Name: Tüm fare embriyo etkinliğinde β-galaktozidaz tespiti yoluyla Gen ifadesinin izleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Öğrenin, fare embriyolarında β-galaktozidaz aktivitesi tespitiyle gen ifadesi izleme yöntemini. Bu protokol, gelişim biyolojisi araştırmalarında hızlı ve güvenilir sonuçlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) histopatolojik hizmet onların teknik destek için teşekkür etmek istiyorum. Biz de Dr. Motoharu SEIKI nazikçe sağlayan Mt4 mmpLacZ fareler için ve Dr. Alicia G. Arroyo projemize destek için ve el yazması onun eleştirel okuma için teşekkür ederiz. Peter Bonney Bu makale redaksiyon için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser Universidad Europea de Madrid tarafından C.S.C. için layık bir hibe (# 2017UEM01) aracılığıyla destek verdi

Tüm deneysel prosedürler CNIC (Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares) ve Comunidad Autonoma de Madrid çok az hayvan acı sağlamak için hayvan deneyleri Etik Komitesi tarafından kabul edildi.
1. embriyo hamile fareler (E12.5 E8.5)'dan gelen topluluğu
<ol><li>Servikal yerinden çıkması veya CO2 inhalasyon hamile fareler kurban. İlk gün gözlenen vajinal tak olarak embriyonik kabul gün 0,5 (E0.5).</li>
	<li>Fare % 70 etanol ile karın deri temiz ve emici Ped sırtüstü pozisyonda hayvan yatıyordu. Not: Aşağıdaki adımlarda kısırlık gerekli değildir.</li>
	<li>Çimdik ve karın deri fare-diş forseps kullanarak kaldırın.</li>
	<li>Bir kesik deri ve karın duvarı, 2-4 cm dikey olarak cerrahi makas kullanarak karın orta hat üzerinden yapmak.</li>
	<li>Karın maruz ve cerrahi makas ile rahim iç eğim boyunca forseps kesme kan damarları ile anneden rahim boynuzları kaldırmak.</li>
	<li>Ve 10 mL buz gibi 0.01 M fosfat tampon serum fizyolojik pH 7,4 (PBS) içeren buzda bir petri transfer embriyoların dizi çıkarın.</li>
	<li>Dikkatlice dışarı embriyolar rahim Petri kabına 10 mL taze buz gibi PBS ile bir stereomicroscope altında gelen incelemek. Kas duvar amniyotik kese ortaya çıkarmak için saatçilik forseps ile kavramak ve amniyotik membran kapalı embriyo ve forseps ipuçlarını kullanarak sarısı sac kaldırmak için gözyaşı.</li>
	<li>(E12.5 E8.5)'dan erken aşamalarında hamile fareler littermate embriyo toplamak (Şekil 2).</li>
	<li>Eğri forseps kullanarak 10 mL soğuk 1 x PBS ile taze yemek için embriyo transfer veya (E8.5-E9.5) çok küçük embriyolar için plastik transfer pipetler embriyo zarar vermeden örnekleri toplamak için kullanın.</li>
	<li>Fiksasyonun başlamadan önce embriyonik bir örnek bir microcentrifuge tüp Genotipleme için embriyo küçük bir parça kesme veya amniyotik membran (E9.5 E8.5)'dan küçük embriyo saatçilik forseps ile alarak getirin. Not: LacZ Genotipleme polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) astar tarafından belirlenir: ileri, 5´-ATCGTGCGGTGGTTGAACTG-3´; tersine, 5´-CGAGGCGTTAACCGTCAGCA-3´.</li>
</ol>2. fare embriyo fiksasyonu
<ol><li>Her embriyo ile bir yuvarlak taban 1 mL 1 x PBS içeren 2 mL microcentrifuge tüp içine aktarın. Not: bütün adımları Bu tüpler protokolünde ajitasyon ile çalışırken bir shaker kullanarak gerçekleştirin.</li>
	<li>Embriyo için oda sıcaklığında 1 dk içinde 1 x PBS kalan kan ortadan kaldırmak için yıkayın. Kullanım plastik transfer pipetler tüpler sıvılarda değiştirmek için.</li>
	<li>Embriyo %0.125 oxazolidin buz üzerinde 1 mL fix. Not: Fiksasyon zaman embriyo boyutuna bağlıdır: E8.5-E9.5 embriyo, 30 dk E10.5 embriyo ve E12.5 embriyo için 1 h 20 min.</li>
	<li>Sabitleştirici kaldırmak ve örnek için X-gal boyama işleme önce embriyolardan 1 x PBS oda sıcaklığında 10 dakika için iki kere yıkayın.</li>
</ol>3. bütün Dağı β-galaktozidaz Histochemistry fare embriyolar
<ol><li>Hazırlama X-Gal durulama tampon ve X-Gal boyama yordamına başlamadan önce çözüm ( Tablo 1 ve Tablo reçetesibakınız). Vahşi-tipi (WT) littermate embriyo için enzimatik reaksiyon negatif denetimleri kullanın.</li>
	<li>X-Gal durulama arabelleği (Şekil 2) Oda sıcaklığında 10 dakika için embriyo kuluçkaya.</li>
	<li>X-Gal boyama çözümde embriyo ışıktan korunan 37 ° C'de bir gecede 2 h kuluçkaya. Mavi boyama yeterli yoğunluğu olmadan arka planda embriyo görülmektedir kadar renk reaksiyonu sürekli yayın yolu ile diseksiyon mikroskop monitör. 8 ve 9 arka plan bütün boyama sırasında azaltmak için arasında çözüm pH tutun. Boyama çözüm ışığı başlarsa, enzimatik reaksiyon genişletmek için taze substrat çözeltisi ile değiştirin.</li>
	<li>Bir microcentrifuge tüp ile 1 mL 1 x PBS oda sıcaklığında her 10 min için iki kez embriyoların yıkayarak istenen sinyal alındığında tepki bırak.</li>
	<li>4 ° C'de bir gecede 1 h için 1 mL % 4 paraformaldehyde (PFA), yeniden düzeltmek için lekeli embriyo transferi Not: Embriyo %4 oranında saklanabilir PFA/PBS için daha uzun süreleri 4 ° C'de veya kesit için hemen işlenebilir. Bu son fiksasyon boyama desen uzun vadeli korunması için çok önemli bir adımdır.</li>
	<li>Embriyolardan 1 mL 1 x PBS oda sıcaklığında 10 dakika için iki kere yıkayın.</li>
	<li>Seçenek 1: embriyo daldırma çözümleri ile gliserol (1 x PBS içinde % 20, % 40, % 60 ve % 80 gliserol) her çözümde oda sıcaklığında 1 h için konsantrasyonları artan bir dizi tarafından temizleyin. Not: embriyo için daha uzun zaman % 80 gliserol içinde yıkayın, hatta günler kadar temizlenir ve sonra onları bu adımda (Şekil 2) 4 ° C'de % 80 gliserol saklayın. Sodyum azid ora kristal thymol, çok küçük bir miktar 4 ° C'de gliserol veya 1 x saklanan embriyolar ekleme PBS küf gelişimi önlemek için önerilir. Takas sonra bütün Dağı embriyo (adım 4) fotoğraf çekmek için kullanılabilir.</li>
	<li>Seçenek 2: gömme ve bir microtome (Şekil 2) kullanarak kesit parafin için embriyo işlemek. Tüm lekeli embriyo ifade desende (adım 4 ve 5) kesit önce belge.</li>
</ol>4. fotoğraf bütün Dağı embriyolar
<ol><li>Bütün Dağı kesit önce embriyo lekeli fotoğraf, onları bir tabanı ile hazırlanmış Petri kabına aktarmak için 1 x PBS % 1-2 özel katılaşmış.</li>
	<li>Dehidratasyon ve yansıma sıvı fotoğraf çekimi sırasında önlemek için tamamen 10 mL 1 x PBS özel kaplamalı yemekler ile embriyo kapsar.</li>
	<li>1 x PBS forseps kullanarak dalmış embriyo yönlendirmek. (E10.5-E12.5) büyük embriyolar için forseps yerleştirin ve numune içindeki farklı açılarda konumlandırın ve serbest dalgalanma fotoğraf sırasında önlemek için ile özel küçük bir delik açmak.</li>
	<li>Çanak iletilen (altında sahne) ışık kullanarak stereomicroscope sahnede yerleştirin. 'Karanlık-alanın' ve 'alan parlak' ayarlamaları istenen aydınlatma Fotoğrafçılık sırasında ayarlamak ve örnek kalınlığı en iyi duruma getirmek için arasında değiştirin. Not: sonraki aşamada embriyolar için fiber optik aydınlatma embriyo yüzeyi yansıması önlemek için kullanın. Temizlenen embriyo fotoğrafı çekerken, aynı yordamı izleyin ama bunları % 100 gliserol içeren bir Petri kabına aktarmak ve onları koltuğunuza.</li>
</ol>5. parafin gömme ve X-gal kesit embriyo lekeli
<ol><li>Parafin mumu katıştırma<ol>
<li>X-gal embriyo 4 ° c (adım 3.5) lekeli kaldırmak ve sabitleştirici fazlalığı ortadan kaldırmak için üç kez 1 mL 1 x PBS ile yıkayın.</li>
		<li>Her embriyo forseps kullanarak bir Histoloji kaset aktarın.</li>
		<li>Embriyo bir ölçek içeren kaset yerleştirin ve sonra oda sıcaklığında kademeli etanol yoluyla geçirerek kurutmak: % 70 etanol, bir kez 30 dakika; % 96 etanol, 30 dk için iki kez; % 100 etanol, 30 dk için iki kez. Not: Embriyo dehidratasyon işlemine başlamadan kadar belirsiz bir kez 4 ° C'de % 70 etanol içinde depolanabilir.</li>
		<li>İsopropanol oda sıcaklığında 30 dakika tüm kasete kuluçkaya.</li>
		<li>Forseps kullanarak, önceden ısıtılmış isopropanol içeren yalak boyama bir cam kasetleri aktarmak ve 60 ° c için 30 dk fırında bırakın.</li>
		<li>Yeni bir bardakta olsun % 50 isopropanol karışımı içeren yalak boyama kaset yerleştirin / % 50 Parafin balmumu erimiş ve 4 h 60 ° C fırında bırakın.</li>
		<li>Kaset erimiş Parafin balmumu, 60 ° c 30 dk iki değişiklik ile embriyo ile kuluçkaya.</li>
		<li>Son parafin yıkama sonunda, kaset açın ve örnek bir stereomicroscope altında görüntülemek için kalıp katıştırma ayrı bir doku her embriyo transfer.</li>
		<li>60 ° C'de erimiş parafin mum ile iyi doldurun Isıtmalı forseps erimiş mum tutmak ve dikkatle kalıp embriyo yönlendirmek için kullanın. Not: Örnek uygun yönlendirmeyi istenen düzlemde embriyo kesit için kritik bir adımdır.</li>
		<li>Önce kalıp içinde parafin katılaşır, blok üst kapağı olmadan bir kaset yerleştirin ve erimiş parafin mum ile doldurun. Gecede oda sıcaklığında katılaşmış kadar kalan balmumu soğumaya bırakın.</li>
		<li>Parafin tamamen katılaşmış bir kez sağlam blok kalıptan çıkarın ve parafin blok oda sıcaklığında veya 4 ° c14kesit kadar saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Parafin kesit<ol>
<li>Microtome üzerinde bıçak yönlendirmek ve kalınlığı 5-7 µm kadar ayarla. 5.2.2. cool parafin blok buz üzerinde ve bir küp veya bir piramit üretmek için trim.</li>
		<li>Blok microtome sahibine erimiş mum küçük bir miktar kullanarak ekleyin.</li>
		<li>En uygun kesme blok gelecek şekilde yönlendirin. Bölüm parafin blok standart microtome kullanarak oda sıcaklığında 5-7 µm kalınlığında dilimler halinde.</li>
		<li>İyi bir fırça kullanarak, bir su banyosu manipüle ve dilim seçmek için oda sıcaklığında bölümleri yerleştirin.</li>
		<li>Mikroskop kaydıraklı su banyosu bölümlerden almak ve germe için 42 ° c su banyosu içine aktarabilirsiniz.</li>
		<li>Su banyosundan bölümleri kaldır ve yavaşça yapışma mikroskop slaytlar koyun.</li>
		<li>Slaytlar 37 ° C'de bölümleri tamamen bağlı kalmak izin vermek için bir gecede de fırında kuru, aksi takdirde, onlar boyama sırasında kayıp alabilirsiniz. Not: 4 ° C'de slaytları yordamlar boyama başlangıç kadar depolama.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Deparaffinization ve X-Gal-lekeli parafin bölümlerini Counterstaining<ol>
<li>Bir fırın daha sıvı Parafin balmumu yapmak en az 45 dakika için 60 ° C'de mikroskop-slayt tepside slaytları koymak.</li>
		<li>Slaytlar bir raf üzerine transfer edecek ve yemekleri boyama cam aşağıdaki adımları gerçekleştirmek için: konsantrasyonları tam parafin kaldırma ve dokuları hidrasyon için azalan alkoller içeren boyama kavanoz rafa batırılma: isopropanol 5 min için 60 ° C; isopropanol 3 dk için; % 100 etanol 2 min için; 1 dk. için % 96 etanol; % 70 etanol için oda sıcaklığında 1 dak.</li>
		<li>İki kez yok alkol artıkları olduğundan emin olmak için distile su bölümlerde durulayın.</li>
		<li>Bölümleri (Örneğin nükleer hızındaki kırmızı çözüm) (Şekil 2) Oda sıcaklığında (genellikle 3-8 dk arasında) 5 min için bir leke ile counterstain. Not: Bu boyama bölümleri genel doku yapısı ortaya çıkarmak için yardımcı olur.</li>
		<li>Boyama sonra slaytlar 1 dk. için distile suda yıkayın ve mikroskobu boyama bölümüne bakın. Not: istediğiniz boyama çok zayıf ise, counterstain daha uzun süre bölümleri.</li>
		<li>Etanol konsantrasyonları artan ile aşağıdaki serisi bölümlerde kurutmak: iki yıkar % 95 etanol için 2 dk içinde iki % 100 etanol için 2 dk içinde yıkar ve mavi eriterek önlemek için renk precipitates, ksilen içinde sadece bir hızlı yıkama.</li>
		<li>Raf tek tek slaytları kaldırmak ve bir kağıt parçası koyun. Sonra mount ve coverslip her bir sentetik, kalıcı montaj orta kullanarak kaydırın. Not: Ksilen rahatsız edici ve insan sağlığı ve Sucul organizmalar için zararlı olan buharlar yanıcı bir üründür. Bu bir başlık içinde manipüle edilebilir gerekir ve uygun koruyucu ekipman kullanımı gerektirir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip mali niyetimiz yok bildirin.

E. coli LacZ gene yaygın gen ifade kalıplarının çalışmalarda bir muhabir olarak kendi yüksek hassasiyet ve algılama kolaylığı nedeniyle kullanılmıştır. Mevcut Protokolü β-gal ifade yanı sıra ucuz gerçekleştirmek hızlı ve kolay bir enzimatik reaksiyon dayalı tespit için klasik bir yöntem açıklanır. Bu yöntem bütün Dağı embriyolar, sağlam organları, cryostat doku bölümleri veya kültürlü hücreler büyük değişiklik yapmadan da uygulanabilir.
Bu yöntemin doğru uygulama içinde bir boyama sağ...

Belirli bir gen ifade desenlerini tanımlamak için muhabir gen işaretleyici olarak kullanımı memeliler Drosophila en önemli olmuştur. Transgenik ve nakavt hayvanların deneylerde, Escherichia coli (e.coli) bakteriyel β-galaktozidaz gen (LacZ) en çok kullanılan1,2,3, biridir 4. β-galaktozidaz (β-gal) tromboksan β-galactosides (laktoz gibi) hidroliz onun bol (glikoz ve galaktoz)5. En sık kullanılan, substrat X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), β-galaktozidaz veren yükselmeye 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole ve galaktoz tarafından hidrolize bir parçalanma olduğunu. İlk bir dimer okside, kullanıldığında potasyum ferri ile kombine- ve ferro-siyanür, karakteristik çözünmez üretir, mavi renk çökelti (Şekil 1)6.
Otuz yıl önce bir muhabir gen kullanılacak LacZ gene başladı7,8. Genellikle, LacZ eklenen aşağı endojen bir organizatörü açık okuma çerçevesi yerine belirli bir INSERT içeren hücreler görselleştirmek için bakteri ve hücre kültür yanı sıra transjenik hayvanlar, endojen bir izleyici kullanılabilmesi için bu yüzden gen ifade desen geliştirme9sırasında. Bu bağlamda, β-galaktozidaz etkinliği görselleştirme kapsamlı Drosophila içinde tek hücrelerden gelişimsel ve hücresel süreçler tüm dokulara anlamak için kullanılmıştır. Drosophila genetik kararlı hatları içinde LacZ değil muhabiri gen içeren değiştirilmiş bir P-öğe yapısı eklenen rasgele genom yerlerde nesil lehine. Böylece, artırıcı unsurların etkisi altında yerleştirildiğinde bu ifadesini birçok genlerin ifade kalıplarının sistematik analizi sırasında son yirmi yılda10izin verdi bir doku belirli şekilde sürücü. Buna ek olarak, LacZ gen ekspresyonu izlemek için transgenik fareler de gen rekombinasyon olaylar Cre-loxP tarafından algılanmasını rekombinasyon ve yerelleştirme chimeric analizlerde mutasyona uğramış embriyonik kök hücre türevleri aracılı kullanılmasına 11, hangi geçici olarak de LacZ ifade belirli dokularda kontrolünü kolaylaştırır. Ayrıca, tüm embriyoların, algılama β-galaktozidaz faaliyetinin uygun gen ekspresyonu zamansal değişiklikleri analiz etmek için farklı gelişim dönemleri arasında gözlenen farklı yoğunluklarda, farklı boyama desenleri neden olabilir 8,12.
Bu makalede, biz bütün Dağı dokusunda fare embriyo erken gelişim aşamalarında boyama gen ekspresyonu ile X-gal görselleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Biz histochemical bu yöntem doku veya embriyo parafin gömülü sonra bütün Dağı örnekler veya hücresel düzeyde etiketli hücrelerinin doğru algılama iyilik bir son derece hassas ve ucuz teknik mevcut. Yöntemi diğer yöntemleri13ile karşılaştırıldığında en az arka plan ile fare dokusunda boyama doğrudan görüntüleme için sağlar.

<table><tbody><tr><td><güçlü >REAKTİFLER< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>24137-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>SCHARLAU</td><td>50004 / LE3Q2014</td><td></td></tr><tr><td>Sulu montaj ortamı</td><td>VECTOR LABS</td><td>H-5501</td><td></td></tr><tr><td>Sentetik montaj ortamı</td><td>MERCK</td><td>100579</td><td></td></tr><tr><td>%96 Etanol</td><td>PROLABO</td><td></td><td></td>20824365</tr><tr><td>%99,9 Etanol mutlak</td><td>SCHARLAU</td><td>ET00021000</td><td></td></tr><tr><td>%50 Gluteraldehit çözeltisi</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G6403-100ml</td><td></td></tr><tr><td>%85 Gliserol</td><td>MERCK</td><td>104094</td><td></td></tr><tr><td>%99,9 Gliserol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür hekzahidrat</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>63064</td><td></td></tr><tr><td>Noniyonik yüzey aktif madde (Nonidet P-40)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>542334</td><td></td></tr><tr><td>Nükleer Hızlı Kırmızı karşı leke</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>N3020</td><td></td></tr><tr><td>Parafin pastilleri</td>, <td>MERCK</td><td>111609</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>158127-500g</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (tabletler)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P4417-50TAB</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum ferrosiyanat</td><td>MERCK</td><td>1049840500</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum ferrosiyanür</td><td>MERCK</td><td>1049731000</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum azid</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum deoksikolat</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum dihidrojen fosfat monohidrat</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>106346</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat dibazik dihidrat</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>71638</td><td></td></tr><tr><td>Thymol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T0501</td><td></td></tr><tr><td>Tris hidroklorür (Tris HCl)</td> <td>SIGMA-ALDRICH</td><td>10812846001 (Roche)</td><td></td></tr> <tr><td>X-GAL</td><td>VENN NOVA</td><td>R-0004-1000</td><td></td></tr><tr><td>Ksilen</td><td>VWR KİMYASALLARI</td><td>VWRC28973.363</td><td></td></tr><tr><td><güçlü > EKİPMANLAR< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tek kullanımlık plastik kriyokalıplar 15x15x5 mm</td><td>SAKURA</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>Döner Mikrotom</td><td>Leica</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>Kasetler</td><td>Oxford Trade</td><td>OT-10-9046</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Kapak Camları 24x60 mm</td><td>VWR</td><td>ECN631-1575</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop slaytları</td><td>Thermo Scientific, MENZEL-GL&Auml; SER</td><td>AGAA000001#12E</td><td></td></tr><tr><td>Yapışma mikroskobu slaytları</td><td>Thermo Scientific, MENZEL-GL&Auml; SER</td><td>J1820AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Flotasyon Su banyosu</td><td>Leica</td><td>HI1210</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Düşük Profilli Mikrotom Bıçakları</td><td>Tüy</td><td>UDM-R35</td><td></td></tr><tr><td>Parafin fırını</td><td>JR SELECTA</td><td></td><td></td></tr> 2000205 <tr><td>Balmumu Parafin dağıtıcısı</td><td>JR SELECTA</td><td></td><td></td></tr> 4000490 <tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>DM500</td><td></td></tr><tr><td>Polipropilen mikrosantrifüj tüpleri 2.0 mL</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T2795</td><td></td></tr><tr><td>Polipropilen mikrosantrifüj tüpleri 1.5 mL</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T9661</td><td></td></tr><tr><td>Orbital çalkalayıcı</td><td>IKA Labortechnik</td><td>HS250 BASIC</td><td></td></tr><tr><td>Karıştırma Sıcak Plakası</td><td>Bibby</td><td>HB502</td><td></td></tr><tr><td>Vorteks Çalkalayıcı</td><td>IKA Labortechnik</td><td>MS1</td><td></td></tr><tr><td>Laboratuvar terazisi</td><td>GRAM</td><td>FH-2000</td><td></td></tr><tr><td>Hassas terazi</td><td>Sartorius</td><td>ISO9001</td><td></td></tr><tr><td>pHmetre</td><td>Crison</td><td>Basic 20</td><td></td></tr><tr><td>Optik fiber</td><td>Optech</td><td>PL2000</td><td></td></tr></tbody></table>

tüm fare embriyo etkinliğinde β-galaktozidaz tespiti yoluyla gen ifadesinin izleme

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Escherichia coli LacZ gene, β-galaktozidaz, kodlama büyük ölçüde gen ekspresyonu için muhabirlik ve hücre lineage çalışmalarda bir izleyici olarak kullanılır. Klasik histochemical reaksiyon görselleştirmek kolay bir çözünmez mavi çökelti üreten demir ve demir iyonları, birlikte substrat X-gal hidroliz temel alır. Bu nedenle, geliştirme ilerledikçe β-galaktozidaz etkinliği ilgi gen ifade desenini avans olarak hizmet vermektedir. Burada erken tüm fare embriyo etkinliğinde β-galaktozidaz tespiti için standart protokol ve kesit ve counterstaining parafin için sonraki yöntemi açıklanmaktadır. Ayrıca, tüm embriyoların açıkladığınız için bir yordam X-gal embriyo, daha derin bölgelerinde boyama daha iyi görmek için sağlanmıştır. Reaksiyon koşulları duruma getirilmesi arka plan etkinliği en aza indirmek için gerekli, ancak tutarlı sonuçlar bu yordamı uygulanarak elde edilir. Tahlil sınırlamalar da, özellikle bütün Dağı boyama içinde embriyo boyutu ile ilgili olarak düşünülmelidir. Bizim iletişim kuralı bir duyarlı ve daha fazla cryostat bölümler hem de bütün organları uygulanabilir fare geliştirme sırasında β-galaktozidaz algılama için güvenilir bir yöntem sağlar. Böylece, dinamik gen ifade desen geliştirme boyunca tüm embriyoların bu protokolü kullanarak kolayca çözümlenebilir, ama Ayrıca hücresel düzeyde ayrıntılı ifade parafin kesit sonra tespit edilebilir.

İşte tüm fare embriyo (resim 1 ve Şekil 2) substrat olarak X-gal kullanarak β-galaktozidaz histochemical reaksiyon için standart protokol uygulanmasının sonuçları göstermektedir. Bu iletişim kuralını kullanarak, biz membran tipi 4-Matriks metalloproteinaz (Mt4-mmp) ifade farklı embriyonik gelişim dönemleri (E9.5, E11.5 ve E12.5) de incelemek LacZ muhabir endojen kontrolü altında hızlı Mt4 mmp mutant fare kullanarak MT4 mmp organi...

Burada erken tüm fare embriyo etkinliğinde β-galaktozidaz tespiti için standart protokol ve kesit ve counterstaining parafin için yöntemi açıklanmaktadır. Gen ekspresyonu doku bölümlerine de uygulanabilir geliştirme sırasında izlemek için kolay ve hızlı bir prosedür bu organ veya kültürlü hücreleri.

Tüm fare embriyo etkinliğinde β-galaktozidaz tespiti yoluyla Gen ifadesinin izleme

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Bu yöntem, embriyonik gelişim sırasında gen ekspresyon modellerinin incelenmesi gibi gelişimsel biyoloji alanındaki temel sorulara cevap verebilir. Bu tekniğin temel avantajları, son derece hassas, kolay ve hızlı bir şekilde gerçekleştirilmesi ve numunenin parafin kesitinden sonra tüm montaj dokusunda veya daha yüksek çözünürlükte lekelenmenin doğrudan görüntülenmesine izin vermesidir. Prosedürü gösterecek olan Dr Maria Jose Blanco, Dr Anabel Learte, Dr Emma Munoz ve Dr Miguel Marchena olacak. Galaktosidaz eksprese eden glutaraldehit ile sabitlenmiş transgenik embriyoları taze hazırlanmış X-gal durulama tamponunda oda sıcaklığında 10 dakika inkübe ederek başlayın. Enzimatik reaksiyon için negatif kontroller olarak vahşi tip çöpten yapılmış embriyoları kullanın. Daha sonra, durulama tamponunu pH 8-9'da X-gal boyama solüsyonu ile değiştirin.Işıktan koruyun ve 2 saat ila gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin

tracing-gene-expression-through-detection-galactosidase-activity

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Biz hızla belirlemek ve fare embriyonik kök hücre bakım ve kendini yenileme düzenleyen genlerin karakterize bir floresan reporter assay açıklar.

Fare Embriyonik Kök Hücre Bakım ve Kendini yenileme Regulate Genler Okumak Oct4GiP Reporter Assay

Bu video, fare embriyolarında retinoik asit aktivitesini değerlendirmek için bir teknik göstermektedir. Fare embriyolarından hücreler izole edildikten sonra, hücreler retinoik asit (RA) raportör hücreleri ile birlikte kültürlenir. Embriyonik hücreler, raportör hücrelerde beta-galaktosidaz ekspresyonunu indükleyen ve embriyonik hücrelerde RA aktivitesini gösteren RA üretir.

Fare embriyonik hücreleri tarafından retinoik asit üretimini incelemek için bir ko-kültürde raportör hücrelerin kullanılması

Burada, genetik olarak tasarlanmış farelerin geliştirilmesinde duyusal akson büyüme fenotiplerini değerlendirmek için etkili bir yöntem olarak, tüm hayvanda periferik nosiseptör akson projeksiyonlarının görüntülenmesi için fetal fareleri genotiplemek, boyamak ve hazırlamak için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz.

Fare Embriyo Duyu Akson Projeksiyonlar tüm montaj Görüntüleme

İkili bir genetik stratejiden yararlanarak, Cre aracılı rekombinasyondan sonra tamamlayıcı transsinaptik izleyicileri eksprese eden farelerde nöral devre izleme için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz. Hücreye özgü izleyici üretimi genetik olarak kodlandığından, deneysel yaklaşımımız, murin embriyonik beyin gelişimi sırasında tek hücre çözünürlüğünde nöral devrelerin oluşumunu ve olgunlaşmasını incelemek için uygundur.

Embriyonik Fare beyninde İzleme Koşullu Genetik transsinaptik

Bu protokol Fare preimplantasyon embriyolar soy özellikleri çalışma protein ekspresyonu in situ analiz kantitatif, tek hücreli gerçekleştirmek için bir yöntem sunmaktadır. blastosist toplanması için gerekli işlemler, proteinlerin immunofluorescent algılama tüm montaj, bir konfokal mikroskop ve nükleer segmentasyon ve görüntü analizi örneklerin görüntüleme açıklanmıştır.

Protein İfade Kantitatif Analiz Fare Preimplantasyon Embriyolar Lineage Şartname Eğitim için

Bu protokolün amacı, bir kaybı: tanımlamak ve kazanç-of trofoektoderm ve preimplantasyon fare embriyoları iç hücre kütlesi farklılaşma yol açan bir sahne özgü reseptör olarak neogenin tanımlamak için de geçerlidir fonksiyonu yöntemi etmektir.

Preimplantasyon Fare Embriyolar Erken Hücre Kader Belirleyicileri Araştırma kaybı: ve Kazanç fonksiyon-Yaklaşımı

Burada, lentiviral bir vektör perivitelline alanda bir döllenmiş yumurta, basit bir iğne ile transgene entegrasyon ve kurucusu transgenik fareler ile yüksek etkinlik üretimini teşvik için bir protokol mevcut.

Lentiviral aracılı transgenik fareler üretimi: doğrudan eğitim kurucuları basit ve son derece etkili bir yöntem

Döllenmiş yumurta fare ve erken sahne embriyolar zona pelusida, gen teslim karşı bir bariyer oluşturur bir glikoprotein matris tarafından korunmaktadır. Bu makalede, zona lentiviral vektörler ile embriyonik hücreler transduce ve transgenik fareler oluşturmak için bir lazer ile perfore için bir iletişim kuralı.

Fare Lentiviral Gene lazer destekli teslim yumurta döllenmiş

Bu makale, tek hücrelerin ve çekirdeklerin dizilimi için gastrulasyon yapan fare embriyolarının yüksek kaliteli tek hücreli ve çekirdek süspansiyonları için bir boru hattı oluşturur.

Mutant Bütün Fare Embriyolarının Tek Hücreli RNA Dizilimi: Epiblasttan Gastrulasyonun Sonuna Kadar

Erken embriyogenezde tek hücrelerde zigotik genom aktivasyonu sırasında yeni başlayan transkripsiyonu görselleştirme yöntemlerini açıklıyoruz.

Erken Embriyoların Tek Hücrelerinde Zigotik Genom Aktivasyonunun Görselleştirilmesi

Öğrenin, fare embriyolarında β-galaktozidaz aktivitesi tespitiyle gen ifadesi izleme yöntemini. Bu protokol, gelişim biyolojisi araştırmalarında hızlı ve güvenilir sonuçlar sağlar.

Tüm fare embriyo etkinliğinde β-galaktozidaz tespiti yoluyla Gen ifadesinin izleme

Daha fazla video keşfet