Name: Bir cam Optrode uyanık farelerde nöronal türüyle Optogenetics tanımlaması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Öğrenin, uyanık farelerde optogenetik tek hücre kaydı yapmayı. Özel cam optrode ile GABAerjik ve glutamaterjik nöronları güvenilir şekilde tanımlayın. Maliyet etkin malzemelerle sinirbilim araştırmalarını ilerletin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar promosyon bilim KAKENHI Grant JP16K11200 ve 17 H 02223 Japonya Derneği ve hibe için araştırma Kanazawa Tıp Üniversitesi S2016-8 ve C2017-3 tarafından desteklenen. Biz Yuhichi Kuda fotoğraf çekmek de verdiği destek için teşekkür ederiz.

Tüm yordamları uygun olarak yol gösterici ilkeler fizyolojik Derneği Japonya ve hayvan bakımı Komitesi, Kanazawa Tıp Üniversitesi onayı ile yapılır.
1. cam Optrode tutucu inşaatı
Not: bir ticari Elektrot tutucu bir cam optrode tutucu oluşturmak için kullanılır (Şekil 1A).
<ol><li>Yavaşça dışarı basınç kontrolü için çelik boru tutucu namlu çekin.</li>
	<li>Sondaj tarafından PIN seat yan varil sahibinin delik genişletmek. 3 mm çapında ve 12 mm delik derinliği içinde yapın.</li>
	<li>Koymak bir paslanmaz çelik boru (3 mm çapında, 0,5 mm kalınlıkta ve 8 mm uzunluğunda; Şekil 1A 2) delik.</li>
	<li>Çiftleşme kol ⌀2.5 mm halkalar (Şekil 1A1) için deliğe bölünmüş bir seramik yerleştirin.</li>
	<li>L şeklindeki rabbet elektrot sahibine varil Epoksi Yapıştırıcı ile düzeltmek.</li>
	<li>Delik (3 mm çapında) rabbet içinde yapmak ve bunu bir manipülatör vida ile ekleyin.</li>
</ol>2. baş yükleme sonrası
<ol><li>Bir devre kartı spacer yapılan özel olarak oluşturulmuş bir baş yazı hazırlamak. Tek sıra halinde devre kartı spacer bir freze kesici ile tetrahedron bir şekle yapmak ve 2 baş yazı olarak (Şekil 1B) testereyle kesti. Freze kesici ile baş yazının altında düzleştirin.</li>
	<li>Hangi çalışma belirli neuron türünün bir ışığa duyarlı opsin ifade edilir transgenik hayvan hazırlayın. Bu çalışmada, inhibitör nöronlar channelrhodopsin-2 (ChR2)11 hızlı transgenik fare (VGAT-ChR2 fareler) kullanılır.</li>
	<li>0.3 mg/kg medetomidine, 4,0 mg/kg midazolam ve 5.0 mg/kg butorphanol karışımı ile hayvan mayi yönetim tarafından anestezi. Hayvan tam anestezi doğrulamak için sınama gerçekleştirme pinching kuyruk için kendi reaksiyonlar.</li>
	<li>Stereotaksik çerçevesindeki bir Isıtma yastık üzerinde fareyi getirin. Temiz stereotaksik çerçeve ve Isıtma peşin % 70 alkol ile pad. Dişleri lokma çubuğu deliğe yerleştirin ve hafifçe sıkın burun kıskacı. Kulak çubuklarını kullanma baş her iki tarafı düzeltmek. Başından doğru kulak çubuklarıyla düzeltildiğinde, burun kıskacı sıkın. Bir oftalmik merhem gözler için geçerlidir.</li>
	<li>Baş cilt küçük makasla tıraş ve KLORHEKSİDİN GLUKONAT bir pamuklu çubukla ile kafa derisi temiz. Ameliyattan önce tüm cerrahi aletler ve bir kafa ile bir Otoklav (121 ° C, 15 dk) sonrası sterilize.</li>
	<li>Orta çizgi boyunca kafa derisi makasla kesme ve bir kenara itmek. Kafasının arkasından kesi gözlere (yaklaşık 20 mm) olun. % 70 alkol batırılmış pamuk bez ile kapaklarini kaldırmak ve kafatası kuru.</li>
	<li>Baş yazı için manipülatör iliştirin. Baş yazı düz manipülatör kullanarak bregma çevresinde kafatası getirin.</li>
	<li>Monomer (4 damla), katalizör (1 damla) ve polimer (1 küçük kaşık) buzdolabında soğutulmuş önceden küçük bir çanak üzerinde diş çimento karıştırın. Alın ve kafatası baş mesaja düzeltmek için kafatası kemiğindeki diş çimento (1 g) aşağıda koymak.</li>
	<li>Diş çimento sabit olduktan sonra fare stereotaksik çerçevesinden kaldırın. Antibiyotikli bir krem maruz kalan ciltte koymak. Medetomidine antagonisti (0.3 mg/kg) ve antibiyotik (oksitetrasikline; 20 mg/kg) enjekte et. Yer ve o uyanır kadar fareyi ısı panelindeki bir kafeste izlemek ve konut kafese geri.</li>
	<li>Evin bazı zenginleştirme cihazı ile bir bireysel konut kafesteki hayvan. Her gün o kafesi temiz tutun ve enfeksiyonu önlemek yatak takımları hayvan kağıt değiştirin. Hayvan rahatsızlık belirtisi gösterir olup olmadığını dikkatli bir şekilde izlemektedir. Herhangi bir ağrı şüphesi varsa lidokain yaraya uygulayın. Yönetici Meloksikam veya carprofen bir kez her 24 h 48 saat sonra her iki kafa yükleme ve kranyotomi ameliyatları sonrası için. NSAİİ yeterli değilse yerel lidokain Ayrıca verilebilir.
</li>
</ol>3. calıştıkları
<ol><li>Anestezi, kurtarma sonra (en az) iki gün hayvan kayıt odası kafası sabit durumda alışmana. Calıştıkları oturumları en az 5 gün için gerçekleştirin.</li>
	<li>Calıştıkları oturumları sırasında hayvan için özel olarak oluşturulmuş bir kelepçe sabit baş yazı ile kayıt odasında yerleştirin. Hareketi, sınırlamak için oturum sırasında kapak bir ısmarlama reçine yarım tüp (Şekil 1 c), cesetle yapılan bir 3D printerlere harcama maddeler kullanarak. Not: 1 gün, 5 min uzun calıştıkları oturum olmalıdır. Bu daha sonra günlük 10, 20, 40 ve 60 dk gün için 2, 3, 4 ve 5, sırasıyla arttırılır.</li>
	<li>Her oturumun sonunda hayvan yiyecek ödül vermek. Sürekli calıştıkları sırasında hayvan mücadele Eğer kesin.</li>
</ol>4. kranyotomi
Not: kayıt için beyin bölgesi üzerinde bir kranyotomi calıştıkları sonra yapılır. Kranyotomi stereotaksik çerçeve ile baş yükleme sonrası gibi anestezi altında gerçekleştirilir. Baş yükleme sonrası sonrası işlemi yordamı aynıdır.
<ol><li>Kranyotomi önce kafatası KLORHEKSİDİN GLUKONAT ve % 70 alkol ile bir pamuk bez ile temizleyin.</li>
	<li>Dikkatle kafatası kayıt sitesi üzerinden bir diş matkapla kazı. Kemik yeterince ince olduğunda, bistüri ucu ile kes ve çıkarın.</li>
	<li>Diş çimento kafatası güçlendirmek için maruz kalan bölgenin çevresinde koymak.</li>
	<li>Diş çimento sabit olduktan sonra silikon yapıştırıcı ile maruz beyin alanı kapsamaktadır. Ameliyat sonrası 2.8 adımda anlatıldığı gibi bir yöntemdir.</li>
</ol>5. elektrofizyolojik kayıt
<ol><li>Yeniden elde etmek için en az 1 gün sonra elektrofizyolojik kayıt işlemini gerçekleştirmeden önce kranyotomi hayvan izin. Hayvan kayıt odasında ne zaman kayıt başlar calıştıkları oturumları sırasında yapıldığı aynı şekilde yerleştirin.</li>
	<li>Cam pipetler borosilikat cam kılcal üzerinden yapmak (OD = 1,5 mm, kimliği = 0.9 mm, 90.0 mm uzun) bir elektrot çektirme çekti. Onların uç çapı 2-3 µm olduğunu ve 10 mM ile PBS doldurduysanız kendi direnci 4-6 MΩ. 40-50 mm elektrot uzunluğudur. Bazı kayıtları % 2 neurobiotin 10 mM PBS eklenir.</li>
	<li>Doldurulmuş Cam Pipet ısmarlama optrode sahibine iliştirin.</li>
	<li>Ag-Cl kaplı gümüş tel (0.2 mm çapında) Cam Pipet koymak. Gümüş tel bir PIN ile için ince bir kaplama elektrikli tel bağlamak. PIN kodu kayıt amplifikatör headstage için bağlayın.</li>
	<li>Fiber optik patch kablosunu bağlayın (çekirdek = 960 µm, kaplama 1000 µm, NA = 0.63 =) zirkon yüksük ile (OD = 2.5 mm) optrode tutucu kol çiftleşme split için. Yüksük ucu Cam Pipet arkası kişiler kadar yama kablosu kol itin. Yama kablosu ışık sunar (dalga boyu 465 = nm) LED üzerinden. LED ışık tek kanallı LED sürücü tarafından kontrol edilir.</li>
	<li>Silikon yapıştırıcı kranyotomi kaldırın. Koymak ısıtılmış salin (38 ° C) düzenli olarak beyin yüzeyine kayıt oturumu sırasında kurumasını önlemek için beyin yüzeyinde. Gerekirse, beyin zarı keskin cımbızla kaldırın.</li>
	<li>Cam elektrot bir manipülatör ile beyin dokusu içine yerleştirin. Bu takıldığında elektrot direnç izlemek. Direniş elektrot ucunu hasar olabilir çünkü beklenenden daha düşük olduğunda elektrot değiştirin. Faiz derinlikte arama ve 2-5 µm adımları derinlemesine ayarlayarak tek birim sivri yalıtır.</li>
	<li>Tek birim izole duruma geldikten sonra LED ışık teslim ve ışık uyaranlara yanıt gözlemlemek.</li>
	<li>Sinirsel faaliyetleri hücre tipleri kimlik sonra kayıt. Kayıtları 2-3 h için gerçekleştirin. Kayıt (en fazla 2 gün) birbirini izleyen günlerde yapılırsa, silikon yapıştırıcı ile kranyotomi kapsar. Ne zaman kayıt tamamlandıktan ve hayvan kurban, baş yazı almak ve aseton yıkamak ve bunu yeniden koydu.</li>
</ol>

<ol><li>Rajasethupathy, P., Ferenczi, E., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeting neural circuits.</a> Cell. 165 (3), 524-534 (2016).</li>
<li>Gore, F., Schwartz, E. C., Salzman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+neural+activity+in+physiologically+classified+neurons%3A+triumphs+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Manipulating neural activity in physiologically classified neurons: triumphs and challenges.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370 (1677), 20140216(2015).</li>
<li>Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identified+GABAergic+and+glutamatergic+neurons+in+the+mouse+inferior+colliculus+share+similar+response+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identified GABAergic and glutamatergic neurons in the mouse inferior colliculus share similar response properties.</a> Journal of Neuroscience. 37 (37), 8952-8964 (2017).</li>
<li>Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+sound-evoked+afterdischarge+in+the+auditory+midbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-lasting sound-evoked afterdischarge in the auditory midbrain.</a> Scientific Reports. 6, 20757(2016).</li>
<li>Munoz, W., Tremblay, R., Rudy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-assisted+patching%3A+in+vivo+recording+of+genetically+and+morphologically+identified+neurons+throughout+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-assisted patching: in vivo recording of genetically and morphologically identified neurons throughout the brain.</a> Cell Reports. 9 (6), 2304-2316 (2014).</li>
<li>Lima, S. Q., Hromadka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINP%3A+a+new+method+of+tagging+neuronal+populations+for+identification+during+in+vivo+electrophysiological+recording%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">PINP: a new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording.</a> PLoS One. 4 (7), e6099(2009).</li>
<li>Kuwada, S., Batra, R., Stanford, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monaural+and+binaural+response+properties+of+neurons+in+the+inferior+colliculus+of+the+rabbit%3A+effects+of+sodium+pentobarbital%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Monaural and binaural response properties of neurons in the inferior colliculus of the rabbit: effects of sodium pentobarbital.</a> Journal of Neurophysiology. 61 (2), 269-282 (1989).</li>
<li>Populin, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthetics+change+the+excitation%2Finhibition+balance+that+governs+sensory+processing+in+the+cat+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Anesthetics change the excitation/inhibition balance that governs sensory processing in the cat superior colliculus.</a> Journal of Neuroscience. 25 (25), 5903-5914 (2005).</li>
<li>Duque, D., Malmierca, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus-specific+adaptation+in+the+inferior+colliculus+of+the+mouse%3A+anesthesia+and+spontaneous+activity+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Structure+and+Function%22%5BJournal%5D)">Stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the mouse: anesthesia and spontaneous activity effects.</a> Brain Structure and Function. 220 (6), 3385-3398 (2015).</li>
<li>Cai, R., Richardson, B. D., Caspary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+to+predictable+versus+random+temporally+complex+stimuli+from+single+units+in+auditory+thalamus%3A+impact+of+aging+and+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Responses to predictable versus random temporally complex stimuli from single units in auditory thalamus: impact of aging and anesthesia.</a> Journal of Neuroscience. 36 (41), 10696-10706 (2016).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nature Methods. 8 (9), 745-752 (2011).</li>
<li>Ito, T., Bishop, D. C., Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+classes+of+GABAergic+neurons+in+the+inferior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Two classes of GABAergic neurons in the inferior colliculus.</a> Journal of Neuroscience. 29 (44), 13860-13869 (2009).</li>
<li>Ono, M., Yanagawa, Y., Koyano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+neurons+in+inferior+colliculus+of+the+GAD67-GFP+knock-in+mouse%3A+electrophysiological+and+morphological+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">GABAergic neurons in inferior colliculus of the GAD67-GFP knock-in mouse: electrophysiological and morphological properties.</a> Neuroscience Research. 51 (4), 475-492 (2005).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+using+Thy1-GCaMP+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity using Thy1-GCaMP transgenic mice.</a> Neuron. 76 (2), 297-308 (2012).</li>
<li>Hirai, Y., Nishino, E., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+recording+of+fluorescence+and+electrical+signals+by+photometric+patch+electrode+in+deep+brain+regions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous recording of fluorescence and electrical signals by photometric patch electrode in deep brain regions in vivo.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (10), 3930-3942 (2015).</li>
<li>LeChasseur, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microprobe+for+parallel+optical+and+electrical+recordings+from+single+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A microprobe for parallel optical and electrical recordings from single neurons in vivo.</a> Nature Methods. 8 (4), 319-325 (2011).</li>
<li>Abaya, T. V., Blair, S., Tathireddy, P., Rieth, L., Solzbacher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+glass+optrode+array+for+optical+neural+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">A 3D glass optrode array for optical neural stimulation.</a> Biomedical Optics Express. 3 (12), 3087-3104 (2012).</li>
<li>Bittner, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjunctive+input+processing+drives+feature+selectivity+in+hippocampal+CA1+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Conjunctive input processing drives feature selectivity in hippocampal CA1 neurons.</a> Nature Neuroscience. 18 (8), 1133-1142 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Optogenetics nörolojik güçlü bir araç haline gelmiştir. Belirli nöron tipleri vivo içinde belirlenmesi için hem de belirli nöronal yolları faaliyetlerinin manipüle kullanılmıştır. Nöronal farklı sinirsel faaliyetleri açıklama sinir devreleri mekanizmasının anlayış teşvik etmektedir. Burada, kayıt site üzerinden bir cam elektrot içinde IC uyanık VGAT-ChR2 farelerin ışık sunmak için bir yöntem gösterdi.
Açıklanan yöntemi çeşitli kritik adımlar vardır. İlk olarak, hayvanlar opsins hedef ...

Merkezi sinir sistemi farklı işlevlere sahiptir nöronlar çeşitli oluşur. Nöronların farklı bu tür sinir devresi içinde nasıl nörolojik önemli sorunlardan biridir. Ancak, birçok beyin bölgelerde elektrik spike sinyal kendisi, hiçbir açık fark bazı istisnalar dışında olduğundan elektrik faaliyetleri nöronal türlü vivo kayıtları ayırt etmek mümkün olmuştur. Optogenetics son gelişmeler bir atılım1,2yaptık. Transjenik hayvanlar ışığa duyarlı opsin (Örneğin, channelrhodopsin-2) belirli nöronal türlerinde ifade kullanarak, vivo kayıtları3, nöronal türlerinde verimli bir şekilde ayırt etmek mümkün oldu 4,5,6. Bu hayvanlarda nöronlar ile ışığa duyarlı opsin elektrik kayıtları sırasında ışık uyaranlara vererek heyecanlı mısın, ancak diğer neurons değildir. Opsin-pozitif sinir hücreleri, bu nedenle, kolayca diğer nöron türlerinden ışık yanıtlarını tarafından ayırt edilirler.
Optogenetics deneylerde kayıt siteye ışık sağlamak için önemlidir. Non-invaziv bir yöntem olarak ışık beynin yüzeyden kez yönlendirilir. Beyin doku ile gider olarak ışık gücü azaltır, ancak, bu derin beyin bölgeleri beynin yüzeyinden uyarmak zor çünkü. Özellikle, stimülasyon ışık kez kayıtları uyanık hayvan modelinde olduğu gibi beyin yüzey optik saydamlığını, azaldığında derin beyin bölgeleri ulaşmak için zordur. Vücut hareketleri kayıtları gürültü nedeniyle elektrofizyolojik deneyler kez imzalat hayvanlar üzerinde gerçekleştirilmiş. Ancak, iyi belgelenmiş gibi anestezi nöral yanıt-e doğru7,8,9,10değiştirmek bilinmektedir. Böylece, nöral yanıt anestezi yapay etkileri olmadan çalışması için uyanık hayvanlar kullanmak gereklidir. İmzalat hayvanlar ile deneyler, elektrofizyolojik kayıtlar uyanık hayvanlar ile deneyler ameliyatta kurtarma sonra gerçekleştirilir. Ameliyat ve kayıtları arasındaki aralığı sırasında doku çıktı kez beyin yüzeyinde biriken ve beyin yüzey optik saydamlığını düşük yapar.
Burada, bir ısmarlama cam optrode kullanarak uyanık bir fare tek-unit kayıtları kaydetmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Böylece güvenilir bir şekilde ışık derin beyin bölgeleri ile kaydedilen nöron uyarmak mümkündür Bu yöntemde, kayıt cam elektrot ışık teslim edilir. Bu özel yapım optrode sistem erişilebilir ve ucuz malzemelerden oluşur ve montajı kolaydır.

<table><tbody><tr><td>Elektrot tutucu</td><td>Moleküler Cihaz</td><td>Mikroelektrot amplifikatörü için</td><td>1-HL-U</td> pipet tutucu</tr><tr><td>Seramik bölünmüş çiftleşme manşonu</td><td>Thorlabs</td><td>ADAF1</td><td>f2.5 mm yüksük</td></tr><tr><td>Devre kartı ara parçası</td><td>Teishin Denki</td><td>SPA-320</td><td>f8.0 mm, 20.0 mm uzunluğunda</td></tr><tr><td>Fareler için stereotaksik çerçeve</td><td>Narishige</td><td>SR-6M-HT</td><td>Fareler</td></tr> <tr><td>için stereotaksik aletlerManipülatör</td><td>Narishige</td><td>NA</td><td>Manuel manipülatör</td></tr><tr><td>Superbond Sun</td><td>Medical</td><td>M: 204610557</td><td>Diş yapıştırıcı reçine çimentosu</td></tr><tr><td>Form2</td><td>Formlabs</td><td>NA</td><td>3D yazıcı</td></tr><tr><td>Kwik-Sil</td><td>WPI</td><td>KWIK-SIL</td><td>Düşük toksisiteli silikon yapıştırıcı</td></tr><tr><td>Borosilikat cam kılcal damarlar</td><td>Narishige</td><td>GD-1.5</td><td>OD 1,5 mm, ID 0,9 mm, 90,0 mm uzunluk</td></tr><tr><td>Fiber optik yama kablosu</td><td>Dor Lensler</td><td>MFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5</td><td>Monofiberoptik patchcord, OD, 2,5 mm, çekirdek = 960 mm, kaplama = 1000 mm, NA = 0,63</td></tr><tr><td>Bağlantılı LED</td><td>Dorik Lensler</td><td>LEDC-1B_FC</td><td>Merkezi dalga boyu = 465 nm, çıkış gücü = 45 mW (Çekirdek 960 mm 0,63 NA )</td></tr><tr><td>LED sürücü</td><td>Doric Lensler</td><td>LEDRV_1CH_1000</td><td>1 kanal LED sürücü, maksimum çıkış = 1000 mA</td></tr><tr><td>Elektrot çektirme</td><td>Narishige</td><td>PB-7</td><td>Çift kademeli cam mikropipet çektirme</td></tr><tr><td>Borosilikat cam kılcal</td><td>Narishige</td><td>GD-1.5</td><td>Bolosilikat cam kılcal, OD, 1.5mm, ID, 0.9 mm, 90.0 mm uzunluğunda</td></tr><tr><td>GENTACIN</td><td>MSD CO., Ltd</td><td>185711173</td><td>Antibiyotik merhem</td></tr><tr><td>Terramisin reg; -LA</td><td>Zoetis</td><td>G 333</td><td>Oksitetrasiklin</td></tr><tr><td>Tg (Slc32a1- COP4 * H134R / EYFP) 8Gfng / J</td><td>Jackson Labs</td> <td># 14548</td><td>VGAT-ChR2 fareler</td></tr><tr><td>Multiclamp 700B</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>2500-0157</td><td>Mikroelektrot amplifikatörü</td></tr></tbody></table>

bir cam optrode uyanık farelerde nöronal türüyle optogenetics tanımlaması

Optogenetics Identification of a Neuronal Type with a Glass Optrode in Awake Mice

Ne kadar farklı nörolojik büyük bir sorundur neurons tür sinir devrelerinde çalışmak. Optogenetics son gelişmeler içinde vivo elektrofizyolojik deneylerde geniş beyin bölgelerinde nöronal tipinin tanımlanması etkinleştirdiniz. Optogenetics deneylerde kayıt siteye ışık sağlamak için önemlidir. Ancak, bu kez stimülasyon ışık derin beyin bölgeleri beynin yüzeyden teslim etmek zordur. Özellikle, stimülasyon ışık kez kayıtları uyanık hayvan modelinde olduğu gibi beyin yüzey optik saydamlığını, azaldığında derin beyin bölgeleri ulaşmak için zordur. Burada, spike yanıt-e doğru ışık uyanık bir fareden özel yapım cam optrode kullanarak kaydetmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Böylece güvenilir bir şekilde ışık derin beyin bölgeleri ile kaydedilen nöron uyarmak mümkündür Bu yöntemde, kayıt cam elektrot ışık teslim edilir. Bu özel yapım optrode sistem erişilebilir ve ucuz malzemelerden oluşur ve montajı kolaydır.

Şekil 2' de, ışık gücü (Şekil 2A-B) pipetler ucundaki Cam pipetler uzunluğu ve ucu boyutunu etkileri incelenmiştir. Işık güç uzak ucu 1 mm yerleştirilen bir optik güç ölçer tarafından ölçüldü. Ucu boyutunu farklı ucu boyutunu tam uzunlukta çeşitli 2.5 µm için kurulmuştur iken tam uzunlukta 50 ± 2 mm için kurulmuştur. Cam Pipet şaft için 8 mm kuruldu. 3-5 mW (ortalama ± SD; değişiyordu ucundaki ışık güç <strong cl...

Bu eser bir optogenetic tek-unit güvenilir özel yapım cam optrode kullanarak uyanık bir fareden kayıt gerçekleştirmek için bir yöntem sunar.

Bir cam Optrode uyanık farelerde nöronal türüyle Optogenetics tanımlaması

It is a major concern in neuroscience how different types of neurons work in neural circuits. Recent advances in optogenetics have enabled the ...

Bu yöntem, farklı nöron türlerinin işlevleri gibi sinirbilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, farklı nöron tiplerini in vivo olarak ucuz ve erişilebilir malzemelerle güvenilir bir şekilde tanımlamayı mümkün kılmasıdır. Prosedürü teknisyenimiz Shinji Muramoto ve laboratuvarımızdan yardımcı doçentimiz Lanlan Ma ile birlikte göstereceğim.Bu prosedüre başlamak için, basınç kontrolü için çelik boruyu tutucunun namlusundan yavaşça dışarı çekin. Delme işlemi ile tutucunun namlusundaki pim yuvası tarafının deliğini genişletin. Ardından deliğe paslanmaz çelik bir boru yerleştirin.Ardından, deliğe 2,5 milimetre çapında yüksük için seramik bir bölünmüş eşleşme manşonu yerleştirin. L şeklinde bir tavşanda bir delik açın ve elektrot tutucunun namlusunu epoksi yapıştırıcı ile tavşana tutturun. Daha sonra, vidalarla bir manipülatöre takın.Sütunlu devre kartı ara parçasını bir freze bıçağı ile küboidal bir şekle getirerek özel yapım bir kafa direği hazırlayın ve bir testere ile iki kafa direğine kesin. Ardından, baş direğinin altını bir freze bıçağı ile düzleştirin. Ameliyattan önce tüm cerrahi aletleri ve baş direğini bir otoklav ile sterilize edin.Stereotaksik çerçeveyi ve ısıtma yastığını yüzde 70 alkolle temizleyin. Ardından, fareyi uyuşturun ve bir ısıtma yastığı üzerindeki stereotaksik çerçeveye yerleştirin. Bu deneyde, channelrhodopsin-II'yi eksprese eden inhibitör nöronların kullanıldığı transgenik bir fare kullanılmıştır.Dişleri ısırma çubuğunun deliğine yerleştirin ve burun kelepçesini hafifçe sıkın. Ardından, kulak çubukları kullanarak başın her iki tarafını da sabitleyin. Kafa kulak çubukları tarafından doğru şekilde sabitlendiğinde, burun kelepçesini sıkın.Gözlere oftalmik bir merhem sürün. Saçı küçük bir makasla başın üzerinden kesin ve kafa derisini bir pamuklu çubukla klorheksidin glukonat ile temizleyin. Ardından, kafa derisini orta hat boyunca kesin ve bir kenara itin.Periosteumu yüzde 70 alkole batırılmış bir pamuklu çubukla çıkarın ve kafatasının kurumasını bekleyin. Ardından, baş direğini manipülatöre takın. Manipülatörü kullanarak baş direğini bregma etrafındaki kafatası üzerine düz bir şekilde yerleştirin.Buzdolabında soğutulmuş küçük bir tabakta dört damla monomer, bir damla katalizör ve bir küçük kaşık polimeri karıştırın. Frontal ve parietal kemiğe diş çimentosu uygulayın ve baş direğini kafatasına sabitleyin. Diş çimentosu sertleştikten sonra, fareyi stereotaksik çerçeveden çıkarın.Maruz kalan cilde bir antibiyotik merhem sürün ve bir medetomidin antagonisti ve antibiyotik kokteyli enjekte edin. Ardından, fareyi uyanana kadar bir kafes içindeki ısı yastığının üzerine yerleştirin ve zenginleştirilmiş bir muhafaza kafesine geri koyun. Kayıt için hedef beyin bölgesi üzerinde kraniyotomi yapmak için, kafatasını klorheksidin glukonat ve yüzde 70 alkol ile ıslatılmış bir pamuklu çubukla temizleyin.Kafatasını bir diş matkabı ile kayıt alanı üzerinde dikkatlice kazıyın. Kemik yeterince ince olduğunda, neşterin ucuyla kesin ve çıkarın. Daha sonra kafatasını güçlendirmek için açıkta kalan bölgenin etrafına diş çimentosu uygulayın.Diş çimentosu sertleştikten sonra açıkta kalan beyin bölgesini silikon yapıştırıcı ile örtün. Ardından, hayvanı uyanana kadar bir kafeste ısı yastığının üzerine yerleştirin ve bir muhafaza kafesine geri koyun. Elektrofizyolojik kaydı gerçekleştirmeden önce hayvanın kraniyotomiden sonra en az bir gün iyileşmesine izin verin.Elektrofizyolojik kaydı gerçekleştirmeden önce, bir elektrot çektirmesi kullanarak borosilikat cam kılcal damarlardan bazı cam pipetler yapın. Pipetleri 10 milimolar PBS ile doldurun. Bazı kayıtlarda, 10 milimolar PBS'ye yüzde iki nörobiyotin eklenir.Ardından, hayvanı kayıt odasına yerleştirin. Özel yapım optrode tutucuya doldurulmuş bir cam pipet takın. Cam pipete gümüş klorür kaplı bir tel yerleştirin.Daha sonra, pimi kayıt amplifikatörünün baş aşamasına bağlayın. Daha sonra, fiber optik yama kablosunu bir zirkonya yüksük ile optrode tutucusundaki bölünmüş eşleşme manşonuna bağlayın. Yüksüğün ucu cam pipetin arkasına temas edene kadar yama kablosunu manşonun içine itin.Yama kablosu, ışığı tek kanallı bir LED sürücü tarafından kontrol edilen LED'den sağlar. Daha sonra, kraniyotomi üzerindeki silikon yapıştırıcıyı çıkarın. Kayıt seansı sırasında beyin yüzeyinin kurumasını önlemek için beyin yüzeyine periyodik olarak ılık tuzlu su uygulayın.Gerekirse, durayı keskin cımbızla çıkarın. Burada, spike yanıtları, uyanık VGAT channelrhodopsin-II farelerinin inferior colliculus'unda kaydedildi. VGAT channelrhodopsin-II farelerinin inferior colliculusunda, GABAerjik nöronlar spesifik olarak channelrhodopsin-II'yi eksprese eder.Uyanık farelerde, hem GABAerjik hem de glutamaterjik nöronlar, ışık uyaranları verildiğinde sırasıyla uyarıldı veya bastırıldı. Işık uyarısı cam elektrottan geçtiğinde, bazı nöronlarda ani tepkiler uyandırdı. Buna karşılık, diğer nöronlarda, ışık uyaranları, ses uyaranları tarafından uyandırılan ani tepkileri bastırdı.Bu sonuçlar, bir cam optrode'un iyi izole edilmiş tek birim aktivitesini kaydedebildiğini ve kaydedilen nöronları ışıkla güvenilir bir şekilde uyarabildiğini göstermektedir. Geliştirmeden sonra, bu teknik, sinirbilim alanındaki araştırmacıların, çeşitli beyin bölgelerinin nöral soketinde farklı nöron türlerinin nasıl çalıştığını keşfetmelerinin yolunu açtı.

optogenetics-identification-neuronal-type-with-glass-optrode-awake

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu makale, tek tek hücrelerin sağlam fare retinada floresan etiketli nöron popülasyonları kayıt gösteriyor. Iki foton kızılötesi uyarma kullanarak transgenetically etiketli hücreleri ışık tepkileri, açık alan özellikleri, ve morfoloji çalışması için patch-klemp kayıt için hedef alındı.

Bozulmamış Retina Elektrofizyolojik Karakterizasyonu GFP-ifade eden hücre popülasyonlarının

Kaynak: Kodani, S., et.al. Farelerde Uyku / Uyanıklık Durumlarının İzlenmesi Sırasında Nöral Devrelerin Optogenetik Manipülasyonu. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, farelerde uykudan uyanıklığa geçişte yer alan nöral devrelerin optogenetik manipülasyonunu göstermektedir. Prosedür, ışık stimülasyonunu ve elektrofizyolojik kaydı mümkün kılmak için beyne ve kaslara bir optik fiber ve elektrotların cerrahi olarak implante edilmesini içerir. Stria terminalisin (BNST) yatak çekirdeğindeki ışığa duyarlı...

Farelerde Uykudan Uutanlığa Geçiş için Nöral Devrelerin Optogenetik Manipülasyonu

Bu video, transgenik farelerde optik bir pencereden beynin nöral aktivite kaydını göstermektedir. Fareler, sinirsel aktivitelerin tespit edilmesini sağlayan bir floresan proteini eksprese eder. Kafatasının küçük bir kısmı, optik bir pencere takmak için dikkatlice çıkarılır ve daha sonra görüntülemeden önce ışığı engellemek için kafatası siyah çimento ile kaplanır.

Görüntü Sinirsel Aktivitelerine Transgenik Farelerin Beynine Optik Pencerelerin Yerleştirilmesi

Kaynak: Laboissonniere, et. al. Retinal Ganglion Hücrelerinin Tanımlanmış Alt Kümelerinin Tek Hücreli RNA-Seq'i. J. Vis. Uzm.  (2017).  Bu video, transgenik bir fare retinasındaki retinal ganglion hücresi (RGC) alt tiplerini tanımlamak için bir floresan izleme tekniğini göstermektedir. İşlem, izole retinanın bir kayıt odasında sabitlenmesini, oksijenli perfüzyon ile hücre canlılığının korunmasını ve izleyicili bir pipet kullanılarak floresan olarak etiketlenmiş RGC'lerin hedeflenmesini içerir.

Fare Retinal Ganglion Hücre Alt Tiplerinin Floresan İzleme ile Tanımlanması

Nöronal popülasyonları in vitro olarak fotostimül etmek için optogenetik bir yaklaşım kullanarak ön beyin devrelerinin fonksiyonel topografyasını ve sinaptik özelliklerini karakterize etmek için bir yöntem açıklıyoruz.

Optogenetically Hedeflenen Önbeyin Devreler Lazer tarama photostimulation

Optogenetik, davranışsal sinirbilim deneylerinde kullanım için güçlü bir araç haline geldi. Bu protokol, lazer sistemlerinin tasarımı ve kurulumu için adım adım bir kılavuz sunar ve çoğu kemirgen davranışsal test paradigmasıyla uyumlu çoklu ve eşzamanlı in vivo optogenetik stimülasyonların gerçekleştirilmesi için tam bir protokol sağlar.

Kemirgen Santral Sinir Sistemi vivo optogenetic Stimülasyon içinde

Burada, anestezi uygulanmış fare korteksindeki tanımlanmış inhibitör internöronlardan kararlı, iyi izole edilmiş tek birimli kayıtlar elde etme stratejimizi açıklıyoruz. ChR2 eksprese eden nöronlar, mavi ışığa verdikleri tepkilerle tanımlanır. Yöntem, standart hücre dışı kayıt ekipmanı kullanır ve kalsiyum görüntülemeye veya görsel olarak yönlendirilen yamaya ucuz bir alternatif olarak hizmet eder.

A Guide In vivo Tek birim Kayıt

Burada, biz farelerde uyku/uyanıklık devletlerin izlenmesi sırasında nöronların belirli türlerinin optogenetik manipülasyon yöntemlerini açıklamak, bir örnek olarak stria terminalis yatak çekirdeği üzerinde son çalışma sunma.

Farelerde uyku/uyanıklık durumları Izleme sırasında nöral devrelerin optogenetik manipülasyon

Belirli nöronal popülasyonların veya beyin bölgelerinin optogenetik manipülasyonu ile, davranış serbestçe hareket eden hayvanlarda yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile değiştirilebilir. Kronik implante optik lifler ile birlikte farklı optogenetik araçlar kullanılarak, nöronal modülasyonlar ve davranışsal testler çeşitli yapılabilir.

SerbestÇe Hareket Eden Farelerde Davranışı Modüle Etmek Için Nöronal Aktivitenin Optogenetik Manipülasyonu

Burada, ışık iletimi için optik fiberlere ve nöral kayıt için bir elektrot dizisine sahip bir optrode sisteminin üretim yöntemini sunuyoruz. Channelrhodopsin-2'yi eksprese eden transgenik farelerle yapılan in vivo deneyler, eşzamanlı optogenetik stimülasyon ve elektrofizyolojik kayıt için sistemin fizibilitesini göstermektedir.

Eşzamanlı Optogenetik Modülasyon ve Elektriksel Nöral Kayıt için Optrode Dizisi

Öğrenin, uyanık farelerde optogenetik tek hücre kaydı yapmayı. Özel cam optrode ile GABAerjik ve glutamaterjik nöronları güvenilir şekilde tanımlayın. Maliyet etkin malzemelerle sinirbilim araştırmalarını ilerletin.

Bir cam Optrode uyanık farelerde nöronal türüyle Optogenetics tanımlaması

Daha fazla video keşfet