşırı ekspresyonu ile kurtarılır. Bu videoyu izledikten sonra, hem albümin hem de suya karşı glomerüler geçirgenliğin bir değerlendirmesi de dahil olmak üzere, bir murin glomerüler hastalık modelinin değerlendirilmesi için tam bir böbrek çalışmasının nasıl tamamlanacağını iyi anlamalısınız.