Name: Fare kalp çalışma için ışık sayfalık floresans mikroskobu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Öğrenin fare kalp görüntüleme için çift taraflı aydınlatmalı ışık sayfalık floresans mikroskobu kullanımını. Optik temizleme ile hızlı görüntüleme ve gen tedavisi sonrası yapısal değişiklikleri gözlemleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Thao Nguyen ve Atsushi Nakano UCLA'dan fareler örnek görüntü sağlamak için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışmada hibe NIH HL118650 (için Tzung K. Hsiai), HL083015 (için Tzung K. Hsiai), HD069305 (için N. C. Chi ve Tzung K. Hsiai.), HL111437 (için Tzung K. Hsiai ve N. C. Chi), HL129727 (için Tzung K. Hsiai) ve University of Texas sistemi yıldız (Juhyun için finansman tarafından desteklenen Lee).

Hayvanlar kullanımını içeren tüm yordamları Kaliforniya Üniversitesi, Los Angeles, California kurumsal inceleme komiteleri (IACUC) tarafından onaylanmış olması.
1. görüntüleme sistem kurulumu
Not: Resim 1 ve Şekil 2bakın.
<ol><li>Sürekli dalga (CW) lazer 3 dalga boyu ile almak: 405 nm, 473 nm ve 532 nm. Place 2 (M1 ve M2) 150 mm ayrı yansıtır ve onları ayna uçaklarını kirişe 45 ° ile hizalayın. Not: Uzak çift taraflı aydınlatma kurulum lazer yönlendirmek için bu adım gerçekleştirilir. Elde edilen ışın ilk ışın olarak aynı yönde olacaktır.</li>
	<li>Bir 25-mm çap iris diyafram/iğne deliği (PH), 50-mm çapı nötr yoğunluk filtresi (NDF) ışını 0 - bir optik yoğunluk aralığı ile geçmek 4.0, bir ışın genişletici (BE), bir (S) 30 mm yarık uzunluğuna sahip ~ 0 - 6 mm ve bir ayna (M3) , tüm diğer her 150 mm konumlandırılmış. Ayna, ayna uçak ile 45 ° kirişe yerleştirin.</li>
	<li>M3 150 mm'den yerleştirilen bir 50: 50 ışın ayırıcı ışını geçmek. Bir ayna (M6) ışın bölücü 150 mm'den yerleştirin ve böylece onun ayna uçak 45 ° ileriye doğru yönde yayılan kirişe hizalayın. Yansıyan ışın çift aydınlatma ışık sayfanın bir tarafına oluşturmak için kullanın.</li>
	<li>Bir ayna (M4) ışın bölücü 150 mm'den yerleştirin ve böylece onun ayna uçak 45 ° ışın splitter üzerinden 90 ° açıyla yayılan kirişe hizalayın. İkinci bir ayna (M5) 150 mm M4 dan yerleştirin ve böylece onun ayna uçak M6 yansıyan ışın için 45 ° hizalayın. M5 yayılan ışını çift aydınlatma ışık sayfası ikinci tarafını oluşturmak için kullanın.</li>
	<li>Çift taraflı aydınlatma sistemi simetrik bir biçimde ayarlayın (bkz. Şekil 1). Bir silindirik lens (CL1) yer [çapı (d) =; 1 odak uzaklığı (f) = 50 mm] M5 M6 çift aydınlatma tertibat diğer tarafında üzerinden yayılan ışını doğrultusunda 150 mm bir tarafı ve başka bir aynı silindirik lens (CL2) üzerinde yayılan ışını doğrultusunda 150 mm s. 2 (M7 ve M8) her silindirik mercekler doğrultusunda 90 ° ışın yansıtmak için 50 mm mesafelerde yer aynalar.</li>
	<li>Bir çift lens dan akromatik bir kütleye oluştururlar. İlk lens, L1 yerleştirin (d =; 1 f = 100 mm), 100 mm M7 ve ikinci lens, L2 (d =; 1 f = 60 mm), 160 mm L1 üzerinden. Bu çift-aydınlatma aynı lensler (L3, L4) ile diğer tarafında M8 aynı mesafede yerleştirilmiş yineleyin.</li>
	<li>Yer, M9 ve M10, 60 mm lens L2 ve L4, sırasıyla ve ışın doğrultusunda yansıtır. Aydınlatma amaçları, OL1 ve OL2 yer (d = 2; f = 150 mm), 150 mm M9 ve M10 ve ışın ile uyumlu. Hedefleri yayılan ışını örnekleri görüntüleme için ışık sayfası oluşturur.</li>
	<li>3-b Yazıcı örnek sahibi Akrilonitril bütadien stiren (ABS) yazdırmak için kullanın. Kapak cam parçası katıştırma [kırılma indisi (RI) 1.4745 =] odası aydınlatma ışık kırılma indisi eşleşmeyebilir en aza indirmek için dikey her tarafında. Odası objektif lensler yayılan kirişler arasında eşit olarak yerleştirin.</li>
	<li>1 X büyütme objektif ve bilimsel tamamlayıcı metal oksit yarı iletken (sCMOS) kamera aydınlatma için dikey stereo mikroskopla uçak (bkz. Şekil 2) yükleyin.</li>
</ol>2. görüntüleme sistemi kalibrasyon
<ol><li>0,53 mikron çapında olan flüoresan polistren boncuk almak.</li>
	<li>Floresan boncuk örnek bir kırılma indisi eşleşen çözüm (jant) boncuk çözümde sulandrarak 1:150, 000 için % 1 düşük-melt işaret özel ile hazır olun. Borosilikat cam boru bir parça ile bir iç çapı 12 mm ve 18 mm bir dış çapı 30 mm uzunluğa kes. Not: Borosilikat cam boru kırılma indisi (1.47) eşleştirmek için kullanılır.</li>
	<li>% 1'özel ile seyreltilmiş boncuk örnek mix ve boncuk/özel çözüm borosilikat boru içine pipette. Oda sıcaklığında (23 ° C) kuvvetlendirmek özel izin.</li>
	<li>ABS odası (Kimden adım 1,7) % 99.5 gliserol çözüm ile doldurun. Boncuk oda içinde içeren borosilikat cam boru yerleştirin. ABS odası çift aydınlatma sistem tarafından oluşturulan Gauss ışını ortasına öyle görüntüleme sistemi yerleştirin.</li>
	<li>Bir 3-b motorlu translasyonel sahne hareket ve ABS odası içinde örnek yönünü denetlemek için borosilikat cam tüp takın (bkz. ek Şekil 1).</li>
	<li>Görüntüleri en 30 kare / saniye (fps) saniyede sCMOS kamera kullanarak elde. Motor kontrolörü kullanarak, örnek 1 mm yanal yönde hareket ve görüntüleri, sCMOS kamera kullanarak her 1 mm artışı. Tüm örnek yansıma kadar devam edin.</li>
	<li>Alınan görüntüleri Görselleştirme yazılımları kullanarak yığını ( Tablo malzemelerigörmek). Bu boncuk görüntüleri kullanarak sistem noktaya yayılmış fonksiyonu (PSF) ölçmek. Bu PSF görüntü'sonraki adımlarında işleme sırasında deconvolution için kullanın.</li>
</ol>3. numune hazırlama
<ol><li>Kalpleri bir vahşi türü P1 fare ve bir çift Heterozigoz sarcolipin-Cre knockin fare ile Rosa26-YFP gen teşrih (SlnCre / +; R26YFP muhabir / +), P7. Not: Fentobarbital ve Robbins ve ark. tarafından açıklanan tekniği kullanarak ötenazi gerçekleştirildi 10. Ulusal Kalp, akciğer ve kan Enstitüsü (NHLBI)10,11tarafından açıklanan tekniği göre diseksiyon gerçekleştirildi.</li>
	<li>Kevin Sung vd tarafından açıklandığı gibi fare kalpleri temizleyerek bir kimyasal gerçekleştirmek 12. Not: kullanılan kimyasalların toksik olan aşağıdaki adımları bir duman mahallede gerçekleştirilmesi gerekiyor.<ol>
<li>1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) 3 x kalpleri durulama x 10 dk için. Sonra durulama, kalpleri %4 paraformaldehyde çözeltilerine yerleştirin ve bu örnekler 4 ° C'de gecede kuluçkaya.</li>
		<li>Örnekleri % 0,5 w/v 2, 2'-Azobis dihydrochloride içeren bir % 4 akrilamid çözümde yerleştirin. Gecede 4 ° C'de kuluçkaya örnekleri sağlar. Gecede kuluçka sonra örnekleri kaldırmak ve onları için 2-3 h 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>PBS örnekleriyle durulayın ve sonra %1.25 w/v Borik asit ve % 8 w/v Sodyum Lauryl sülfat çözeltilerine koyun. Onlar berraklaşana kadar 37 ° C'de örnekleri kuluçkaya. Bu örnek kalınlığına bağlı olarak birkaç saat sürebilir. Takas sonra örnekleri kaldırmak ve 1 gün için 1 x fosfat tamponlu tuz koyun.</li>
		<li>Çözüm Nonyonik yoğunluk gradient orta 40 g ile eşleşen bir kırılma indisi hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek) 0,02 M fosfat tampon (PB), % 0,1 ve 0,01 ara-%20 sodyum azid 30 ml. Sodyum hidroksit ile 7,5 pH çözüm getirmek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Temizlenen örnek jantlar 1.46-1,48 ve % 1'özel bir kırılma indisini ile yerleştirin. Örnek borosilikat cam boru içine yerleştirin ve oda sıcaklığında (23 ° C) kuvvetlendirmek özel izin.</li>
	<li>Bir 3-b motorlu translasyonel sahne hareketini denetlemek için borosilikat cam tüp takmak ve 3-b içinde örnek yönünü baskılı ABS odası ( Tamamlayıcı Şekil 1bakınız).</li>
</ol>4. yetişkin kalp görüntüleme
<ol><li>Bir özel kardiyak troponin T organizatörü (cTnT) ve yeşil flüoresan protein (GFP) içeren 8,7 1012 virüs türü adeno ilişkili virüs vektör 9 (AAV9) x 100-μL hacmindeki 2 aylık vahşi türü (C57BL/6) fare kuyruğu damar içine enjekte. Not: AAV9 Yuan vd tarafından açıklanan tekniği göre geliştirilmiştir 13. bu AAV9-cTnT-ROMK-GFP üreten böbrek dış medüller Potasyum kanal (ROMK) bağlamak GFP neden olur (bkz. Tablo malzeme).</li>
	<li>7.5 ay-in yaş NHLBI11tarafından açıklanan tekniği göre yetişkin fare kalpleri parçalara. Adımları 3.1-3.3 kullanarak örnekleri hazırlayın.</li>
	<li>Motor kontrolörü motor aktüatör bağlayın. Aktüatör hareketini denetlemek için borosilikat cam tüp takmak ve 3-b içinde örnek yönünü ABS odası yazdırılır.</li>
	<li>Çift aydınlatma sistem tarafından oluşturulan Gauss ışını ortasına öyle örnek konumlandırın. SCMOS kamera 100 fps hızında çalıştırarak görüntüleri elde etmek.</li>
	<li>Motor kontrolörü kullanarak, örnek 1 mm eksenel yönde hareket ve sCMOS fotoğraf makinesi ile imge vasıl her 1 mm artışı elde. Tüm örnek yansıma kadar devam edin. Not: Sistem özel geliştirilen alet-kontrol yazılımı tarafından kontrol edilir.</li>
	<li>Alınan görüntüleri Görselleştirme yazılımları kullanarak yığını ( Tablo malzemelerigörmek). Bu görüntü yığınları ve görselleştirme yazılım14kullanarak 3 boyutlu görüntüleri geliştirin. PSF adım 2.6 ile elde edilen görüntü yığını deconvolve. Kalp kıvrımlarına gözlemlemek ve görüntüleri bu gri tonlama yoğunluk dayalı sahte renk eklemek için piksel eşik yoğunluk değeri ayarlayın.</li>
</ol>

<ol><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4537058/">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Dimensional+light-sheet+microscopy+to+elucidate+shear+stress+modulation+of+cardiac+trabeculation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).</li>
<li>Bakkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+to+study+cardiac+development+and+human+cardiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease.</a> Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).</li>
<li>High, F. A., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifaceted+role+of+Notch+in+cardiac+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease.</a> Nature Reviews Genetics. 9 (1), 49-61 (2008).</li>
<li>Sachinidis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+specific+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+fluorescence+imaging+to+localize+cardiac+lineage+and+protein+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution.</a> Scientific Reports. 7, 42209(2017).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li>
<li>Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+excision+of+murine+aorta%3B+a+versatile+technique+in+the+study+of+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and excision of murine aorta; a versatile technique in the study of cardiovascular disease.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52172(2014).</li>
<li>National Heart, L., Blood Institute, <a target="_blank" href="http://community.parentprojectmd.org/profiles/blogs/standard-operating-procedures-for-duchenne-animal-models">Standard Operating Procedures (SOP's) for Duchenne Animal Models</a>. , (2015).</li>
<li>Sung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+three-dimensional+tissue+clearing+and+incorporation+of+colorimetric+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Simplified three-dimensional tissue clearing and incorporation of colorimetric phenotyping.</a> Scientific Reports. 6, 30736(2016).</li>
<li>Yuan, Z., Qiao, C., Hu, P., Li, J., Xiao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+adeno-associated+virus+vector+producer+cell+line+method+for+scalable+vector+production+of+different+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">A versatile adeno-associated virus vector producer cell line method for scalable vector production of different serotypes.</a> Human Gene Therapy. 22 (5), 613-624 (2011).</li>
<li>FEI, <a target="_blank" href="https://www.fei.com/software/amira-user-guide/">Amira User's Guide</a>. , Konrad-Zuse-Zentrum fur Informationstechnik. Berlin. 59-138 (2017).</li>
<li>Gao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+imaging+of+3D+dynamics+in+thickly+fluorescent+specimens+beyond+the+diffraction+limit%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Noninvasive imaging of 3D dynamics in thickly fluorescent specimens beyond the diffraction limit.</a> Cell. 151 (6), 1370-1385 (2012).</li>
<li>Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+and+fast+live+imaging+with+two-photon+scanned+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy.</a> Nature Methods. 8 (9), 757-760 (2011).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+light-sheet+imaging+with+virtual+reality+to+recapitulate+developmental+cardiac+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics.</a> JCI Insight. 2 (22), (2017).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

LSFM sistemi ve burada açıklanan tekniği kullanır onun gelişim Doğum sonrası ve yetişkin aşamasında görüntü fare kalp için bir optik temizlenmesi ile kombine bir çift taraflı aydınlatma ışını. Foton saçılma ve emilimi ile daha büyük ve kalın doku örnekleri1,3geleneksel tek aydınlatma ışını muzdarip. Çift taraflı kirişler örnek böylece şeritleme ve tek taraflı bir aydınlatma tarafından üretilen görüntüler sık görülen diğer yapıları etkisini en aza indirmek, daha d...

Işık sayfalık floresans mikroskobu ilk 1903 yılında geliştirilen bir teknik olduğunu ve bugün bir yöntem olarak gen ekspresyonu çalışma ve doku örnekleri1,2,33-b veya 4-D modelleri üretmek için kullanılır. Böylece sadece o uçağı dedektörü tarafından yakalanır örneği tek bir uçağı aydınlatmak için ışık ince bir levha bu görüntüleme yöntemini kullanır. Örnek sonra eksenel yönde her yakalamak için hareket edebilir, her seferinde bir bölümü katman ve 3B modele alınan görüntüleri4sonrası işlendikten sonra render. Ancak, emme ve fotonlar saçılma nedeniyle, LSFM ya da birkaç mikron kalınlığında veya optik şeffaf1örnekleri sınırlı olmuştur.
LSFM sınırlamaları optik şeffaf, zebra balığı gibi dokulara sahip organizmaların kapsamlı çalışmalar yol açmıştır. İnsanlar ve zebra balığı5,6arasında korunmuş gen olduğundan kalp geliştirme ve farklılaşma ilgili çalışmalar kez zebra balığı üzerinde yapılmaktadır. Bu çalışmalar kalp araştırma kardiyomiyopatiler6,7' ye ile ilgili gelişmeler yol açmıştır, ancak, bu hala memeliler gibi üst düzey organizmalar üzerinde benzer araştırma yapmak gerek vardır.
Memeli kalp doku kalınlığı ve opaklık doku, kırmızı kan hücreleri ve tek taraflı aydınlatma geleneksel LSFM yöntemleri1 altında örnek nedeniyle oluşur şeritleme hemoglobin nedeniyle emme nedeniyle bir meydan okuma sunuyor , 8. Bu sınırlamalar için telafi etmek için biz çift taraflı aydınlatma ve çözüm (jant) eşleşen bir kırılma indisi ile kombine netlik tekniği9 basitleştirilmiş bir sürümünü kullanmak için önerilen. Bu nedenle, bu sistem bakımı iyi nitelik kararlılık Aksiyel ve yanal8uçak iken 10 x 10 x 10 mm3 daha büyük bir örnek görüntüleme için sağlar.
Bu sistem ilk floresan boncuk cam boru içinde farklı konfigürasyonlarda düzenlenmiş kullanılarak kalibre. Sonra sistem Doğum sonrası ve yetişkin fare kalpler görüntü için kullanıldı. İlk olarak, Doğum sonrası fare kalp 7 gün (ventrikül boşluğuna, kalınlığı ventrikül duvar, vana yapıları ve trabeculation varlığını ortaya çıkarmak için P7) görüntüsü. İkinci olarak, bir çalışma cardiomyocytes 1 gün (P1) Cre etiketli cardiomyocytes ve Sarı floresan protein (YFP) ile Doğum sonrası fare kalp kullanarak hücre tanımlamak için yapılmıştır. Son olarak, yetişkin fareler 7,5 aylıkken böbrek dış medüller potasyum varlığı (ROMK) kanalları gen terapisi8' den sonra gözlemlemek için görüntüsü.

<table><tbody><tr><td>CW Lazer</td><td>Laserglow Teknolojileri</td><td>LMM-GBV1-PF3-00300-05</td><td>Floroforların uyarılması</td></tr><tr><td>Nötr yoğunluk filtresi</td><td>Thorlabs</td><td>NDC-50C-4M</td><td>Sisteme giren ışık miktarını kontrol eder</td></tr><tr><td>Akromatik ışın genişletici</td><td>Thorlabs</td><td>GBE05-A</td><td>Işık huzmesini genişletir</td></tr><tr><td>Mekanik yarık</td><td>Thorlabs</td><td>VA100C</td><td>Işın genişliğini kontrol eder</td></tr><tr><td>Işın ayırıcı</td><td>Thorlabs</td><td>BS013</td><td>Çift aydınlatmalı huzme oluşturur</td></tr><tr><td>1X objektif lensli stereo mikroskop</td><td>Olympus</td><td>MVX10</td><td>Numunenin gözlemlenmesi için kullanılır</td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0 LT sCMOS kamera</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C11440-42U</td><td>Görüntü yakalamak için kullanılır</td></tr><tr><td>Akrilonitril bütadien stiren (ABS)</td><td>Stratasys</td><td>uPrint</td><td>Bir numune tutucuyu 3D yazdırmak için kullanılan malzeme</td></tr><tr><td>Floresan polistiren boncuklar</td><td>Spherotech Inc</td><td>PP-05-10</td><td>Görüntüleme sistemi kalibrasyonu için kullanılır</td></tr><tr><td>Borosilikat cam boru</td><td>Corning</td><td>Pyrex 7740</td><td>Numune gömme için boru</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-4</td><td>Numune odası için doldurun</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu su</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP39920</td><td>Fare kalpleri için durulama solüsyonu</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Elektron mikroskobu bilimleri</td><td>RT-15700</td><td>İlk inkübasyon çözeltisi</td></tr><tr><td>Akrilamid</td><td>Wako Chemicals</td><td>AAL-107</td><td>Fare kalpleri için ikinci inkübasyon solüsyonu için 2,2'-Azobis dihidroklorür ile karıştırılmış</td></tr><tr><td>2,2'-Azobis dihidroklorür</td><td>Wako Chemicals</td><td>VA-044</td><td>Fare kalpleri</td></tr> <tr><td>için ikinci inkübasyon solüsyonu için Akrilamid ile karıştırılmıştırSodyum dodesil sülfat&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71725</td><td>Fare kalpleri için üçüncü inkübasyon çözeltisi için Borik asit ile karıştırılmış</td></tr><tr><td>Borik asit</td><td>Fischer Scientific</td><td>A74-1</td><td>Fare kalpleri için üçüncü inkübasyon çözeltisi için Sodyum dodesil sülfat ile karıştırılmış</td></tr><tr><td>Sigma D2158</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2158</td><td>Kırılma indisi eşleştirme çözeltisi olarak PB, Tween-20 ve Sodyum azid ile karıştırılmış</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11332465001</td><td>Kırılma indisi eşleştirme çözeltisi olarak Sigma D2158, PB ve Sodyum azid ile karıştırılmıştır</td></tr><tr><td>Sodyum azid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td>Kırılma indisi eşleştirme çözümü olarak Sigma D2158, PB ve Tween-20 ile karıştırılmıştır</td></tr><tr><td>GFP ile etiketlenmiş kardiyak spesifik bir Troponin T promotörü ile adeno ilişkili virüs vektörü 9</td><td>Vector Biolabs</td><td>VB2045</td>, ROMK DC Servo Motor Aktüatörü <td>Thorlabs'a bağlandığında GFP'yi ifade eder</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Z825B</td><td>Numunenin hafif levha içinde eksenel yönde hareketi için kullanılır</td></tr><tr><td>K-Cube Fırçalı DC Servo Motor Kontrol Cihazı</td><td>Thorlabs</td><td>KDC101</td><td>Motor aktüatörüne bağlanır ve aktüatörün hareketini kontrol eder</td></tr><tr><td>Amira</td><td>FEI Yazılımı</td><td>N/A</td><td>2 boyutlu ve 3 boyutlu görüntüler üretmek için görselleştirme yazılımı</td></tr></tbody></table>

fare kalp çalışma için ışık sayfalık floresans mikroskobu

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Işık sayfalık floresans mikroskobu mikrometre yüksek bir Aksiyel çözünürlüğünden milimetre ölçek ile hızlı resim alma için yaygın olarak kullanılmış. Geleneksel ışık sayfalık teknikleri uygun örnek doku yönettiği bir tek aydınlatma ışın kullanımı dahil. Bir tek aydınlatma ışını kullanılarak üretilen büyük örnekleri görüntüleri şeritler veya eserler içeren ve düşük çözünürlüğe saçılma ve doku tarafından ışık emilimi nedeniyle muzdarip. Bu çalışmada bir çift taraflı aydınlatma ışını ve Basitleştirilmiş netlik fare kalp için teknik Temizleme optik kullanır. Bu teknikler yürekten lipidler kaldırarak daha derin görüntüleme için izin ve büyük bir alan görüntüleme, 10 x 10 x 10 mm3daha büyük üreten. Sonuç olarak, bu strateji ventrikül boyutları ölçmek, kardiyak lineage izlemek ve kardiyak spesifik proteinler ve iyon-kanalları Doğum sonrası yetişkin fare kalpler yeterli kontrast için kayma dağılımını yerelleştirmek bize sağlar ve çözünürlük.

Açıklanan tekniği fare kalp doku örnekleri bir optik takas ile kombine bir çift taraflı aydınlatma ışını daha derin bir görüntüleme derinliği ve daha büyük görüntüleme birimi yeterli görüntü çözünürlüğü (Şekil 1) ile elde etmek için burada kullanılmıştır. Sistem ayarlamak için floresan boncuk cam boru içinde ve görüntüleme sistemi içinde yerleştirildi. Boncuk sonra yansıma ve x-y uçak, y-z uçak, görüntülenir ve x-z düzlemde nokta elde etmek için işlev (PSF) s...

Bu çalışmada optik takas ile kombine bir çift taraflı aydınlatma ışık sayfalık floresans mikroskobu (LSFM) fare kalp çalışmaya kullanmaktadır.

Fare kalp çalışma için ışık sayfalık floresans mikroskobu

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Bu teknolojinin en büyük avantajı fare kalp ya hızlı görüntüleme için izin olmasıdır. Ve gen terapisi nden sonra hava kanallarının varlığını gözlemlemek için kullanılabilir. Bu yöntem gelişim kardiyolojisi hakkında bilgi sağlasa da nöroloji ve pulmonoloji gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.Genellikle bireyler bu teknikle mücadele edeceklerdir, çünkü yetişkin fare kalbinin bir görüntülemesini yapmak zor olabilir ve konfokal ve ters mikroskopi gibi diğer geleneksel tekniklerden farklıdır. 405 nanometre, 473 nanometre ve 532 nanometre üç dalga boyları ile sürekli dalga lazer yerleştirin. Daha sonra, ayna bir yapıştırın ve kiriş için 45 derece ayna düzlemi ile hizalayın.Bu, lazeri çift taraflı aydınlatma kurulumlarını oluşturan ışın ayırıcıya yönlendirir. Daha sonra, 50 milimetre çapında nötr yoğunluk filtresi, bir ışın genişletici ve 25 milimetre çapında iğne deliği, birbirinden 150 milimetre konumlandırılmış bir ışın geçmek. Kirişi iğne deliğinden 150 milimetre uzaklıktaki 50-50 ışın bölücüse geçirin.Sonra, aynayı ışın ayırıcısından 150 milimetre, ileri ışına 90 derece, ve ayna düzlemi ışına 45 derecelik açıyla hizala. Sonra, aynayı aynadan üç 100 milimetre uzakta yerleştirin ve ayna düzleminin ayna ikiden yansıyan ışınına 45 derecelik bir açıyla hizala. Bu yansıyan ışını çift aydınlatma Lı ışık sayfasının bir tarafını oluşturmak için kullanın.Işın ayırıcısının uzak tarafına, ayna yıyerleştir inki, böylece ayna düzlemi 45 derecede, ileri yönde yayılan ışına kadar. Çift aydınlatma ışık sayfasının ikinci tarafını oluşturmak için ayna beşten yayılan ışını kullanın. Daha sonra, sistemik moda çift taraflı aydınlatma sistemi kurmak.Silindirik lensi ayna üçten iki 150 milimetre uzağa, diğer bir özdeş silindirik lensi ise ayna beşten 150 milimetre uzakta, çift aydınlatma düzeninin diğer tarafına yerleştirin. Daha sonra, her biri silindirik lenslerle aynı hizada, 90 derecelik kirişi yansıtacak şekilde 50 milimetrelik mesafelere iki ayna yerleştirin. Işık tabakasının her iki tarafında, bir çift mercekten akromatik bir doublet oluşturur, ilk lens önceki aynadan 100 milimetre uzaklıkta ve bir inç çapında ve odak uzaklığı 100 milimetredir.İkinci lens lens bir 160 milimetre yerleştirilmelidir, bir inç çapı ile, ve odak uzaklığı 60 milimetre. Daha sonra, aydınlatma hedeflerini önceki akromatik doublet'lerden bir ve iki 150 milimetre yerleştirin, böylece ışınla aynı hizada olurlar. Hedeflerden yayılan ışın, numunelerin görüntülenmesi için ışık sayfasını oluşturur.İlk olarak, floresan boncuk örneğini, önceden ısıtılmış kırılma indisi eşleştirme çözeltisinde 1'den 150'ye kadar olan 0,53 mikrometre boncuk çözeltisini seyrelterek, yüzde bir düşük erime ile agarose'u işaret ederek hazırlayın. Sonra, 12 milimetre iç çapı ile borosilikat cam boru bir parça kullanın, ve 18 milimetre bir dış çapı, 30 milimetre uzunluğunda. Pipet borosilikat boru boncuk agarose çözeltisi ve oda sıcaklığında katılaşmak için agarose sağlar.Şimdi, bir 3-D baskılı ABS odası doldurun 99.5 yüzde gylcerol çözeltisi ile. Borosilikat cam boru yerleştirin, boncuk içeren, odanın içine. ABS haznesinde numunenin hareketini ve yönünü kontrol etmek için borosilikat cam boruya 3 boyutlu motorlu çeviri aşaması takın.Ardından, saniyede 30 kare hızında sCMOS kamerayı kullanarak görüntü elde etmek için özel tasarlanmış yazılımkullanın. Motor denetleyicisini kullanarak, numuneyi yanal yönde bir milimetre hareket ettirin ve numunenin tamamı görüntülene ne kadar görüntülenene kadar her bir milimetrelik artışla görüntüler elde edin. Bir görselleştirme yazılımı kullanarak edinilen görüntüleri yığını ve bu boncuk görüntüleri kullanarak sistemin nokta yayma işlevini ölçmek.PH'sı 7,5 olan bir kırılma indisi eşleştirme çözümü kullanın ve eşleşen çözeltiye yüzde bir agarose çözün. Kırgın indeks eşleştirme çözeltisine yüzde bir agarose çözünmüş olarak temizlenmiş bir yetişkin fare kalp örneği yerleştirin. Daha sonra, borosilikat cam boru içine örnek ekleyin ve agarose oda sıcaklığında katılaşmak için izin.Numunenin hareketini ve yönünü kontrol etmek için borosilikat cam boruya 3-B baskılı ABS haznesine 3-B motorlu çeviri aşaması takın. Numuneyi, çift aydınlatma sistemi tarafından oluşturulan Gauss kirişinin merkezinde olacak şekilde yerleştirin. Ardından, sCMOS kameranın satın alma oranını saniyede 30 kare olarak ayarlayın.Şimdi, motor kumandasını kullanarak, numuneyi eksenel yönde bir milimetre hareket ettirin ve her bir milimetrelik artışta görüntüler elde edin. Tüm örnek görüntülenene kadar devam edin. Bir görselleştirme yazılımı kullanarak elde edilen görüntüleri yığını.Bu görüntü yığınlarını kullanarak 3-B görüntüleri geliştirin. Bunu başarmak için, daha önce belirlenen nokta yayma işlevini deconvolve ve elde edilen görüntü yığınları için kullanmak. Son olarak, kalbin hatlarını gözlemlemek için bir piksel eşik yoğunluğu değeri ayarlayın ve bu gri ölçek yoğunluğuna bağlı olarak görüntülere sözde renk ekleyin.Doğum sonrası ilk günde, diğer özelliklerin yanı sıra kapakçıklar, atriyum, ventrikül, pektinate kas ve trabekülasyon görselleştirebilirsiniz. Doğumdan sonraki yedinci günde, özellikler daha da tanımlanır. Atriyum, ventrikül, ventriküler kavite boyutları ve ventrikül duvar kalınlığı belirgindir.Kalp içinde kardiyomiyosit farklılaşmasını incelemek için, heterozigot knock-in fareler kardiyomiyositgöstermek için cre-labeled edildi. Etiketli hücreler burada, her düzlem yönünde gösterilir. Üç uçak birleşerek kalbin 3 boyutlu bir görüntüünü oluşturdu.Inset içinde kırmızı daire li bölge netlik tekniği geçiyor ve borosilikat cam boru içine yerleştirilen sonra iki yarı saydam fare kalpleri gösterir. Doğum sonrası fareleri incelemenin yanı sıra, görüntüleme sistemi yetişkin fare kalbini incelemek için de kullanılabilir. Burada, GFP etiketli ROMK kanalları 7,5 ay olarak gösterilir.Bunlar çoğunlukla ventriküler duvarda bulunmuştur. Bir kez hakim, bu teknik bir ila iki dakika içinde yapılabilir. Bu yordamı çalışırken, tüp içinde örnek etrafında tüm kabarcıklar kaldırmak için önemlidir.Görüntü yığınlarının otomatik bölümlenmesi gibi diğer yöntemler, kardiyovasküler yaralanma ve rejenerasyon ile ilgili ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir. Gelişiminden sonra, bu teknik araştırmacılar tarafından farelerde doğum sonrası ve erişkin gelişim evrelerinde kardiyak mimariyi incelemek için kullanılmıştır.

light-sheet-fluorescence-microscopy-for-the-study-of-the-murine-heart

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

kalbinde, moleküler olaylar organın elektrik ve kasılma fonksiyonunu koordine ederler. Burada sunulan yerel alan floresan mikroskopi teknikleri bir dizi sağlam kalplerinde hücresel değişkenlerin kaydedilmesini sağlar. kalp fonksiyonlarını tanımlayan mekanizmaları belirleme kalp patolojik durumlar altında nasıl çalıştığını anlamada önemlidir.

Yerel Alan Floresan Mikroskopi: Bozulmamış Kalpler Hücresel Sinyalleri Görüntüleme

Burada, CD11c.DTR farelerinin intratrakeal difteri toksini tedavisi ile indüklenen, bir aseptik fulminan miyokardit modelinde kardiyak CD45 + lökosit infiltrasyonunu görselleştirmek için bir ışık-tabakalı mikroskopik yaklaşım anlatılmaktadır.

Bir Fulminan Miyokardit Modelinde Işık Yeri Mikroskopisi İle Lökosit İnfiltrasyonunun Nicel Görselleştirilmesi

Burada, zebra balığı 4-boyutlu (4 D) kalbimizde geliştirme görselleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Işık sayfalık floresans mikroskobu (LSFM), üzerinden 4-D görüntüleme gelişmekte olan kalpleri yeniden oluşturmak için zaman içinde 3 boyutlu (3-D) görüntüleri alır. Nitelik ve nicelik endocardial çentik kardiyak trabeculation teşvik odası geliştirme sırasında sinyal kesme stres etkinleştirir gösteriyoruz.

Yamultma stres gelişmekte olan zebra balığı kalp oransal etkileri 4 boyutlu görüntülerini yakalamak için ışık sayfalık floresans mikroskobu

Zebra balığı kalbinin in vivo ışık tabakası floresan mikroskopisi ile incelenmesi için optimize edilmiş araçlar açıklıyoruz. Özellikle, parlak kardiyak transgenik çizgiler öneriyoruz ve gelişimsel ve kalp kusurlarını önleyen yeni nazik gömme ve hareketsizleştirme teknikleri sunuyoruz. Kardiyak görüntülemeye uyarlanmış olası bir veri toplama ve analiz boru hattı da sağlanmaktadır.

Zebra Balığı Embriyolarında Hızlı Kardiyak Dinamiklerin Işık Tabakası Mikroskopisi

Doku transformasyonu ve boyamadaki yeni gelişmeleri eksenel olarak taranmış bir ışık tabakası mikroskobunun geliştirilmesiyle birleştirerek tüm fare kalbinin mezoskopik rekonstrüksiyonu için bir yöntem sunuyoruz.

Tüm Fare Kalbinin Mezoskopik Optik Görüntülenmesi

Bu protokol, murin pulmoner venlerinin mikroskopi kılavuzluğunda izolasyonunu ve immünofloresan boyamasını gösterir. Sol atriyum, pulmoner venler ve ilgili akciğerleri içeren doku örnekleri hazırlıyoruz ve bunları kardiyak Troponin T ve Connexin 43 için boyuyoruz.

Murin Pulmoner Venlerde Miyokard Kılıflarının Mikrodiseksiyonu ve İmmünofloresan Boyanması

Protokol, kemirgen kalplerindeki karmaşık kardiyak yapıları araştırmak için uyarlanmış doku temizleme yöntemleriyle birlikte gelişmiş ışık tabakası mikroskobunu kullanır ve kardiyak morfogenezin anlaşılması ve yeniden şekillenmesi için büyük bir potansiyele sahiptir.

Kemirgen kalplerinde kalp yapısını ortaya çıkarmak için ışıklı tabaka görüntüleme

Reperfüze akut miyokard enfarktüsünde (repAMI) kardiyak hasarın üç boyutlu (3D) rekonstrüksiyonu, ilişkili hastalığı etkileyen paternlerin aslına uygun olarak ölçülmesini ve birlikte lokalizasyonunu sağlar. Burada, kardiyak hasarın, risk altındaki alanın ve bağışıklık hücresi tepkisinin eşzamanlı ölçümü için otomatikleştirilebilir bir ışık tabakası kılavuzluğunda görüntüleme yaklaşımı sağlanmıştır.

Işık Tabakası Floresan Mikroskobu Kullanılarak Reperfüze Akut Miyokard Enfarktüsünde Kardiyak Hasar ve İmmün Yanıtın Eşzamanlı 3D Analizi

Basınç koşulları fizyolojik ve patolojik kalp kapakçığı dokusu tabi yapabilen bir siklik basınç biyoreaktör dizayn edilmiştir. LabVIEW programı, kullanıcıların basınç büyüklüğü, genlik ve frekans kontrol etmenizi sağlar. Bu cihaz, kalp kapakçığı dokusu veya izole hücrelerin mechanobiology incelemek için kullanılabilir.

Devirli Basınç Biyoreaktör Tasarım Ex vivo</emAort Kalp Vanalar> Eğitim

Kişiselleştirilmiş modelleme için hastanın kalp geometrileri in vivo görüntülerini gelen ventriküler lif yönelimleri tahmin etmek için bir metodoloji açıklanmaktadır. Metodolojinin Doğrulama normal kullanım ve köpek kalpleri göstermek başarısız gerçekleştirilen bir klinik gözlemlenebilir düzeyinde tahmin ve kazanılmış elyaf yönelimleri arasında anlamlı farklılıklar olduğu.

Kalp Hastaya özel Modelleme: Ventriküler Fiber Yönelimlerin Tahmini

Öğrenin fare kalp görüntüleme için çift taraflı aydınlatmalı ışık sayfalık floresans mikroskobu kullanımını. Optik temizleme ile hızlı görüntüleme ve gen tedavisi sonrası yapısal değişiklikleri gözlemleyin.

Fare kalp çalışma için ışık sayfalık floresans mikroskobu

Daha fazla video keşfet