Name: Mitokondrial DNA metilasyonu doğru algılanması için metodoloji (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Keşfedin mitokondriyal DNA metilasyonunun doğru kantifikasyonu için bisülfit dizileme protokolü ve biyoinformatik analiz yöntemini. Bu teknik, mitoepigenetik alanındaki hastalık ilişkili araştırmalar için güvenilir sonuçlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Novo Nordisk Vakfı Merkezi temel metabolik araştırma Kopenhag Üniversitesi kısmen sınırsız bir bağış Novo Nordisk Vakfı tarafından finanse edilen bir bağımsız araştırma merkezidir.

1. Restriksiyon enzimi tedavi
<ol><li>MtDNA insan mitokondriyal DNA'sını 14258 pozisyonda keser BamHI, Restriksiyon enzimi ile toplam insan DNA'sı kabul ederek linearize. Not: fare DNA için aynı koşullar altında Restriksiyon enzimi BglII aşağıdaki gibi kullanın.</li>
	<li>Her biri için mtDNA metilasyonu değerlendirilmesi, bir 0.2 mL tepki tüp hazırlamak ve (fluorometry tarafından sayısal), aşağıdaki mix: 3 μg genomik DNA eklemek için nerede 15 μL örnek tampon 3, 3 μL BamHI ve su ilâ 150 μL</li>
	<li>37 ° C'de 4 h için termal cycler tüplerde yer</li>
</ol>2. bisülfit dönüştürme
<ol><li>BamHI tedavi edilen DNA başka bir yerde29açıklandığı gibi Sodyum bisülfit kullanarak dönüştürmek.</li>
	<li>200-500 ng DNA BamHI tedavi edilen toplam hacmi 20 μL her dönüşüm reaksiyonu için kullanın. DNA kurtarma % 50-70 olduğunu.</li>
	<li>10 μL elüsyon arabelleği bisülfit dönüştürülmüş DNA elute.</li>
	<li>Tek iplikçikli DNA'fluorometry tarafından ölçmek.</li>
	<li>İsteğe bağlı: protokolü ile kalan geçmeden önce bisülfit dönüştürülmüş DNA-20 ° C'de depolayın. Uzun süreli depolama için bisülfit dönüştürülmüş DNA-80 ° C'de depolayın</li>
</ol>3. astar sıralama bisülfit tasarımını
<ol><li>Astarlar çevrimiçi araçlar Methprimer30 ve BiSearch31,32kullanarak bisülfit sıralama için tasarım. Not: Methprimer ve BiSearch astar bağlama dizileri genom dizileri aramak için nereye cytosines thymines, benzer şekilde sonrası bisülfit tedavi için dönüştürülür izin.</li>
	<li>İçin en uygun ve tarafsız güçlendirme, amplicon boyutu 100-300 bp arasında tasarım ve astar KSY dinucleotides kaçının.</li>
	<li>Tasarlanmış astar mitokondrial DNA'yı BiSearch'ın işlevini Astar aramakullanarak belirli olduğundan emin olun. Zaten tasarlanmış bisülfit dönüştürülmüş astar yerleştirin, tıkırtı belgili tanımlık bisülfit kutu ve başvuru genom ve PCR parametreleri de ekleyin. Not: Olası PCR ürünlerinin bir listesini görüntüler.</li>
	<li>1-5 astar dizileri üst kopyalayın ve oligonükleotid sentezi için bir sipariş formu içine yapıştırın. Not: İnsan listesini ve laboratuar ortamında doğrulandı fare mtDNA astar dizileri Tablo 1' de görüntülenir.</li>
	<li>Bisülfit kullanarak test astar 4. adımda açıklanan özel jel elektroforez izleyip PCR dönüştürülür. Test ve tüm astar çiftleri ayrı ayrı optimize etmek ve doğru amplicon boyutu üzerinde özel jel görünür sağlamak. Not: çoğullama astar gerekiyorsa, birden çok astar bir PCR reaksiyon tek ve özel jel elektroforez ya da, daha resolutive bir yöntem gibi benzer ürünlerin ayırt etmek için polyacrylamide Jel Elektroforez, PCR ürünlerde görselleştirmek ekleme boyutu.</li>
</ol>4. bisülfit PCR ve jel ayıklama dönüştürülür
<ol><li>Faiz bölgelerinde yükseltmek için PCR sıcak başlangıç Taq polimeraz kullanarak gerçekleştirin. Kısaca, DNA, 500 µM anlam ve anti-anlamda astar, 1 µL dNTP mix (her dNTP 10 µM) ve polimeraz 7.5 U/tepki olarak toplam hacmi 50 µL., mix 100 ng dönüştürülür çalıştırmak PCR ile aşağıdaki koşullar: 95 ° C'de 5 dk (60 s 94 ° C; 60 s 55 ° C *; 60 s 72 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 35 döngüleri; 10 dk 72 ° C. Astar ya da ayrı ayrı kullanın veya multiplexed.</li>
	<li>İsteğe bağlı: astar çoğullama zaman kullanım 200 ng DNA ve aşağıdaki Bisiklet koşullarını dönüştürülür: 5 min 95 ° C (60 s 94 ° C; 90 s 55 ° C *; 90 s 72 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 35 döngüleri; 10 dk 72 ° C. Not: Sıcaklık astar erime sıcaklığı bağlı olarak değişebilir.</li>
	<li>Konu PCR ürünleri üzerinde % 2 özel 100 volt Elektroforez jel.</li>
	<li>Nazik UV ışık altında PCR ürünleri bir neşter ile ayıklamak ve mikrotüpler için ekleyin. PCR ürünleri DNA hasarı önlemek için aşırı UV ışık için maruz bırakmayın. Pozlama süresi 30 'un üzerinde kaçının s.</li>
	<li>PCR ürünleri3daha önce açıklandığı gibi jel arıtma kullanarak arındırmak.</li>
	<li>4.5. adımdaki saf DNA ölçmek fluorometry kullanarak. Adım 5 ya da mağaza örnekleri-20 ° C'de geçin</li>
</ol>5. bisülfit Kütüphane hazırlık sıralama
<ol><li>Kütüphane hazırlık bisülfit dönüştürülmüş PCR ürünlerinin gerçekleştirin. İsteğe bağlı: Bu aşamada PCR ürünleri multiplex.</li>
	<li>Son onarım ilâ 100 kullanarak gerçekleştirmek ng PCR ürünü. 55,5 µL PCR ürünü 0.2 mL tüp içinde 3 µL son hazırlık enzim ve 6.5 µL son onarım tepki arabellek (10 x) ekleyin. Yerleştirin ve 65 ° C'de 30 dk ardından 20 ° C'de 30 dk için termal cycler tüpte kuluçkaya</li>
	<li>Sıralama adaptörleri 15 µL Blunt/TA ligaz ile karıştırın, 2.5 µL sonunda tamir DNA karıştırılarak ligate adaptör ve 1 µL ligasyonu artırıcı. Kullanıyorsanız &lt; 100 ng PCR ürünü olarak giriş, seyreltik adaptör 10 kat.</li>
	<li>Bir termal cycler mix (adım 5.3) yerleştirin ve 20 ° C'de 15 dakika kuluçkaya Termal cycler duraklatmak ve 3 µl Kullanıcı eklemek tüp enzim. Mix ve tüp içinde geri termal cycler yerleştirin ve 37 ° C'de 15 dakika kuluçkaya</li>
	<li>Boyutu adaptör bakmaksızın DNA katı faz ters çevrilebilir immobilizasyon (SPRI) boncuk boncuk DNA PCR ürünü boyutuna bağlı olarak değişen oranlara sahip kullanarak seçin.</li>
	<li>13.5 µL H2O adaptör bakmaksızın DNA için adım 5.4 ve 55 resuspended µL SPRI boncuk ekleyin. 5 min ve yer tüp manyetik bir stand için oda sıcaklığında kuluçkaya. Çözüm açık olduğunda, süpernatant aktarmak için yeni bir tüp ve boru boncuk içeren atın. Not: Adaptör bakmaksızın DNA süpernatant içerir ve büyük istenmeyen parçaları için atılan boncuk bağlı.</li>
	<li>25 resuspended µL SPRI boncuk 5.6 adımından süpernatant için ekleyin, karıştırın ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya. Tüp manyetik sandalyesine koyun ve çözüm açık olduğunda süpernatant atın. Not: adaptör bakmaksızın DNA boncuk için bağlı olduğu, ancak atılan süpernatant istenmeyen DNA içerir.</li>
	<li>Tüp manyetik kürsüye olmakla birlikte, boncuk yıkamak için 200 µL % 80 etanol (taze hazırlanmış) ekleyin. 30 kuluçkaya s ve Kaldır ve atma süpernatant. Toplam 2 yıkama için bu adımı yineleyin.</li>
	<li>Tüp manyetik stand ile açık bir kapak açıkken kuru boncuk 5 min için hava.</li>
	<li>Tüp mıknatıs kaldırmak, DNA 23 µL elüsyon arabelleği elute ve karıştırın. 2 min için oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
	<li>Tüp manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve çözüm açık olduğunda, pre-PCR güçlendirme (adım 5.14) için bir 96-şey PCR tabak 2 µL aktarmak.</li>
	<li>Geri kalan yaklaşık 21 µL PCR güçlendirme (adım 5.17) için yeni bir 0.2 mL tüp aktarın. Not: herhangi bir boncuk boncuk sonraki adımlar Enzimatik reaksiyonları inhibe olabilir gibi aktarmak değil emin olun.</li>
	<li>Adım 5,14 ya da mağaza örnekleri-20 ° C'de geçin</li>
	<li>Pre-PCR güçlendirme adaptör bakmaksızın DNA yükseltmek için gerekli devir sayısını tahmin etmek için RT-qPCR tarafından gerçekleştirin. 96-şey PCR sayfalarımızda plaka içeren 2 µL DNA (adım 5.11) tepki ekleyin: 0.4 µL Dizin astar, 0.4 µL evrensel PCR astar, 7.2 µL H2O, 10 µL RT-qPCR ana karışımı.</li>
	<li>Plaka bir gerçek zamanlı PCR makinesinde yerleştirin ve plaka için aşağıdaki koşullar Konu: 30 s 98 ° c (10 s 98 ° C; 75 s 65 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 20 döngüleri; 5 dk 65 ° c</li>
	<li>Her örnek için bir Ct-öncesi amplifikasyon RT-qPCR PCR reaksiyon doğrusal aşamasının sonuna karşılık gelen Ct değerini çıkararak gerekli amplifikasyon döngü sayısı tahmini.</li>
	<li>Adım 5.12 adaptör bakmaksızın DNA'dan karıştırılarak yükseltmek: 21 µL DNA, 25 µL PCR ana karışımı, 1 µL Dizin astar, 1 µL evrensel PCR astar ve 2 µL H2o Termal cycler içinde her örnek için aşağıdaki koşullar Konu: 30 s 98 ° c (10 s 98 ° C; 75 s 65 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> [adım 5,16 hesaplanan Ct] döngüleri; 5 dk 65 ° c Not: yalnızca bir dizin astar örnek başına çoğullama için izin vermek için kullanmayı unutmayın. Dizin PCR sırasında eklenir.</li>
	<li>Güçlendirilmiş DNA SPRI boncuk arındırmak ve 22 µL elüsyon arabellekte elute.</li>
	<li>Kütüphane kalite jel elektroforez veya alternatif yöntemi tarafından kontrol. Doğru kitaplığa en yüksek boyutları (PCR ürün (ler) boyutu artı adaptör) arayın.</li>
	<li>Smear analizi ile Kütüphane ürün (ler) ortalama baz çifti boyutunu tahmin etmek: Gelişmiş genel ayarları'nda, "tablo" karalama analiz altında çift tıklatın. 100-1000 bp bölgesinden tanımlamak ve Tamam' ı tıklatın. Bölge tabloaltında tanımlanmış bölge görünür ve Kütüphane ortalama boyutu (bp) hesaplanır.</li>
	<li>Kütüphaneler tarafından fluorometry ölçmek. Adım 6 veya mağaza kitaplıklara-20 ° C'de devam</li>
</ol>6. sonraki üretimi sıralaması
<ol><li>NM konsantrasyon kütüphanelerin formülü kullanarak hesaplar: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq1.jpg">
</li>
	<li>Aynı nM konsantrasyon örneğin 2 nM için kitaplıklarına seyreltik (4 seçin nM, 2 nM, 1 nM veya 0.5 nM kitaplığına konsantrasyonları bağlı olarak). Bir havuz 2 nM kütüphanelerin elde etmek için tüm kitaplıkları havuz.</li>
	<li>Denatüre ve sıralama araç kılavuz aşağıdaki kütüphaneleri oranında seyreltin. Kısacası: 0.2 N NaOH ekleyerek 2 nM havuz tabiatını ve 5 dk. Dilute denatüre havuzun 10 de son bir seyreltme için oda sıcaklığında kuluçkaya. Denatüre ve 12: 17 son bir seyreltme için piyasada bulunan bir denetim kitaplığı oranında seyreltin. Yeni bir tüp 10 de havuzu % 20 12: 17 denetim kitaplığı ile karıştırın. Not: Bisülfit dönüşüm çok düşük karmaşıklık getirir. % 20 denetim kitaplığı spike-daha iyi sıralama kalitesinde neden olur.</li>
	<li>150 bp eşleştirilmiş uç sıralama derin sıralama aracı kullanarak çalıştırın.</li>
</ol>7. sayısal analiz - tahmin metilasyonu düzeyleri
<ol><li>.Fastq dosyaları (burada sample1_R1.fastq.gz ve sample1_R2.fastq.gz denir) oluşturmak, bismark dizini ilgi tüm genom kopyası oluştur (burada bismarkIndexadında bir klasör içinde) ve chrM genom dizisini fasta içinde kullanılabilir olduğundan emin olun biçimi (burada chrMadında bir klasör içinde).</li>
	<li>Okuma bağdaştırıcıları ve astar tarafından tanıtılan önyargı kaldırmak için ön işlemden: Trim_galore33aracını kullanın. İki nükleotid 5' sonundan ileriye ve geriye doğru okuma kaldırın. trim_galore--clip_R1 2 - clip_R2 2 -Ey. /--trim1--eşleştirilmiş sample1_R1.fastq.gz sample1_R2.fastq.gz</li>
	<li>Bismark34 kullanarak tüm genom önceden işlenmiş okuyan Hizala Bismark--kırlangıç--bam -ey. /. / bismarkIndex / -1 -2./sample1_R1_val_1.fq.gz./sample1_R2_val_2.fq.gz Not: başka bir aligner kullandıysanız, benzersiz olarak hizalanamaz okuma atılır emin olun.</li>
	<li>Özü kromozom M, burada Samtools35 kullanarak eşleme okur samtools -l 0 - O BAM -o sample1_sorted.bam sıralama sample1_R1_val_1_bismark_bt2_pe.bam samtools Dizin sample1_sorted.bam samtools göster -u sample1_sorted.bam chrM | samtools - n - O BAM -o sample1_chrM.bam sıralama</li>
	<li>Metilasyon bilgileri ayıklamak bismark_methylation_extractor -p--CX--cytosine_report--kapsamlı--genome_folder. / chrM./sample1_chrM.bam</li>
	<li>.bedgraph, .cov veya CX_report.txt dosyalar daha fazla çözümleme için kullanın. Sample1_chrM.CX_report.txt dosyasını, görselleştirme ve sınamak için kullanın.</li>
	<li>Birden çok bölge sorguya ve astar önyargı eşleme sırasında oluşturulan M-önyargı parsellerde görülebilir daha fazla önişleme adımda, kırpma gerçekleştirin. Daha fazla bilgi için Bismark belgelerine bakın.</li>
</ol>8. sayısal analiz - Test farklılıklar
<ol><li>CX_report.txt dosya için her C kromozom M üzerinde 7 sütunlar, kromozom (burada chrM), konumu, strand, metillenmiş okuma sayısı, bazlar okuma, C bağlam ve çevresindeki sıra, içerdiğinden emin olun.</li>
	<li>CX_report chrM tamamını kapsayan olarak güçlendirilmiş region(s) için alt küme küme kontrol edin.</li>
	<li>Parametrik olmayan testler örnekleri, bir balıkçılar'ın tam test bireysel C için veya bir bütün bölge için bir işareti test gibi arasındaki farklar için kullanın. Not: Miktar çoğu zaman neden normallik varsayarak uygun olmaması neden olduğu % 0 metilasyonu yakın olacaktır.</li>
	<li>Benzer şekilde, görselleştirme için quantil görselleştirmek veya binom oran güven aralıkları hesaplamak.</li>
</ol>

<ol><li>Falkenberg, M., Larsson, N. -G., Gustafsson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+and+transcription+in+mammalian+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">DNA replication and transcription in mammalian mitochondria.</a> Annu Rev Biochem. 76, 679-699 (2007).</li>
<li>Kolesar, J. E., Wang, C. Y., Taguchi, Y. V., Chou, S. -H., Kaufman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+intact+mitochondrial+DNA+agarose+electrophoresis+reveals+the+structural+complexity+of+the+mammalian+mitochondrial+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional intact mitochondrial DNA agarose electrophoresis reveals the structural complexity of the mammalian mitochondrial genome.</a> Nucleic Acids Res. 41 (4), e58(2013).</li>
<li>Mechta, M., Ingerslev, L. R., Fabre, O., Picard, M., Barres, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+Suggesting+Absence+of+Mitochondrial+DNA+Methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Evidence Suggesting Absence of Mitochondrial DNA Methylation.</a> Front Genet. 8, 166(2017).</li>
<li>Ehrlich, M., Gama-Sosa, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amount+and+distribution+of+5-methylcytosine+in+human+DNA+from+different+types+of+tissues+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Amount and distribution of 5-methylcytosine in human DNA from different types of tissues of cells.</a> Nucleic Acids Res. 10 (8), 2709-2721 (1982).</li>
<li>Lister, R., Pelizzola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+DNA+methylomes+at+base+resolution+show+widespread+epigenomic+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences.</a> Nature. 462 (7271), 315-322 (2009).</li>
<li>Yan, J., Zierath, J. R., Barres, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+non-CpG+methylation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Evidence for non-CpG methylation in mammals.</a> Exp Cell Res. 317 (18), 2555-2561 (2011).</li>
<li>Patil, V., Ward, R. L., Hesson, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evidence+for+functional+non-CpG+methylation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">The evidence for functional non-CpG methylation in mammalian cells.</a> Epigenetics. 9 (6), 823-828 (2014).</li>
<li>Nass, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+methylation+of+mitochondrial+and+nuclear+DNA+in+cultured+mouse%2C+hamser+and+virus+trasnforemd+hamser+cells+in+vivo+and+in+vitro+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential methylation of mitochondrial and nuclear DNA in cultured mouse, hamser and virus trasnforemd hamser cells in vivo and in vitro methylation.</a> J Mol Biol. 80 (1), 155-175 (1973).</li>
<li>Shock, L. S., Thakkar, P. V., Peterson, E. J., Moran, R. G., Taylor, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methyltransferase+1%2C+cytosine+methylation%2C+and+cytosine+hydroxymethylation+in+mammalian+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">DNA methyltransferase 1, cytosine methylation, and cytosine hydroxymethylation in mammalian mitochondria.</a> PNAS. 108 (9), 3630-3635 (2011).</li>
<li>Bellizzi, D., D'Aquila, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Control+Region+of+Mitochondrial+DNA+Shows+an+Unusual+CpG+and+Non-CpG+Methylation+Pattern%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Res%22%5BJournal%5D)">The Control Region of Mitochondrial DNA Shows an Unusual CpG and Non-CpG Methylation Pattern.</a> DNA Res. 20 (6), 537-547 (2013).</li>
<li>Jia, Y., Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Low-Protein+Diet+Affects+Epigenetic+Regulation+of+Hepatic+Mitochondrial+DNA+Transcription+in+a+Sex-Specific+Manner+in+Newborn+Piglets+Associated+with+GR+Binding+to+Its+Promoter%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Maternal Low-Protein Diet Affects Epigenetic Regulation of Hepatic Mitochondrial DNA Transcription in a Sex-Specific Manner in Newborn Piglets Associated with GR Binding to Its Promoter.</a> PLoS ONE. 8 (5), e63855(2013).</li>
<li>Jia, Y., Song, H., Gao, G., Cai, D., Yang, X., Zhao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Betaine+Supplementation+during+Gestation+Enhances+Expression+of+mtDNA-Encoded+Genes+through+D-Loop+DNA+Hypomethylation+in+the+Skeletal+Muscle+of+Newborn+Piglets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Agric+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Maternal Betaine Supplementation during Gestation Enhances Expression of mtDNA-Encoded Genes through D-Loop DNA Hypomethylation in the Skeletal Muscle of Newborn Piglets.</a> J Agric Food Chem. 63 (46), 10152-10160 (2015).</li>
<li>Infantino, V., Castegna, A., Iacobazzi, F., Spera, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairment+of+methyl+cycle+affects+mitochondrial+methyl+availability+and+glutathione+level+in+Down%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+Metab%22%5BJournal%5D)">Impairment of methyl cycle affects mitochondrial methyl availability and glutathione level in Down's syndrome.</a> Mol Genet Metab. 102 (3), 378-382 (2011).</li>
<li>Chen, H., Dzitoyeva, S., Manev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+valproic+acid+on+mitochondrial+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Effect of valproic acid on mitochondrial epigenetics.</a> Eur J Pharmacol. 690 (1-3), 51-59 (2012).</li>
<li>Dzitoyeva, S., Chen, H., Manev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+aging+on+5-hydroxymethylcytosine+in+brain+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Effect of aging on 5-hydroxymethylcytosine in brain mitochondria.</a> Neurobiol Aging. 33 (12), 2881-2891 (2012).</li>
<li>Menga, A., Palmieri, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLC25A26+overexpression+impairs+cell+function+via+mtDNA+hypermethylation+and+rewiring+of+methyl+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">SLC25A26 overexpression impairs cell function via mtDNA hypermethylation and rewiring of methyl metabolism.</a> FEBS J. 284 (6), 967-984 (2017).</li>
<li>Frommer, M., McDonald, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+sequencing+protocol+that+yields+a+positive+display+of+5-methylcytosine+residues+in+individual+DNA+strands%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.</a> PNAS. 89 (5), 1827-1831 (1992).</li>
<li>Byun, H. -M., Panni, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+airborne+pollutants+on+mitochondrial+DNA+Methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Part+Fibre+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Effects of airborne pollutants on mitochondrial DNA Methylation.</a> Part Fibre Toxicol. 10 (1), 1(2013).</li>
<li>Janssen, B. G., Byun, H. -M., Gyselaers, W., Lefebvre, W., Baccarelli, A. A., Nawrot, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+mitochondrial+methylation+and+exposure+to+airborne+particulate+matter+in+the+early+life+environment%3A+An+ENVIRONAGE+birth+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Placental mitochondrial methylation and exposure to airborne particulate matter in the early life environment: An ENVIRONAGE birth cohort study.</a> Epigenetics. 10 (6), 536-544 (2015).</li>
<li>Zheng, L. D., Linarelli, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+resistance+is+associated+with+epigenetic+and+genetic+regulation+of+mitochondrial+DNA+in+obese+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Insulin resistance is associated with epigenetic and genetic regulation of mitochondrial DNA in obese humans.</a> Clin Epigenetics. 7 (1), 1739(2015).</li>
<li>Byun, H. -M., Colicino, E., Trevisi, L., Fan, T., Christiani, D. C., Baccarelli, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Air+Pollution+and+Blood+Mitochondrial+DNA+Methylation+on+Markers+of+Heart+Rate+Variability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Heart+Assoc%22%5BJournal%5D)">Effects of Air Pollution and Blood Mitochondrial DNA Methylation on Markers of Heart Rate Variability.</a> J Am Heart Assoc. 5 (4), (2016).</li>
<li>Bianchessi, V., Vinci, M. C., et al. Mitochondrion. MITOCH. 27 (C), 40-47 (2016).</li>
<li>Wijst, M. G. P., van Tilburg, A. Y., Ruiters, M. H. J., Rots, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+mitochondria-targeted+DNA+methylation+identifies+GpC+methylation%2C+not+CpG+methylation%2C+as+potential+regulator+of+mitochondrial+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Experimental mitochondria-targeted DNA methylation identifies GpC methylation, not CpG methylation, as potential regulator of mitochondrial gene expression.</a> Sci Rep. 7 (1), 177(2017).</li>
<li>Wong, M., Gertz, B., Chestnut, B. A., Martin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNMT3A+and+DNA+methylation+in+skeletal+muscle+and+CNS+of+transgenic+mouse+models+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Front+cellr+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNMT3A and DNA methylation in skeletal muscle and CNS of transgenic mouse models of ALS.</a> Front cellr Neurosci. 7, 279(2013).</li>
<li>Dawid, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-methylcytidylic+acid%3A+absence+from+mitochondrial+DNA+of+frogs+and+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">5-methylcytidylic acid: absence from mitochondrial DNA of frogs and HeLa cells.</a> Science. 184 (4132), 80-81 (1974).</li>
<li>Gama-Sosa, M. A. <a target="_blank" href="http://www.worldcat.org/title/levels-and-distribution-of-5-methylcytosine-in-chordate-dna/oclc/15059352">Levels and distribution of 5-methylcytosine in Chordate DNA</a>. , 1-201 (1985).</li>
<li>Hong, E. E., Okitsu, C. Y., Smith, A. D., Hsieh, C. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regionally+specific+and+genome-wide+analyses+conclusively+demonstrate+the+absence+of+CpG+methylation+in+human+mitochondrial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regionally specific and genome-wide analyses conclusively demonstrate the absence of CpG methylation in human mitochondrial DNA.</a> Mol Cell Biol. 33 (14), 2683-2690 (2013).</li>
<li>Liu, B., Du, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CpG+methylation+patterns+ofhuman+mitochondrial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Publishing+Group%22%5BJournal%5D)">CpG methylation patterns ofhuman mitochondrial DNA.</a> Nature Publishing Group. , 1-10 (2016).</li>
<li>Donkin, I., Versteyhe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+and+Bariatric+Surgery+Drive+Epigenetic+Variation+of+Spermatozoa+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Obesity and Bariatric Surgery Drive Epigenetic Variation of Spermatozoa in Humans.</a> Cell Metab. 23 (2), 369-378 (2016).</li>
<li>Li, L. C., Dahiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MethPrimer%3A+designing+primers+for+methylation+PCRs%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MethPrimer: designing primers for methylation PCRs.</a> Bioinformatics. 18 (11), 1427-1431 (2002).</li>
<li>Tusnády, G. E., Simon, I., Váradi, A., Arányi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BiSearch%3A+primer-design+and+search+tool+for+PCR+on+bisulfite-treated+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">BiSearch: primer-design and search tool for PCR on bisulfite-treated genomes.</a> Nucleic Acids Res. 33 (1), e9(2005).</li>
<li>Arányi, T., Váradi, A., Simon, I., Tusnády, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BiSearch+web+server%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The BiSearch web server.</a> BMC bioinformatics. 7, 431(2006).</li>
<li>Krueger, F. Trim Galore!. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/">http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/</a> (2018).</li>
<li>Krueger, F., Andrews, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bismark%3A+a+flexible+aligner+and+methylation+caller+for+Bisulfite-Seq+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications.</a> Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).</li>
<li>Li, H., Handsaker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li>
<li>Ramos, A., Barbena, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+insertions+of+mitochondrial+origin%3A+Database+updating+and+usefulness+in+cancer+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Nuclear insertions of mitochondrial origin: Database updating and usefulness in cancer studies.</a> Mitochondrion. 11 (6), 946-953 (2011).</li>
<li>Warnecke, P. M., Stirzaker, C., Song, J., Grunau, C., Melki, J. R., Clark, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+resolution+of+artifacts+in+bisulfite+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing.</a> Methods (San Diego, Calif). 27 (2), 101-107 (2002).</li>
</ol>

Yazarlar bildirmek için rakip hiçbir mali ilgi alanlarına sahip.

Burada, biz mtDNA metilasyonu sorguya çekmek için özel olarak tasarlanmış bir bisülfit-sıralama iletişim kuralı sağlar. Genomik DNA örneği almak için kullanılan bisülfit-sıralama iletişim kuralları ile farklılıklar bir önceki Restriksiyon enzimi sindirim adım ve bioinformatic analiz kullanımı dışarı yanlış pozitif NUMT dizileri kaynaklanan iktidar yatıyor.
MtDNA metilasyonu soruşturma bisülfit-sıralama yapıları önlemek için bir protokol sağlar. Yanlış-mutlak için önde gelen bisülfit sıralama e...

Mitokondrial genom yaklaşık 16,5-kilo Bankası (kb) dairesel, Çift iplikçikli yapısını uzun, bir ağır ve hafif bir tel adıyla aynıdır. Mitokondrial genom her hücresi olarak maternally-miras, birden çok kopya mevcut ve solunum zinciri kompleksleri1temel bileşenlerine kodlar. Benzer bakteriyel genom ve nükleer genom aksine, mitokondriyal genom sayısız ikincil ve üçüncül yapılarını gibi sarmal ve supercoiled yapıları2erişim sırasında sıralama zor hale getirebilir, düzenlenmiştir deneyler3.
Çekirdeğinde, DNA metilasyonu Gen ifadesinin düzenlenmesinde başta olmak üzere çok sayıda süreçlerde bir rol oynayan bir kapsamlı okudu epigenetik işaretidir. Memeli genleri içinde DNA metilasyonu öncelikle deoxycytidines, CG dinucleotides (ya da KSY) üzerinde çoğunlukla pirimidin halka 5 konumunu oluşuyor. Sitozin metilasyonu tüm CpG % 70'i somatik hücreler ve hesapları için toplam % ~ 1 genomu DNA4üsleri bulunur. DNA methylations da EBM, CpT ve TBM gibi sigara CpG bağlamlarda tarif edilmiştir ve embriyonik kök hücre5,6,7tüm metillenmiş cytosines % 25'e kadar değerler ile nükleer DNA çeşitli miktarlarda bulunmaktadır.
Sitozin metilasyonu nükleer genom kopyası yaygın olarak kabul ederken, mitokondriyal DNA (mtDNA) metilasyonu varlığını hala tartışmalıdır. İlk çalışma araştıran mtDNA metilasyonu nerede mtDNA metilasyonu kolayca tespit edildi, kültürlü hücrelerde nükleer DNA8' e göre daha alt düzeylerde rağmen gerçekleştirildi. İnsan ve fare hücrelerinde mtDNA metilasyonu de düşük düzeyde (% 2-5) tespit edilmiştir. 5 metilsitozin yakalama tarafından kantitatif PCR takip metillenmiş DNA immunoprecipitation (MeDIP) gibi güvenerek deneyleri kullanarak, mtDNA metilasyonu ayrıca çeşitli fare ve insan algılandı ve çizgiler9,10, hücre 11,12. 5-metilsitozin ELISA tahlil veya kütle spektrometresi karşı antikor kullanarak, DNA metilasyonu önemli düzeyde saf mitokondriyal kesirler13,14,15, tespit edildi 16. ancak, yukarıda belirtilen çalışmalar deneyleri tek Bankası çözünürlükte DNA metilasyon mutlak miktar sağlamak için tasarlanmamıştır teknikleri kullanılır.
Nicel ve resolutive DNA metilasyonu Analizi urasil tek iplikçikli DNA bağlam17 bazlar sitozin dönüştürmek için Sodyum bisülfit mülkiyeti yararlanır "bisülfit sıralama", adlı bir teknik elde edilebilir . Bisülfit sıralama kullanarak, bir takımyıldızı yönünde çalışmaların sitozin metilasyonu çeşitli düzeylerde varlığı tespit etti. D-loop bölgesi, 12'leri veya 16S bölge metilasyonu mtDNA kolayca insan18,19,20,21,22,23 ve fare24 ' te algılandı doku ve hücreler, ancak, ilginç bir değişkenliği çalışmalar genelinde toplam cytosines % 1-20'si ile.
Bu çok sayıda çalışmalar ile karşılaştırıldığında sadece birkaç çalışmalar bizim gruptan da dahil olmak üzere, mtDNA metilasyonu3,25,26,27 varlığı tartışmalı veya biyolojik alaka sorguladı mtDNA düzeyleri (% 2) aşağıda28çok az düzeyde. Son zamanlarda, biz bütün mitokondrial bisülfit sıralama3potansiyel bir bisülfit-sıralama artifakı gözlenmesi bildirdi. Biz böylece metilasyonu düzeyleri overestimating mitokondrial DNA'ın ikincil yapısı bisülfit sıralama, yanlış pozitif neden olabilir kanıt sağladı. Biz burada bir obje bisülfit-dönüşüm mtDNA önlemek için bir protokol sağlar. Bu iletişim kuralı bir basit enzimatik sindirim DNA'ın mtDNA ikincil yapılar bozmaya ve bisülfit sıralama protokol sonrası bisülfit tam erişime izin kullanır. Buna ek olarak, biz bisülfit sıralama analizi için bir eşlik eden bioinformatic boru hattı sağlar.

<table><tbody><tr><td>BamHI</td><td>New England BioLabs</td> <td># R0136</td><td></td></tr><tr><td>EZ DNA metilasyon-yıldırım kiti</td><td>Zymo Araştırma</td> <td># D5030 & nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Qubit ssDNA testi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td> <td># Q10212</td><td></td></tr><tr><td>Qubit test tüpleri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td> <td># Q32856</td><td></td></tr><tr><td>HotStarTaq plus DNA polimeraz kiti</td><td>Qiagen</td> <td># 203603&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Jel Ekstraksiyon Kiti</td><td>Qiagen</td> <td># 28704</td><td></td></tr><tr>Illumina <td>New England BioLabs</td> <td>için NEBNext Ultra DNA Kütüphane Kiti</td> <td># E7370S</td><td></td></tr><tr>Illumina <td>New England BioLabs</td> <td>için NEBNext Multipleks Oligolar</td> <td># E7335S</td> AMPure XP Boncukları <td></td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter</td> <td># A63881</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Hassasiyetli DNA çipi</td><td>Agilent</td> <td># 5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Qubit yüksek hassasiyetli dsDNA testi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td> <td># Q33230</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq reaktif kiti v2 300 döngü</td><td>Illumina</td> <td># MS-102-2003</td><td></td></tr><tr><td>PhiX kontrolü v3</td><td>Illumina</td> <td># FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit ve nbsp;</td><td>Sigma</td> <td># S5881</td><td></td></tr><tr><td>Termal döngüleyici C1000</td><td>Biorad</td> <td># 1851148</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Gerçek Zamanlı PCR tespit sistemi</td><td>Biorad & nbsp;</td><td>#1855195</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Florometre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td> <td># Q33226</td><td></td></tr><tr><td>Biyoanalizör 2100</td><td>Agilent</td> <td># G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq cihazı</td><td>Illumina</td> <td># SY-410-1003</td><td></td></tr></tbody></table>

mitokondrial dna metilasyonu doğru algılanması için metodoloji

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Miktar DNA metilasyon kullanan glikozilasyonu sonunda, bir tek iplikçikli DNA bağlamda bazlar sitozin dönüştürmek için Sodyum bisülfit mülkiyeti yararlanır bisülfit sıralama elde edilebilir. Bisülfit sıralama olabilir (PCR kullanarak) hedef veya tüm genom üzerinde gerçekleştirilen ve sitozin metilasyonu tek Bankası çözünürlükte mutlak miktar sağlar. Nükleer ve mitokondrial DNA, farklı doğası özellikle ikincil yapısında göz önüne alındığında, adaptasyonlar bisülfit sıralama yöntemleri için mtDNA sitozin metilasyonu soruşturma yapılması gerekir. MtDNA ikincil ve üçüncül yapısı gerçekten yanlış-mutlak bisülfit tek iplikçikli DNA'için tamamlanmamış denatürasyon zavallı erişim nedeniyle önde gelen eserler sıralama bisülfit yol açabilir. Burada, DNA'ın bir enzimatik sindirim BamHI bioinformatic analiz boru hattı ile birleştiğinde ile doğru miktar sitozin metilasyonu seviyelerinde mtDNA izin vermek için bir iletişim kuralı'nı açıklar. Buna ek olarak, biz yönergeleri bisülfit sıralama astar için mtDNA belirli tasarlamak için istenmeyen nükleer mitokondrial bölümlerini hedeflemek önlemek için (NUMTs) nükleer genom eklenmiş.

Bu protokol iki adımda mtDNA metilasyonu soruşturma zaman önemlidir. 1) 2) mitokondriyal DNA özgü astar tasarım ve ikincil yapı açılmasına.
İnsan genomik DNA Restriksiyon enzimi BamHI (Şekil 1) ile sindirerek, mitokondriyal DNA yapısı nükleotit konumda 14,258 kesilir ve ikincil yapı açılacak.
Bisülfit dönüşüm bir bozulmamış mtDNA ikincil y...

Burada, mitokondriyal DNA (mtDNA) metilasyon doğru miktar bir iletişim kuralını mevcut. Bu protokol için bir enzimatik sindirim DNA BamHI tahmindi mtDNA metilasyon düzeyi mtDNA ikincil yapı tarafından neden önlemek için kullanılan bioinformatic analiz boru hattı ile birleştiğinde ile açıklanmaktadır.

Mitokondrial DNA metilasyonu doğru algılanması için metodoloji

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Bu bisülfit dizileme protokolünün ve biyoinformatik boru hattının genel amacı, mitokondriyal DNA metilasyonunun doğru bir miktar tayinini elde etmektir. Bu yöntem, mitokondriyal DNA metilasyonu insan hastalığını değiştiriyor mu? gibi mitoepigenetik alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, mitokondriyal DNA metilasyonunun doğru bir şekilde ölçülmesine izin vermesidir.Mitokondriyal DNA metilasyonunu araştırırken en önemli adım, sodyum bisülfit ile muameleden önce mitokondriyal DNA'yı BamH1 sindirimi ile doğrusallaştırmaktır. BamH1 restriksiyon enzim bölgesi, insan mitokondriyal genomunun bu haritasında gösterilmektedir. Ayrıca, bisülfit dizilimi ile araştırılacak olan mitokondriyal genomun beş bölgesi de gösterilmiştir.Deplasman döngüsü, tRNA fenilalanin ve 12S ribozom, 16S ribozom, NADH dehidrojenaz 5, sitokrom B mRNA kodlayan gen. Bisülfit dizilimi için primerleri tasarladıktan sonra, metin protokolünde açıklandığı gibi çevrimiçi araçlar kullanılarak, mitokondriyal genoma yönelik primer özgüllüğü BiSearch kullanılarak doğrulanır. Primer dizileri, BiSearch işlevi primer aramasına eklenir.Bisülfit kutusu kontrol edilir ve bir referans genom seçilir. Arama sonuçları, duyu ve antisens zincirlerinde üretilen potansiyel PCR ürünlerini gösterecektir. Bisülfite dönüştürülmüş mitokondriyal genomdan ilgilenilen bölgeleri çoğaltmak için, bir Sıcak başlangıçlı Taq polimeraz kullanarak PCR gerçekleştirin.Primerleri ayrı ayrı kullanıyorsanız, 100 nanogram dönüştürülmüş DNA, 500 mikromolar anlamlı ve antisens primer, bir mikrolitre dNTP karışımı ve polimerazı toplam 50 mikrolitrelik bir hacimde reaksiyon başına 7.5 birimde karıştırın. PCR'yi aşağıdaki koşullarla çalıştırın: 95 santigrat derecede beş dakika, 94 santigrat derecede bir dakika, 55 santigrat derecede bir dakika, 35 döngü için 72 santigrat derecede bir dakika, ardından 72 santigrat derecede 10 dakika. Primerleri çoğullamak için, aşağıdaki döngü koşullarında 200 nanogram dönüştürülmüş DNA kullanın: 95 santigrat derecede beş dakika, 94 santigrat derecede bir dakika, 55 santigrat derecede 1,5 dakika ve 35 döngü için 72 santigrat derecede 1,5 dakika, ardından 72 santigrat derecede 10 dakika.PCR tamamlandığında, 100 voltta %2'lik bir agaroz kullanarak PCR ürünleri üzerinde jel elektroforezi gerçekleştirin. PCR ürünlerinin agaroz jelden ekstraksiyonu, UV maruziyetini ve DNA hasarı riskini en aza indirecek şekilde yapılmalıdır. UV ışığı altında jelin fotoğrafını çekin.Ardından, çok hızlı bir şekilde PCR ürününün etrafını bir neşterle işaretleyin ve UV ışığını kapatın. Ardından, PCR ürününü UV ışığına maruz kalmadan yavaşça kesin. Jel dilimlerini mikrosantrifüj tüplerine yerleştirin ve metin protokolünde açıklandığı gibi jel saflaştırarak PCR ürünlerini saflaştırın.Saflaştırılmış DNA'yı florometri kullanarak nicelleştirin. Numuneleri 20 santigrat derecede saklayın, değilse hemen bisülfit dizileme kitaplığı hazırlığına geçin. 100 nanograma kadar PCR ürünü kullanarak son onarım gerçekleştirerek bisülfit dönüştürülmüş PCR ürünlerinin kütüphane hazırlığına başlayın.Her 0.2 mililitrelik tüpe 55.5 mikrolitre PCR ürünü, üç mikrolitre son hazırlık enzimi ve 6.5 mikrolitre 10X son onarım reaksiyonu tamponu ekleyin. Tüpleri bir termosiklerde 20 santigrat derecede 30 dakika, ardından 65 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, uç onarılmış DNA'yı 15 mikrolitre Blunt / TA ligaz karışımı, 2.5 mikrolitre adaptör ve bir mikrolitre ligasyon arttırıcı ile karıştırarak dizileme adaptörlerini bağlayın.Karışımı bir termocycler'a yerleştirin ve 20 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Termocycler'ı duraklatın ve her tüpe 3 mikrolitre USER enzimi ekleyin. Tüpleri karıştırın ve tekrar termodöngüleyiciye yerleştirin ve 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin.Boyut: katı faz geri dönüşümlü immobilizasyon veya SPRI kullanarak adaptör bağlı DNA'yı seçin. Adaptör bağlı DNA'ya 13.5 mikrolitre su ve 55 mikrolitre yeniden süspanse SPRI boncukları ekleyin. Oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.Tüpleri manyetik bir stand üzerine yerleştirin. Çözelti berraklaştığında, adaptör bağlı DNA'yı içeren süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve boncukları içeren tüpü atın. Süpernatanıma 25 mikrolitre yeniden askıya alınmış SPRI boncuk ekleyin; Karıştırın ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.Tüpleri manyetik standın üzerine yerleştirin ve çözelti berraklaştığında süpernatanı atın. Adaptör bağlı DNA şimdi boncuklara bağlanmıştır. Tüpler manyetik stand üzerindeyken, her tüpe 200 mikrolitre taze hazırlanmış% 80 etanol ekleyin ve boncukları yıkamak için 30 saniye inkübe edin.Süpernatanı çıkarın ve atın. Bu etanol yıkama adımını toplam iki yıkama için tekrarlayın. Etanolü ikinci yıkamadan çıkarın ve tüpleri manyetik stand üzerinde, kapak açık olarak beş dakika boyunca bırakarak boncukları havayla kurutun.Beş dakika sonra, tüpleri manyetik standdan çıkarın, boncuklara 23 mikrolitre DNA elüsyon tamponu ekleyin ve karıştırın. Oda sıcaklığında iki dakika inkübe edin. Çözelti berraklaşana kadar tüpleri manyetik standın üzerine yerleştirin.Ardından, pre-PCR amplifikasyonu için çözeltinin iki mikrolitresini 96 Kuyulu bir PCR plakasına aktarın. Boncuklardan dikkatlice kaçınırken, çözeltinin geri kalanını PCR amplifikasyonu için yeni bir 0.2 mililitrelik tüpe aktarın. Adaptör bağlı DNA'yı amplifiye etmek için gereken döngü sayısını tahmin etmek için RT-qPCR ile ön PCR amplifikasyonu gerçekleştirin.Kullanılan reaksiyon başına aşağıdakilerin bir ana karışımını yapın. 0.4 mikrolitre indeks astarı, 0.4 mikrolitre evrensel PCR astarı, 7.2 mikrolitre su ve 10 mikrolitre RT-qPCR ana karışımı. Ardından, ana karışımı karıştırın ve 96 Kuyulu PCR plakasındaki iki mikrolitre DNA'ya 18 mikrolitre ana karışım ekleyin.Plakayı gerçek zamanlı bir PCR makinesine yerleştirin ve aşağıdaki koşullar altında amplifikasyon gerçekleştirin: 98 santigrat derecede 30 saniye, 98 santigrat derecede 10 saniye ve 20 döngü için 65 santigrat derecede 75 saniye, ardından 65 santigrat derecede beş dakika. Metin protokolünde açıklandığı gibi, her bir numune için gereken amplifikasyon döngülerinin sayısını tahmin ettikten sonra, adaptör bağlı DNA'yı amplifiye edin. Her numune için 21 mikrolitre DNA, 25 mikrolitre PCR ana karışımı, bir mikrolitre indeks astarı, bir mikrolitre evrensel PCR astarı ve iki mikrolitre su karıştırın.Termocycler'da, her bir numuneyi aşağıdaki koşullara tabi tutun: hesaplanan döngü sayısı için 98 santigrat derecede 30 saniye, 98 santigrat derecede 10 saniye ve 65 santigrat derecede 75 saniye, ardından 65 santigrat derecede beş dakika. Daha önce gösterildiği gibi SPRI boncukları kullanarak amplifiye edilmiş DNA'yı saflaştırın ve 22 mikrolitre elüsyon tamponunda elüte edin. Bir Biyoanalizör kullanarak kitaplık kalitesini kontrol edin.Doğru kitaplık tepe boyutlarını arayın. Smear analizi ile kitaplık ürünlerinin ortalama baz çifti boyutunu tahmin edin. Gelişmiş Genel Ayarlar'da, Smear Analizi altında, Tablo'ya çift tıklayın.100 ila 1000 baz çifti arasındaki bölgeyi bulun ve Tamam'a tıklayın. Bölge Tablosu altında, tanımlanan bölge görüntülenir ve kitaplık ortalama boyutu hesaplanır. Kitaplığı florometri ile ölçün. Kitaplığı, yeni nesil dizileme ve hesaplama analizleri için hazır olana kadar 20 santigrat derecede saklayın.Bisülfit dizilemesi ile, mitokondriyal genomun beş farklı bölgesinde insan iskelet kası hücrelerinden sindirilmemiş ve sindirilmiş toplam DNA'da mitokondriyal DNA metilasyonu araştırıldı. Tam bir kare, sitozin guanin dinükleotid bölgelerini temsil eder. Açık kare, sitozin olmayan guanin dinükleotid bölgelerini temsil eder.Sindirilmemiş mitokondriyal DNA için, metilasyon seviyeleri araştırılan tüm bölgelerde% 0-15.1 arasında değişmektedir. Bununla birlikte, DNA bisülfit dönüşümünden önce sindirildiğinde, uyumsuzluk oranı tüm bölgelerde maksimum %1'e düştü. Bu, mitokondriyal DNA metilasyon seviyelerinin aşırı tahmin edilmesini önlemek için bisülfit dönüşümünden önce BamH1 sindiriminin önemini göstermektedir.Bu videoyu izledikten sonra, mitokondriyal bisülfit diziliminin nasıl yapılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız ve biyoinformatik boru hattımızı takip ederek mitokondriyal DNA metilasyonunun doğru bir şekilde ölçülmesini sağlayabilirsiniz.

methodology-for-accurate-detection-of-mitochondrial-dna-methylation

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Bu video metillenmiş DNA immunoprecipitation (MeDIP) için protokol göstermektedir. MeDIP seçici (anti-5 mC) 5-methylcytosine özgüllüğü antikorlar kullanılarak genomik DNA örneği metillenmiş DNA parçaları ayıklar iki günlük bir işlemdir.

Metillenmiş DNA Immunoprecipitation

DNA metilasyon analizi için altın standart bisülfit dönüştürülen DNA genom dizileri. Bu yöntem, asidik koşullar altında deaminasyon bisülfit 5-methylcytosine (5-MEC) ile karşılaştırıldığında sitozin artan duyarlılık yararlanır. Unmethylated cytosines hedef genomik DNA PCR sonra metil cytosines ayırt edilebilir.

DNA Metilasyonu: bisülfit modifikasyonu ve Analiz

Erken yaşam stresinin üzerine DNA metilasyon ve gen ekspresyon değişiklikleri incelemek için bir iş akışı gösterilir. Yeni doğmuş farelerin ve ayrık beyin dokularında izolasyonu anneden ayrılma başlayarak, eş zamanlı olarak izleyen bisülfit sıralama ve RT-PCR analizi için beyin dokusu yumruklar DNA ve RNA izole etmek için bir protokol temsil eder.

Beyin Küçük, Anatomik tanımlı alanları DNA metilasyon ve Gen İfade Optimize Analizi

Bu videoda, DNA örneklerinin bir naylon zar üzerinde lekelenmesi ve ardından monoklonal antikorlar kullanılarak görselleştirme yoluyla insan kondrositlerindeki DNA metilasyon seviyesini in vitro olarak belirlemek için nokta lekeleme tekniği açıklanmaktadır. Bu, kültürün çeşitli aşamalarında kondrositlerin fenotipini belirlemeye yardımcı olur.

DNA metilasyonunun derecesini belirlemek için 5-metilsitozin nokta lekesi

Geliştirilmiş İndirgenmiş Temsil Bisülfit Dizileme, sitozin bisülfit dönüşümü ile birleştirilmiş restriksiyon enzim sindirimine dayalı DNA metilasyon analizi için dizileme kitaplıklarının hazırlanması için bir yöntemdir. Bu protokol 50 ng başlangıç materyali gerektirir ve GC açısından zengin genomik bölgelerde baz çifti çözünürlük verileri verir.

Baz Çifti Çözünürlük DNA metilasyon Değerlendirme Temsil bisülfit sıralamayı İndirimli pekiştirilmiş

Bisülfit amplikon dizilemesi (BSAS), hedeflenen genomik ilgi bölgelerinde sitozin metilasyonunu ölçmek için bir yöntemdir. Bu yöntem, baza özgü bir seviyede DNA metilasyonunun mutlak kantitasyonunu üretmek için yeni nesil dizilemeden önce hedef bölgelerin PCR amplifikasyonu ile eşleştirilmiş bisülfit dönüşümünü kullanır.

DNA Metilasyon Analizi nesil Dizilimine tarafından hedef

DNA metiltransferazlar potansiyel kanser ilaç hedefleridir. Burada, DNA metiltransferaz inhibisyonu için küçük molekülleri değerlendirmek için bir protokol sunulmaktadır. Bu tahlil, DNA metilasyonunu floresan üretimine bağlamak için bir endonükleaz kullanır ve enzim aktivitesinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar.

DNA Metiltransferaz İnhibitörlerini Taramak için Sürekli Floresan Bazlı Endonükleaz Bağlantılı DNA Metilasyon Testi

Burada, tek hücrelerde mutlak mitokondriyal (mt) DNA kopya sayısını ve mtDNA delesyon heteroplazmi seviyelerini ölçmek için bir protokol sunuyoruz.

Dijital Damlacık Polimeraz Zincir Reaksiyonu Kullanarak Tek Hücreli Mitokondriyal DNA Kopya Sayısını ve Heteroplazmiyi Ölçme

Pirosekans testleri, heteroplazmik hücrelerde veya dokularda mitokondriyal DNA tek nükleotid polimorfizmlerinin sağlam ve hızlı genotiplendirilmesini sağlar.

Mitokondriyal Genomdaki Tek Nükleotid Polimorfizmlerinin Pirosequencing ile Genotiplenmesi

mtDNA sentezini ve dağılımını tespit etmek ve ölçmek için çok kuyucuklu bir plaka formatı ve otomatik immünofloresan görüntüleme kullanarak hücrelerdeki mitokondriyal DNA (mtDNA) metabolizmasının dinamiklerini incelemek için bir prosedür açıklanmaktadır. Bu, çeşitli inhibitörlerin, hücresel streslerin ve gen susturmanın mtDNA metabolizması üzerindeki etkilerini araştırmak için de kullanılabilir.

Mitokondriyal DNA Sentezi ve Dağılımının Yüksek Verimli Görüntü Tabanlı Nicelleştirilmesi

Keşfedin mitokondriyal DNA metilasyonunun doğru kantifikasyonu için bisülfit dizileme protokolü ve biyoinformatik analiz yöntemini. Bu teknik, mitoepigenetik alanındaki hastalık ilişkili araştırmalar için güvenilir sonuçlar sağlar.

Mitokondrial DNA metilasyonu doğru algılanması için metodoloji

Daha fazla video keşfet