Name: İndüksiyon ve birincil insan hücrelerinde hücresel yaşlanma doğrulama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Öğrenin hücresel yaşlanmayı indüklemek ve doğrulamak için doxorubicin kullanımını birincil fibroblastlarda. Bu yöntem yaşlanma ve kanser biyolojisi araştırmalarında tekrarlanabilir sonuçlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz üyeleri verimli tartışmalar için yönetici laboratuar ve Thijmen van Vliet veri ve iletişim kuralı UV kaynaklı yaşlanma üzerinde paylaştığınız için teşekkür ederiz.

<ol><li>Hayflick, L., Moorhead, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serial+cultivation+of+human+diploid+cell+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">The serial cultivation of human diploid cell strains.</a> Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).</li>
<li>Muñoz-Espín, D., Serrano, M. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nrm3823">Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature reviews.</a> Molecular cell biology. 15, 482-496 (2014).</li>
<li>Sharpless, N. E., Sherr, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forging+a+signature+of+in+vivo+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Forging a signature of in vivo senescence.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).</li>
<li>Correia-Melo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+are+required+for+pro-ageing+features+of+the+senescent+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Mitochondria are required for pro-ageing features of the senescent phenotype.</a> The EMBO Journal. 10, e201592862(2016).</li>
<li>Loaiza, N., Demaria, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence+and+tumor+promotion%3A+Is+aging+the+key%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Reviews+on+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence and tumor promotion: Is aging the key?</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. , (2016).</li>
<li>Coppe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+p16%28Ink4a%29-positive+cells+shorten+healthy+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan.</a> Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).</li>
<li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+senescent+cells+enhances+adipogenesis+and+metabolic+function+in+old+age%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Targeting senescent cells enhances adipogenesis and metabolic function in old age.</a> Elife. 4, e12997(2015).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+p16Ink4a-positive+senescent+cells+delays+ageing-associated+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders.</a> Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).</li>
<li>Jeon, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+clearance+of+senescent+cells+attenuates+the+development+of+post-traumatic+osteoarthritis+and+creates+a+pro-regenerative+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment.</a> Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).</li>
<li>Demaria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Senescence+Promotes+Adverse+Effects+of+Chemotherapy+and+Cancer+Relapse%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Cellular Senescence Promotes Adverse Effects of Chemotherapy and Cancer Relapse.</a> Cancer Discovery. 7 (2), 165-176 (2017).</li>
<li>Chang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+senescent+cells+by+ABT263+rejuvenates+aged+hematopoietic+stem+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice.</a> Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).</li>
<li>Soto-Gamez, A., Demaria, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+interventions+for+aging%3A+the+case+of+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Therapeutic interventions for aging: the case of cellular senescence.</a> Drug Discov Today. 22 (5), 786-795 (2017).</li>
<li>Childs, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+cells%3A+an+emerging+target+for+diseases+of+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Senescent cells: an emerging target for diseases of ageing.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (10), 718-735 (2017).</li>
<li>Marthandan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+genes+and+pathways+in+primary+human+fibroblast+strains+undergoing+replicative+and+radiation+induced+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Research%22%5BJournal%5D)">Conserved genes and pathways in primary human fibroblast strains undergoing replicative and radiation induced senescence.</a> Biological Research. 49, 34(2016).</li>
<li>Marthandan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+Senescence+Associated+Genes+and+Pathways+in+Primary+Human+Fibroblasts+Detected+by+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Conserved Senescence Associated Genes and Pathways in Primary Human Fibroblasts Detected by RNA-Seq.</a> PLoS One. 11 (5), e0154531(2016).</li>
<li>Hernandez-Segura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unmasking+Transcriptional+Heterogeneity+in+Senescent+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Unmasking Transcriptional Heterogeneity in Senescent Cells.</a> Current Biology. 27 (17), 2652-2660 (2017).</li>
<li>Le, O. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionizing+radiation-induced+long-term+expression+of+senescence+markers+in+mice+is+independent+of+p53+and+immune+status%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Ionizing radiation-induced long-term expression of senescence markers in mice is independent of p53 and immune status.</a> Aging Cell. 9 (3), 398-409 (2010).</li>
<li>Hall, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C%2FEBPalpha+regulates+CRL4%28Cdt2%29-mediated+degradation+of+p21+in+response+to+UVB-induced+DNA+damage+to+control+the+G1%2FS+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">C/EBPalpha regulates CRL4(Cdt2)-mediated degradation of p21 in response to UVB-induced DNA damage to control the G1/S checkpoint.</a> Cell Cycle. 13 (22), 3602-3610 (2014).</li>
<li>Nitiss, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+DNA+topoisomerase+II+in+cancer+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting DNA topoisomerase II in cancer chemotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 9 (5), 338-350 (2009).</li>
<li>Pazolli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+remodeling+underlies+the+senescence-+associated+secretory+phenotype+of+tumor+stromal+fibroblasts+that+supports+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Chromatin remodeling underlies the senescence- associated secretory phenotype of tumor stromal fibroblasts that supports cancer progression.</a> Cancer Research. 72, 2251-2261 (2012).</li>
<li>Venturelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+induction+of+apoptosis+and+senescence+by+the+DNA+methyltransferase+inhibitors+5-azacytidine+and+5-aza-2%27-deoxycytidine+in+solid+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Differential induction of apoptosis and senescence by the DNA methyltransferase inhibitors 5-azacytidine and 5-aza-2'-deoxycytidine in solid tumor cells.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 12, 2226-2236 (2013).</li>
<li>Tennant, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+Trypan+Blue+Technique+for+Determination+of+Cell+Viability%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the Trypan Blue Technique for Determination of Cell Viability.</a> Transplantation. 2, 685-694 (1964).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Lee, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+%CE%B2-galactosidase+is+lysosomal+%CE%B2-galactosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated β-galactosidase is lysosomal β-galactosidase.</a> Aging Cell. 5, 187-195 (2006).</li>
<li>Kopp, H. G., Hooper, A. T., Shmelkov, S. V., Rafii, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-galactosidase+staining+on+bone+marrow.+The+osteoclast+pitfall%5BTitle%5D)+AND+%22Histology+and+Histopathology%22%5BJournal%5D)">Beta-galactosidase staining on bone marrow. The osteoclast pitfall.</a> Histology and Histopathology. 22 (9), 971-976 (2007).</li>
<li>Dimri, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomarker+that+identifies+senescent+human+cells+in+culture+and+in+aging+skin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-9367 (1995).</li>
<li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li>
<li>Sherr, C. J., McCormick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RB+and+p53+pathways+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">The RB and p53 pathways in cancer.</a> Cancer Cell. 2 (2), 103-112 (2002).</li>
<li>Bunz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+p53+and+p21+to+sustain+G2+arrest+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement for p53 and p21 to sustain G2 arrest after DNA damage.</a> Science. 282 (5393), 1497-1501 (1998).</li>
<li>Severino, J., Allen, R. G., Balin, S., Balin, A., Cristofalo, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+beta-galactosidase+staining+a+marker+of+senescence+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Is beta-galactosidase staining a marker of senescence in vitro and in vivo.</a> Experimental Cell Research. 257 (1), 162-171 (2000).</li>
<li>Stolzing, A., Coleman, N., Scutt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-induced+replicative+senescence+in+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Rejuvenation+Research%22%5BJournal%5D)">Glucose-induced replicative senescence in mesenchymal stem cells.</a> Rejuvenation Research. 9 (1), 31-35 (2006).</li>
<li>Blazer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+glucose-induced+replicative+senescence%3A+point+of+no+return+and+effect+of+telomerase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">High glucose-induced replicative senescence: point of no return and effect of telomerase.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 296 (1), 93-101 (2002).</li>
<li>Wiley, C. D., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Ancient+Pathways+to+Aging+Cells-Connecting+Metabolism+and+Cellular+Senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">From Ancient Pathways to Aging Cells-Connecting Metabolism and Cellular Senescence.</a> Cell Metabolism. 23 (6), 1013-1021 (2016).</li>
<li>Kumar, R., Gont, A., Perkins, T. J., Hanson, J. E. L., Lorimer, I. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+senescence+in+primary+glioblastoma+cells+by+serum+and+TGFbeta%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Induction of senescence in primary glioblastoma cells by serum and TGFbeta.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2156(2017).</li>
<li>Hypoxia Blagosklonny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MTOR+and+autophagy%3A+converging+on+senescence+or+quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">MTOR and autophagy: converging on senescence or quiescence.</a> Autophagy. 9 (2), 260-262 (2013).</li>
<li>Meuter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+of+cellular+senescence+are+elevated+in+murine+blastocysts+cultured+in+vitro%3A+molecular+consequences+of+culture+in+atmospheric+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Assisted+Reproduction+and+Genetics%22%5BJournal%5D)">Markers of cellular senescence are elevated in murine blastocysts cultured in vitro: molecular consequences of culture in atmospheric oxygen.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 31 (10), 1259-1267 (2014).</li>
<li>Coppe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human-like+senescence-associated+secretory+phenotype+is+conserved+in+mouse+cells+dependent+on+physiological+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A human-like senescence-associated secretory phenotype is conserved in mouse cells dependent on physiological oxygen.</a> PLoS One. 5 (2), e9188(2010).</li>
<li>van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+senescent+cells+in+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The role of senescent cells in ageing.</a> Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).</li>
<li>Kim, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+time-series+gene+expression+profiles+of+replicative+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Implications of time-series gene expression profiles of replicative senescence.</a> Aging Cell. 12, 622-634 (2013).</li>
</ol>

Burada iletişim kuralları insan birincil fibroblastlar için optimize özellikle BJ ve WI-38 hücreleri. İkileştirici yaşlanma, iyonizan radyasyon ve doksorubisin, protokollerde başarıyla uygulanan diğer türlerini fibroblastlar (HCA2 ve IMR90) ve diğer hücre tipleri (Yani yenidoğan melanosit ve Lenfositi veya IPSC elde edilen cardiomyocytes) Bizim laboratuvarda. Ancak, ek hücre tipleri için uyarlamalar numaralı seribaşı hücreleri, yöntemleri ve hücreler ekleme/ayırma için plastik destekler için yardımcı kimyasallar ve toksi...

1961'de Hayflick ve Moorhead kültür birincil fibroblastlar sonra art arda pasajlar1proliferatif potansiyellerini kaybetmek bildirdi. Bu işlem sıralı telomerlerin kısalma her hücre bölünmesi sonra neden olur. Telomerlerin eleştirel kısa uzunluğu ulaştığında, nükleer silahların yayılmasına karşı geri dönüşü olmayan bir tutuklama etkinleştiren DNA hasarı yanıt (DDR) tarafından tanınır — de ikileştirici yaşlanma tanımlanır. İkileştirici yaşlanma Şu anda hücre mitogens hem apoptotik sinyal2,3duyarsız işler kalıcı hücre döngüsü tutuklama durumunu ikna etmek için bilinen birçok uyarinin biridir. Yaşlanma program normalde yüksek lizozomal etkinlik, mitokondrial disfonksiyon, nükleer değişiklikleri, kromatin düzenlemeler, endoplazmik retikulum stres, DNA hasarı ve yaşlanma ilişkili dahil olmak üzere ek özellikler ile karakterizedir salgı fenotip (SASP)3,4. Senescent hücreleri vücutta birden fazla işlevi var: geliştirme, yara iyileşmesi ve tümör bastırma2. Aynı şekilde, yaşlanma ve paradoksal olarak, tümör ilerleme5önemli bir rol oynamak için bilinir. Yaşlanma negatif ve kısmen çelişkili etkileri genellikle için SASP6atfedilen.
Son zamanlarda, bu fareler senescent hücrelerden ortadan kaldırılması ömrü uzatma ve yaşlanma özellikleri7,8,9,10,11, çoğunu ortadan kaldırılması yol gösterildi 12. aynı şekilde, birden çok uyuşturucu da senescent hücreleri (senolytics) ortadan kaldırmak için veya SASP13,14hedeflemek için geliştirilmiştir. Anti-aging tedavi potansiyel son zamanlarda alanına daha fazla dikkat çekti.
Çalışma mekanizmaları için hücresel yaşlanma ilişkili ve farmakolojik müdahaleler için gösterimleri özellikle de insan birincil fibroblastlar ex vivo modellerinde güveniyorsun. Ortak bazı özellikleri farklı yaşlanma indükleyicileri tarafından aktif olmakla birlikte, yaşlanma fenotip büyük bir değişkenlik gözlenen ve hücre türü, uyarıcı ve zaman noktası3,15gibi çeşitli faktörlere bağlıdır. 16,17. Eğitim ve senescent hücreleri hedefleme için heterojenite düşünün zorunludur. Bu nedenle, bu iletişim kuralı bir dizi farklı tedavileri kullanarak birincil fibroblastlar yaşlanma ikna etmek için kullanılan yöntem sağlamayı amaçlamaktadır. Bunu izah gibi yöntemler kolayca diğer hücre tipleri için adapte edilebilir.
İkileştirici yaşlanma dışında biz beş diğer yaşlanma-inducing tedaviler tarif: iyonlaştırıcı radyasyon, ultraviyole (UV) ışınları, doksorubisin, oksidatif stres ve epigenetik değişiklikler (yani promosyon histon asetilasyon veya DNA demethylation) . Hem, iyonizan radyasyon ve UV radyasyon doğrudan DNA hasarına neden ve yaşlanma18,19uygun doz tetik. Doksorubisin aynı zamanda yaşlanma DNA hasarı üzerinden olmak üzere DNA'ya enterkalasyon tarafından neden olur ve topoizomeraz II işlevi bozmakta ve böylece DNA durdurma mekanizmaları20onarmak. Genlerin yaşlanma için temel ifade normalde histon asetilasyon ve DNA metilasyonu tarafından kontrol edilir. Sonuç olarak, histon deacetylase inhibitörleri (Örneğin, sodyum bütrat ve SAHA) ve DNA demethylating (Örneğin, 5-aza) ajanlar yaşlanma Aksi takdirde normal hücreleri21,22tetikler.
Son olarak, dört senescent hücrelere ilişkili en yaygın veri işaretleyicilerini açıklanacaktır: yaşlanma ilişkili-β-galaktozidaz (SA-β-gal), DNA sentezi tarafından EdU birleşme tahlil, hücre döngüsü düzenleyiciler overexpression oranı etkinlik ve siklin bağımlı kinaz inhibitörleri p16 ve p21 ve overexpression ve SASP üyeleri salgılanmasını.

<table><tbody><tr><td>DMEM Media - GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31966-047</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Hiklonu</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (P / S; 10.000 U / ml)</td> <td>Lonza</td><td>DE17-602E</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil Sülfoksit (DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>SC-202581</td><td></td></tr><tr><td>Nükleaz İçermeyen Su (DEPC ile Tedavi Edilmemiş)</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>T75 şişesi</td><td>Sarstedt</td><td>833911002</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin / EDTA Çözeltisi</td><td>Lonza</td><td>CC-5012</td><td></td></tr><tr><td>PBS tabletleri</td><td>Gibco</td><td>18912-014</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9661-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; 15 mL santrifüj tüpleri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430791</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu plaka</td><td>Sarstedt</td><td>83.3920</td><td></td></tr><tr><td>24 oyuklu plaka</td><td>Sarstedt</td><td>83.3922</td><td></td></tr><tr><td>13mm yuvarlak lameller</td><td>Sarstedt</td><td>83.1840.002</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip</td><td>Merck Kimyasalları</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Sezyum137 kaynaklı</td><td></td><td></td><td>IBL 637 Sezyum-137&gamma;-ışını makinesi</td></tr><tr><td>UV radyasyon odası</td><td></td><td></td><td>Opsytec, Dr. G&ouml; bel BS-02</td></tr><tr><td>Doksorubisin dihidroklorür&nbsp;</td><td>BioAustralis İnce Kimyasallar</td><td>BIA-D1202-1</td><td></td></tr><tr><td>Hidrojen peroksit çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7722-84-1</td><td></td></tr><tr><td>5-aza-2'-deoksisitidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3656</td><td></td></tr><tr><td>SAHA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0061</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Butirat&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>X-gal (5-Bromo-4-kloro-3-indolil-&beta; -D-galaktopiranosid)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>7240-90-6</td><td></td></tr><tr><td>Sitrik asit monohidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5949-29-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum dibazik fosfat</td><td>Acros organics</td><td>7782-85-6</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum ferrosiyanür ve nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>14459-95-1</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum ferrisiyanür</td><td>Fisher Scientific</td><td>13746-66-2</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Merck Millipore</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum Klorür</td><td>Fisher Kimyasalları</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>%25 glutaraldehit</td><td>Fisher Scientific</td><td>111-30-8,7732-18-5</td><td></td></tr><tr><td>%16 formaldehit (a/h)</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>EdU (5-etinil-2'-deoksiuridin)</td><td>Lumiprobe</td><td>10540</td><td></td></tr><tr><td>Sülfo-Siyanin3 azid (Sülfo-Cy3-Azide)</td><td>Lumiprobe</td><td>D1330</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum askorbat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>Bakır(II) sülfat pentahidrat (Cu(II)SO4.5H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td> TRIS tabanı 215682500 <td></td><td>Acros organics</td></tr><tr><td></td><td>Roche</td><td>11814273001</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 Multiwell Plate 384, beyaz&nbsp;</td><td>Roche</td><td>4729749001</td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 480 sızdırmazlık folyosu&nbsp;</td><td>Roche</td><td>4729757001</td><td></td></tr><tr><td>Sensifast Probe Lo-ROX kiti&nbsp;</td><td>Bioline</td><td>BIO-84020</td><td></td></tr><tr><td>UPL Prob Kitaplığı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Çeşitli</td><td></td></tr><tr><td>İnsan IL-6 DuoSet ELISA</td><td>R& D</td><td>D6050</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad TC20</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sayma slaytları</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0017</td><td></td></tr><tr><td>Kuru inkübatör</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>Heratherm</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilformamid</td><td>Merck Millipore</td><td>1.10983</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm 'M' laboratuvar filmi</td><td>Bemis&nbsp;</td><td></td><td></td>#PM992</tr><tr><td>Cımbız İğneleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

İndüksiyon ve birincil insan hücrelerinde hücresel yaşlanma doğrulama

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Hücresel yaşlanma kalıcı hücre döngüsü tutuklama farklı zararlı uyaranlara yanıt olarak aktif bir durumdur. Harekete geçirmek-in hücresel yaşlanma tümör giderme, yenileme ve yaşlanma doku dahil olmak üzere çeşitli patofizyolojik koşullar bir özelliğidir. Hücresel yaşlanma vivo içinde indükleyicileri hala kötü karakterizedir. Ancak, bir dizi uyaranlara hücresel yaşlanma ex vivotanıtmak için kullanılabilir. Bunların arasında en yaygın yaşlanma-indükleyicileri ikileştirici bitkinlik, iyonize ve iyonizan radyasyon, genotoksik uyuşturucu, oksidatif stres ve demethylating ve ajanlar acetylating vardır. Burada, bu uyaranlara fibroblastlar yaşlanma ikna etmek için kullanma hakkında ayrıntılı yönergeler sağlayacaktır. Bu iletişim kuralı kolayca primer hücre ve hücre hatları, kanser hücrelerinin de dahil olmak üzere farklı türleri için adapte edilebilir. Biz aynı zamanda yaşlanma indüksiyon doğrulama için farklı yöntemler açıklanmaktadır. Özellikle, biz lizozomal enzim yaşlanma ilişkili β-galaktozidaz (SA-β-gal), 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) birleşme tahlil, ifadesi hücre döngüsünün düzeyi kullanarak DNA sentezi oranı etkinliğini ölçme üzerinde odaklanmak inhibitörleri p16 ve p21 ve ifade ve salgı üye Senescence-Associated salgı fenotip (SASP). Son olarak, örnek sonuçlar sağlar ve uygulamalar bu iletişim kurallarının tartışmak.

SA-β-gal senescent fibroblastlar boyama zenginleştirme
Β-galaktozidaz (β-gal) bu tüm hücrelerde ifade edilir ve bir optimum pH 4.025,26olan lizozomal bir enzimdir. Ancak, yaşlanma sırasında organellerin Boyutu'nda artırın ve sonuç olarak, β-gal senescent hücreleri birikir. Bu enzim artan miktarda bir suboptimal pH 6,025,2...

Burada, bir dizi indüksiyon için protokol ve kültürlü hücrelerdeki hücresel yaşlanma doğrulanmasını tartışmak. Biz farklı yaşlanma-inducing uyaranlara üzerinde odaklanmak ve ortak yaşlanma ilişkili işaretçileri miktar açıklayın. Fibroblastlar içerebilen bir model olarak kullanarak teknik ayrıntıları sağlar, ancak iletişim kuralları için çeşitli hücresel modelleri adapte edilebilir.

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

Bu yöntem, hücresel yaşlanmayı indüklemek için yaygın tekniklerin nasıl uygulanacağı ve yaşlanma fenotipinin nasıl değerlendirileceği gibi yaşlanma ve kanser alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, takip edilmesinin kolay olması, yüksek oranda tekrarlanabilir olması, herhangi bir özel veya pahalı ekipman gerektirmemesi ve hücresel popülasyonun en az% 50'sinde yaşlanma indüksiyonu ile sonuçlanmasıdır. Bu prosedürü gösteren, laboratuvarımızdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Alejandra Hernandez-Segura olacaktır.Başlamak için, 10 mililitre D10 içeren bir T75 şişesinde düşük Popülasyon İkiye Katlama veya PD ile yedi kez 10 ila beşinci canlı primer fibroblastları tohumlayın. Hücreleri, gece boyunca %5 karbondioksit ve %5 oksijen ile 37 santigrat derecede bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin. 1.000X doksorubisin stok çözeltisinin 11 mikrolitresini 11 mililitre D10 içinde 250 nanomolar nihai konsantrasyona kadar seyreltin.Daha sonra ortamı hücrelerden aspire edin ve 10 mililitre D10 artı doksorubisin ile değiştirin. Hücreleri, tam olarak 24 saat boyunca% 5 karbondioksit ve% 5 oksijen ile 37 santigrat derecede bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin. Daha sonra ortamı aspire edin ve hücreleri bir kez dikkatlice yıkamak için 10 mililitre D10 kullanın.Hücreleri altı gün daha 10 mililitre D10 içinde inkübe edin ve ortamı yaklaşık üç günde bir düzenli olarak değiştirin. Beta-galaktosidaz boyamayı gerçekleştirmek için, her numune için 500 mikrolitre D10 içeren 24 oyuklu bir plakanın en az bir oyuğunda 10 ila dördüncü hücreye bir kez tohumlayın, böylece hücreler seyrek olur. Hücreleri gece boyunca %5 karbondioksit ve %5 oksijen ile 37 santigrat derecede inkübe edin.Ertesi gün, hücreleri iki kez yıkamak için 500 mikrolitre PBS kullanın. Daha sonra PBS'de %2 formaldehit artı %0.2 glutaraldehit kuyusu başına 500 mikrolitre ekleyin ve hücreleri sabitlemek için oda sıcaklığında üç ila beş dakika inkübe edin. Daha sonra hücreleri iki kez yıkamak için 500 mikrolitre PBS kullanın.Daha sonra, taze boyama solüsyonu hazırladıktan sonra, oyuk başına 500 mikrolitre ekleyin ve kristallerin oluşmasına neden olabilecek buharlaşmayı önlemek için plakayı kapatmak için parafilm kullanın. Hücreleri karanlıkta 37 santigrat derecede karbondioksit içermeyen kuru bir inkübatörde 12 ila 16 saat inkübe edin. Daha sonra hücreleri iki kez yıkamak için 500 mikrolitre PBS kullanın.Pozitif hücrelerin mavi paranükleer boyama ile görüneceği sonuçları değerlendirmek için hücreleri normal bir ışık mikroskobu altında kontrol edin. Tek tek hücrelerin görselleştirilmesini ve nicelleştirilmesini kolaylaştırmak için, DAPI'yi karşı boyama olarak kullanın. Daha sonra bir floresan mikroskobu kullanarak, en az 100 tek hücreyi değerlendirmek için aynı numunenin birden fazla fotoğrafını çekerek toplam hücre sayısına karşı pozitif hücrelerin yüzdesini belirleyin.Her numune veya koşul için, 24 oyuklu bir plakaya oyuk başına bir lamel yerleştirin. Hücrelerin seyrek olması için oyuk başına 500 mikrolitre D10 ile dördüncü hücrelere bir kez 10 tohum atın. Hücreleri gece boyunca %5 karbondioksit ve %5 oksijen ile 37 santigrat derecede inkübe edin.Her numune 250 mikrolitre alacak şekilde 20 mikromolar EdU çözeltisi ve D10'dan yeterince hazırlayın. Tedavi edilen her kuyucuktan ortamın yarısını çıkarın ve EdU D10 çözeltisi ile değiştirin. Son EdU konsantrasyonu 10 mikromolardır.Numuneleri 37 santigrat derecede %5 karbondioksit ve %5 oksijen ile 18 ila 24 saat inkübe edin. Kontrol ve yaşlanan hücreler için aynı kuluçka süresini kullanın. İnkübasyondan sonra, hücreleri iki kez yıkamak için 500 mikrolitre PBS kullanın.Daha sonra PBS'ye 500 mikrolitre% 4 formaldehit ekleyin ve hücreleri sabitlemek için 10 dakika inkübe edin. Fiksasyonu takiben, numunelere 500 mikrolitre 100 milimolar Tris pH 7.6 ekleyin ve beş dakika inkübe edin. Daha sonra, hücrelere PBS'de 500 mikrolitre% 0.1 Triton X-100 ekleyin ve 10 dakika boyunca geçirgen hale getirin.Ardından numuneleri üç kez yıkamak için PBS kullanın. Her lamel için 50 mikrolitre etiket karışımı hazırlayın, bileşenleri aşağıdaki sırayla ekleyin, 44.45 mikrolitre PBS, 0.5 mikrolitre bakır(II) sülfat, 0.05 mikrolitre sülfo-si3-azid ve beş mikrolitre sodyum askorbat. Bir parça parafilm üzerine 50 mikrolitre etiket karışımını pipetleyin.Daha sonra cımbız ve bir iğne kullanarak lamel kaldırın ve hücre tarafı aşağı bakacak şekilde etiket karışımının üzerine koyun. Kabarcık olmadığından ve lamel yüzeyinin tüm yüzeyinin etiket karışımına temas ettiğinden emin olun. Numuneyi karanlıkta 30 dakika inkübe edin.Hücreleri 24 oyuklu plakanın kuyularına geri koyun ve üç kez yıkamak için PBS kullanın. Ardından, numuneleri monte etmek ve gece boyunca kurumaya bırakmak için DAPI ile montaj ortamı kullanın. Başlamak için, düşük bir Popülasyon İkiye Katlama veya.Koşul başına en az 100 hücre görüntüleyin. Son olarak, aşağıdaki formülü kullanarak EdU'yu içeren hücrelerin yüzdesini ölçün. Metin protokolüne göre gen ve protein ekspresyon çalışmalarını gerçekleştirin.Burada, yaşlanan primer fibroblastlara karşı proliferasyonda SA-beta-gal boyamanın temsili görüntüleri gösterilmektedir. Yaşlanan hücreler, normal bir hücre gövdesi içinde genişlemiş görünür. Belirtildiği gibi, tek tek hücreleri ayırt etmek zor olabilir.Bu nedenle, DAPI ile birlikte boyama, görselleştirmeyi ve hücre sayımını kolaylaştırır. Bu deneyde, popülasyona bakır katalizli azid-alkin siklo ilavesi yapmak için suflo-cy3-azid kullanıldı. Aridin alkine bağlanması gerçekleşmişse, hücreler, çoğalan hücreleri çoğalmayan hücrelerden ayıran bir cy3 filtresi altında floresan gösterecektir.Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa 36 saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, oksijen konsantrasyonundaki salınımlar sonuçlarını etkileyebileceğinden, inkübatörün dışındaki hücreleri tutarken mümkün olduğunca hızlı olmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, salgılanan proteinlerin seviyeleri veya spesifik sinyal yollarının anlaşılması gibi ek soruları yanıtlamak için sitokin dizisi veya Western blot gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, yaşlanma ve kanser alanındaki araştırmacıların, yaşlanan hücrelerin memelilerde fizyolojik ve patolojik durumlarda nasıl rol oynadığını keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, birincil hücrelerde yaşlanmayı tekrarlanabilir bir şekilde nasıl indükleyeceğinizi ve yaşlanma durumlarını nasıl değerlendireceğinizi iyi anlamalısınız.

induction-and-validation-of-cellular-senescence-in-primary-human-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Yaşlanması önler veya tümörogenez tartışmalıdır teşvik olsun. Kemoterapik ilaçlar senesce için kanser hücrelerinin neden olabilir bu yana, yaşlılık okuyan yeni tedaviler önermek için gereklidir. Ancak, standart ve geniş kullanılan β-galaktosidaz tahlil büyük sakıncaları sunar. Burada yaşlılık ölçmek için hızlı ve hassas akım sitometri bazlı analiz öneriyoruz.

Senesent Kanser Hücreleri ölçmek için bir Hassas Yöntem

Hücresel yaşlanma, hücre döngüsü tutuklama tersinmez durum, çeşitli hücresel stresler tarafından indüklenebilir. Burada, yaşlanmanın işaretlerini değerlendirmek için hücre yaşlanmasının ve yöntemleri ikna etmek protokolleri açıklar.

Teknikler İndüklemek ve Ölçmek Hücresel Yaşlılık etmek

Burada senescent her ikisi de algılamak için detaylı bir protokol ve pluripotent kök hücre iskelet kas üzerine vivo içinde yeniden programlama inducing sırasında yaralanma mevcut. Bu yöntem doku yeniden oluşturma işlemi sırasında hücresel yaşlanma rolünün değerlendirilmesi ve in vivoyeniden programlama için uygundur.

Yaralanma kaynaklı yaşlanma ve In Vivo kas iskelet yeniden programlama değerlendirilmesi

Hücre içi ROS hücresel yaşlanma indüksiyon içinde önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Burada, ROS düzeyleri hücresel yaşlanma sırasında miktarının için hassas bir tahlil açıklayın. Ayrıca bildirildi çeşitli yaş ile ilgili işlev bozuklukları için katkıda yaşlanma ilişkili salgı fenotip, değerlendirmek için protokolleri sağlar.

Reaktif oksijen türleri ve yaşlanma ilişkili salgı fenotip Normal insan fibroblast içinde bir nicel ölçüm onkogen kaynaklı yaşlanma sırasında

Hücresel senesans, Yaş ile ilgili kronik patolojilerin gelişiminde önemli bir faktördür. Parlak hücreleri hedefleyen terapinin tanımlanması, sağlıklı yaşlanmanın uzatılması için söz veriyor. Burada, tek hücrelerde senesans ilişkili β-galaktosidaz aktivitesinin ölçümüne dayalı senoterapötik teşhis için ekrana bir roman tahlil sunuyoruz.

Senoterapötik Ilaçların tanımlanması için SA-β-Galactosidaz tabanlı tarama tahlili

Çoklu immünoflüoresans, doku mimarisi ve hücre popülasyonlarının mekansal analizini desteklemek için tek bir doku bölümünde birden fazla antikor belirteçinin ardışık olarak etiketlenmesini sağlar. Burada, yaşlanma ile ilişkili, yapısal ve bağışıklık belirteçlerinin çoklu algılanması için manuel ve otomatik slayt hazırlığı, yinelemeli görüntüleme ve dijital patoloji yazılımı kullanılarak tek hücre analizi dahil olmak üzere bir iş akışı sunulmaktadır.

Yaşlanma Belirteçlerinin Mekansal Değerlendirmesi İçin Multipleksli İmmünoflüoresans Testi

Bu protokol, insan yağ dokusundan izole edilen stromal damar fraksiyonunda yaşlanma ile ilişkili beta-galaktosidaz (SA-β-gal) aktivitesinin objektif ve tek hücreli tespiti için yansıtılmış ışık konfokal mikroskopisi sunmaktadır. Yöntem, immünositokimya ile uyumludur, nicel değerlendirme için pH kontrollerini içerir ve ayrıca geleneksel SA-β-gal boyamaya daha hassas ve daha az öznel bir alternatif sunar.

Yağlı stromal damar fraksiyonunda yansıtılan ışık kullanılarak yaşlanma tespiti

HNM'de erken yaşlanmayı tetiklemek için tBHP kullanılarak standartlaştırılmış bir protokol, büyüme durması, SA-β-galaktosidaz aktivitesi ve SASP faktörleri dahil olmak üzere temel yaşlanma belirteçlerini analiz etmek için standartlaştırılmış protokoller.

Tert-bütil hidroperoksit kullanarak birincil insan melanositlerinde stres kaynaklı erken yaşlanma için standart bir protokol

Bu makale, IMR-90 insan fibroblastlarında yaşlanma sırasında lizozomal yeniden modelleşmeyi ölçmek için canlı hücreli bir LysoTracker protokolünü sunmaktadır.

İnsan Fibroblastlarında Hücresel Yaşlanmanın Nicel Değerlendirmesi İçin LysoTracker ile Lizozomal Profilleme

Bu yöntem, yaşlı cilt fibroblastlarının sağlıklı fibroblastları nasıl etkilediğini inceler. Yaşlanma, UVB maruziyeti yoluyla indüklenir ve koşullu ortam normal fibroblastlara uygulanır. Cilt yaşlanmasında değişen hücre-hücre iletişimini hedefleyen biyoaktif bileşiklerin değerlendirilmesine yardımcı olur.

Yaşlı Hücrelerden Koşullu Ortamla In vitro Modelde Sağlıklı Hücreler Arası İletişimi Yeniden Sağlayacak Antioksidan Kombinasyonu

Öğrenin hücresel yaşlanmayı indüklemek ve doğrulamak için doxorubicin kullanımını birincil fibroblastlarda. Bu yöntem yaşlanma ve kanser biyolojisi araştırmalarında tekrarlanabilir sonuçlar sağlar.

İndüksiyon ve birincil insan hücrelerinde hücresel yaşlanma doğrulama

Daha fazla video keşfet