Bir cam Optrode uyanık farelerde nöronal türüyle Optogenetics tanımlaması

Bu yöntem, farklı nöron türlerinin işlevleri gibi sinirbilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, farklı nöron tiplerini in vivo olarak ucuz ve erişilebilir malzemelerle güvenilir bir şekilde tanımlamayı mümkün kılmasıdır. Prosedürü teknisyenimiz Shinji Muramoto ve laboratuvarımızdan yardımcı doçentimiz Lanlan Ma ile birlikte göstereceğim.

Bu prosedüre başlamak için, basınç kontrolü için çelik boruyu tutucunun namlusundan yavaşça dışarı çekin. Delme işlemi ile tutucunun namlusundaki pim yuvası tarafının deliğini genişletin. Ardından deliğe paslanmaz çelik bir boru yerleştirin.

Ardından, deliğe 2,5 milimetre çapında yüksük için seramik bir bölünmüş eşleşme manşonu yerleştirin. L şeklinde bir tavşanda bir delik açın ve elektrot tutucunun namlusunu epoksi yapıştırıcı ile tavşana tutturun. Daha sonra, vidalarla bir manipülatöre takın.

Sütunlu devre kartı ara parçasını bir freze bıçağı ile küboidal bir şekle getirerek özel yapım bir kafa direği hazırlayın ve bir testere ile iki kafa direğine kesin. Ardından, baş direğinin altını bir freze bıçağı ile düzleştirin. Ameliyattan önce tüm cerrahi aletleri ve baş direğini bir otoklav ile sterilize edin.

Stereotaksik çerçeveyi ve ısıtma yastığını yüzde 70 alkolle temizleyin. Ardından, fareyi uyuşturun ve bir ısıtma yastığı üzerindeki stereotaksik çerçeveye yerleştirin. Bu deneyde, channelrhodopsin-II'yi eksprese eden inhibitör nöronların kullanıldığı transgenik bir fare kullanılmıştır.

Dişleri ısırma çubuğunun deliğine yerleştirin ve burun kelepçesini hafifçe sıkın. Ardından, kulak çubukları kullanarak başın her iki tarafını da sabitleyin. Kafa kulak çubukları tarafından doğru şekilde sabitlendiğinde, burun kelepçesini sıkın.

Gözlere oftalmik bir merhem sürün. Saçı küçük bir makasla başın üzerinden kesin ve kafa derisini bir pamuklu çubukla klorheksidin glukonat ile temizleyin. Ardından, kafa derisini orta hat boyunca kesin ve bir kenara itin.

Periosteumu yüzde 70 alkole batırılmış bir pamuklu çubukla çıkarın ve kafatasının kurumasını bekleyin. Ardından, baş direğini manipülatöre takın. Manipülatörü kullanarak baş direğini bregma etrafındaki kafatası üzerine düz bir şekilde yerleştirin.

Buzdolabında soğutulmuş küçük bir tabakta dört damla monomer, bir damla katalizör ve bir küçük kaşık polimeri karıştırın. Frontal ve parietal kemiğe diş çimentosu uygulayın ve baş direğini kafatasına sabitleyin. Diş çimentosu sertleştikten sonra, fareyi stereotaksik çerçeveden çıkarın.

Maruz kalan cilde bir antibiyotik merhem sürün ve bir medetomidin antagonisti ve antibiyotik kokteyli enjekte edin. Ardından, fareyi uyanana kadar bir kafes içindeki ısı yastığının üzerine yerleştirin ve zenginleştirilmiş bir muhafaza kafesine geri koyun. Kayıt için hedef beyin bölgesi üzerinde kraniyotomi yapmak için, kafatasını klorheksidin glukonat ve yüzde 70 alkol ile ıslatılmış bir pamuklu çubukla temizleyin.

Kafatasını bir diş matkabı ile kayıt alanı üzerinde dikkatlice kazıyın. Kemik yeterince ince olduğunda, neşterin ucuyla kesin ve çıkarın. Daha sonra kafatasını güçlendirmek için açıkta kalan bölgenin etrafına diş çimentosu uygulayın.

Diş çimentosu sertleştikten sonra açıkta kalan beyin bölgesini silikon yapıştırıcı ile örtün. Ardından, hayvanı uyanana kadar bir kafeste ısı yastığının üzerine yerleştirin ve bir muhafaza kafesine geri koyun. Elektrofizyolojik kaydı gerçekleştirmeden önce hayvanın kraniyotomiden sonra en az bir gün iyileşmesine izin verin.

Elektrofizyolojik kaydı gerçekleştirmeden önce, bir elektrot çektirmesi kullanarak borosilikat cam kılcal damarlardan bazı cam pipetler yapın. Pipetleri 10 milimolar PBS ile doldurun. Bazı kayıtlarda, 10 milimolar PBS'ye yüzde iki nörobiyotin eklenir.

Ardından, hayvanı kayıt odasına yerleştirin. Özel yapım optrode tutucuya doldurulmuş bir cam pipet takın. Cam pipete gümüş klorür kaplı bir tel yerleştirin.

Daha sonra, pimi kayıt amplifikatörünün baş aşamasına bağlayın. Daha sonra, fiber optik yama kablosunu bir zirkonya yüksük ile optrode tutucusundaki bölünmüş eşleşme manşonuna bağlayın. Yüksüğün ucu cam pipetin arkasına temas edene kadar yama kablosunu manşonun içine itin.

Yama kablosu, ışığı tek kanallı bir LED sürücü tarafından kontrol edilen LED'den sağlar. Daha sonra, kraniyotomi üzerindeki silikon yapıştırıcıyı çıkarın. Kayıt seansı sırasında beyin yüzeyinin kurumasını önlemek için beyin yüzeyine periyodik olarak ılık tuzlu su uygulayın.

Gerekirse, durayı keskin cımbızla çıkarın. Burada, spike yanıtları, uyanık VGAT channelrhodopsin-II farelerinin inferior colliculus'unda kaydedildi. VGAT channelrhodopsin-II farelerinin inferior colliculusunda, GABAerjik nöronlar spesifik olarak channelrhodopsin-II'yi eksprese eder.

Uyanık farelerde, hem GABAerjik hem de glutamaterjik nöronlar, ışık uyaranları verildiğinde sırasıyla uyarıldı veya bastırıldı. Işık uyarısı cam elektrottan geçtiğinde, bazı nöronlarda ani tepkiler uyandırdı. Buna karşılık, diğer nöronlarda, ışık uyaranları, ses uyaranları tarafından uyandırılan ani tepkileri bastırdı.

Bu sonuçlar, bir cam optrode'un iyi izole edilmiş tek birim aktivitesini kaydedebildiğini ve kaydedilen nöronları ışıkla güvenilir bir şekilde uyarabildiğini göstermektedir. Geliştirmeden sonra, bu teknik, sinirbilim alanındaki araştırmacıların, çeşitli beyin bölgelerinin nöral soketinde farklı nöron türlerinin nasıl çalıştığını keşfetmelerinin yolunu açtı.