Vibrio cholerae kolonizasyon ve ishal yetişkin zebra balığı modelindeki miktarının

Bu yöntem, vibrio cholerae'nin Sessiz Sahil'de nasıl kolonize olduğu ve bir niş oluşturmak için bağırsak mikrobiyotası ile nasıl rekabet ettiği gibi vibrio cholerae alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, balıkların doğal bir vibrio cholerae konakçısı olmasıdır, bu nedenle tüm vibrio cholerae yaşam döngüsünü inceleyebiliriz. Prosedürü gösterenler, laboratuvarımdan bir doktora sonrası araştırmacı olan Dhrubajyoti Nag ve laboratuvarımdan bir doktora öğrencisi olan Paul Breen olacak.

V.cholerae kültürlerini hazırladıktan sonra, zebra balığını daldırarak aşılayın. İlk olarak, dört veya beş zebra balığını 200 mililitre steril enfeksiyon suyu içeren 400 mililitrelik bir behere yerleştirin. Daha sonra istenen enfeksiyon konsantrasyonu için bir mililitre V.cholerae kültürü ekleyin.

Ardından, kabı delikli bir kapakla örtün. Tüm beherleri hazırladıktan sonra, 28 santigrat dereceye ayarlanmış bir cam ön inkübatöre aktarın Geçici bir maruz kalma için, yaklaşık altı saat sonra, balıkları toplamak için beher suyunu bir balık ağından boşaltın. Enfekte olmuş su, bakterileri öldürmek için çamaşır suyuna atılmalıdır.

Daha sonra balığı beş dakika boyunca 200 mililitre steril enfeksiyon suyuna koyun. Beş dakika sonra, bu suyu bir balık ağından geçirin ve suyu çamaşır suyuna atın. Şimdi, balıklar 200 mililitre steril enfeksiyon suyu ile yeni ve temiz bir behere girebilir.

Deney istenen son noktaya ulaştığında, teşhis amacıyla enfeksiyon suyundan 15 mililitrelik bir numune alın. Daha sonra balıkları toplayın ve enfekte olmuş suyu uygun şekilde atın. Ventral tarafı yukarı doğru yönlendirin ve vücudu alt çeneden bir pim ve anüsün hemen arkasında başka bir pim ile sabitleyin.

Her iki pimi de gövdeden uzağa doğru eğin. Daha sonra, balığın ventral yüzeyini% 70 etanol ile silin. Ardından, %70 etanol ve alev kullanarak bir neşter ve Vannas makasını sterilize edin.

Şimdi, neşteri kullanarak, göbekte pullara nüfuz eden, ancak yalnızca cilt kadar derin kesen küçük, uzunlamasına bir kesi yapın. Daha sonra, makasla, kesiği vücudun uzunluğu boyunca dikkatlice uzatın ve cilt seviyesinden daha derin kesmeyin. Anüsü kesmekten kaçının.

Ardından açıklığı genişletmek için kafaya doğru iki yanal kesim yapın. Ardından, yanal kesilerin her iki yanındaki cildi, pimleri vücuttan uzağa doğru açılandırarak diseksiyon yüzeyine sabitleyin. Bağırsak sistemi artık çok ince, soluk bir tüp olarak görünür olmalıdır.

Şimdi, oldukça kırılgan olabilen tüm bağırsak yolunu dikkatlice çıkarmak için iki çift alevle sterilize edilmiş forseps kullanın. Dokuyu cam boncuklar ve bir mililitre soğuk tampon içeren bir hominizasyon tüpüne aktarın. Daha sonra, dokuları metin protokolünde tarif edildiği gibi homojenize edin ve bağırsak kolonizasyon seviyelerini ölçün

Daha sonra, bağırsak homojenatının ve tamponunun seri seyreltmelerini yapın. Her balık için, bir mililitre hacimlerde beş veya altı on kat seyreltme hazırlayın. Karıştırmak için tüpleri vorteksleyin.

Daha sonra, streptomisin ve X-gal içeren LB agar plakaları üzerine her seyreltmeden 100 ila 200 mikrolitre plaka koyun. Plakaları 30 santigrat derecede 16 ila 18 saat inkübe edin. Gece boyunca inkübasyondan sonra, plakalardaki V.cholerae kolonilerini sayın.

Bu bakteriler tipik olarak X-gal ile LB ortamında soluk mavi koloniler üretir. Birkaç koloni morfolojisi gözlenirse, her farklı morfolojiden birkaç koloniyi farklı bir TCBS plakasına yamalayın. TCBS'de V.cholerae, opak merkezleri ve yarı saydam çevreleri olan büyük, hafif düzleştirilmiş sarı koloniler üretir.

Balık ishalindeki müsin seviyelerini belirlemek için, 96 oyuklu bir plaka üzerinde bir test yapın. Üç nüsha halinde, bir boşluk da dahil olmak üzere her test koşulu için kuyucuklara 100 mikrolitre enfeksiyon suyu yükleyin. Daha sonra, her bir test kuyucuğuna 50 mikrolitre taze,% 0.1 periyodik asit çözeltisi karıştırın.

Karıştırmak için pipetleme kullanın. Daha sonra, plakayı plastiğe sıkıca sarın ve plakayı 37 santigrat derecede bir ila bir buçuk saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, plakayı oda sıcaklığına soğutun.

Her kuyucuğa 100 mikrolitre Fuchsin çözeltisi ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Şimdi, plakayı yeniden sarın ve oda sıcaklığında bir külbütöre koyun. Yaklaşık 20 dakika içinde, bir plaka okuyucu kullanarak plakayı 560 nanometrede okuyun.

Çözeltideki müsinin neden olduğu reaksiyonu ölçmek için. Balık ishalindeki protein seviyelerini ölçmek için Bradford testini kullanın. BSA standartlarından birinin 66 mikrolitresini veya 66 mikrolitre enfeksiyon suyunu tek kullanımlık bir küvette 1.000 mikrolitre Bradford tahlil reaktifi ile karıştırın.

Şimdi, numuneleri oda sıcaklığında iki dakika inkübe edin. Ve sonra bir spektrofotometrede 660 nanometredeki absorbansı okuyun. İshal miktarı için basit bir ölçüm, 600 nanometrede ölçülen sudaki bulanıklıktır.

Suyu iyice karıştırın, tek kullanımlık bir küvete bir mililitre ekleyin ve bir ölçüm yapın. Temel, boş bir ölçüm için temiz bir enfeksiyon suyu kullanın. Atılan V.cholerae bakterileri de ölçülebilir.

Bu, aşılandıktan sonra temiz suya taşınan balıklarla yapılabilir. Daha önce tarif edildiği gibi bir aliquat tank suyunun seri seyreltmelerini yapın. Daha sonra seyreltmeleri seçici ortam üzerine yerleştirin ve plakaları 24 saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin.

Daha sonra, kolonileri daha önce açıklandığı gibi sayın ve ardından CFU'yu belirleyin. 200 mililitre suya yerleştirilen zebra balığı grupları, beş milyon CFU pandemik kolera ile aşılandı. Bakteri istilasına uğramış suda altı saat kaldıktan sonra, balıklar 18 saat boyunca temiz suya geçer.

Hava bağırsakları daha sonra toplandı. Her balık tahmini 100.000 ila 1.000.000 V.cholerae hücresi barındırıyordu. Enfeksiyon suyu diğer tahliller için kullanıldı.

Enfeksiyöz dozlar daha yüksek olduğunda müsin seviyeleri daha yüksekti. Balıklar V.cholerae ile enfekte olduğunda suyun OD600'ü önemli ölçüde daha yüksekti. Son olarak, enfekte balık suyundaki toplam protein seviyesi, enfekte olmamış balığın suyunda gözlenenin neredeyse iki katıydı.

Bu videoyu izledikten sonra, yetişkin zebra balıklarını vibrio cholerae ile nasıl enfekte edeceğinizi ve enfeksiyonun neden olduğu ishali nasıl ölçeceğinizi iyi anlamalısınız. Bu prosedürü takiben, daha önce enfekte olmuş balıklar tarafından saf balıkların enfeksiyonunu değerlendirmek için bulaşma tahlilleri gibi başka yöntemler de gerçekleştirilebilir.