Biotin tabanlı açılan tahlil için Doğrula mRNA hedefleri hücresel miRNAs

Bu yöntem, in silico olarak tahmin edilen mRNA hedefinin belirli bir hücresel mikroRNA ile doğrudan etkileşime girip giremeyeceği gibi mRNA biyolojisi alanındaki temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir. Bu yöntemin ana avantajı, hedef mRNA'yı aşağı çekmek için biyotinile edilmiş taklitler kullanmasıdır. Ve bu biyotinile taklitler, reaksiyonun özgüllüğünü artırabilen çok yüksek bir afiniteye sahip çok kararlı oligonükleotidlerin oluşumuna yardımcı olan kilitli nükleik asitlere veya LNA bazlı taklit kimyasına sahiptir.

Bu metodolojinin çıkarımları, mikroRNA'nın biyolojisini anlamaktan mikroRNA bazlı terapötiklere kadar uzanabilmesidir. Bunun temel nedeni, hepimizin mikroRNA'ların hücresel biyolojinin her alanında kritik roller oynadığını bilmemizdir. Dolayısıyla, mikroRNA'ların hedeflerini belirleyerek, bunlar mRNA'lardır, keşif ve terapötikler için önemli olacak kritik bilgileri kesinlikle sağlayabiliriz.

Protokolü gösteren, laboratuvarımızdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Sabyasachi Dash olacak. Manyetik boncukları streptavidin ile kaplamak için, önce boncukları yeniden süspanse etmek için iyice girdaplayın. Ardından, yeniden asılı boncukların 30 mikrolitresini iki milimetrelik nükleaz içermeyen bir mikrofüj tüpüne aktarın.

Manyetik boncuk süspansiyonu ile doldurulmuş tüpü mıknatıs üzerinde iki dakika bekletin. İki dakika sonra, boncuklar mıknatısla temas edecek şekilde tüpün kenarına çekildiğinde süpernatanı bir mikropipet yardımıyla çıkarın. Daha sonra boncuklara 100 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin.

Yıkama tamponunu ekledikten sonra, tüpü mıknatıstan çıkarın. Ardından, boncukları yıkamak için 15 saniye boyunca vorteksleyin. Ardından, manyetik boncukları içeren tüpü mıknatıs üzerine iki dakika boyunca aktarın.

Kuluçka bittikten sonra, süpernatanı pipetleyin ve atın. Ardından, boncuklara 100 mikrolitre RNase serbest bırakma solüsyonu ekleyin. RNase çözeltisini karıştırmak için boncukları 15 saniye boyunca vorteksleyin.

Daha sonra boncukları oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Beş dakikalık inkübasyondan sonra, manyetik boncukları içeren tüpü mıknatıs üzerine iki dakika boyunca aktarın. Kuluçkadan sonra, süpernatanı pipetleyin ve atın.

Daha sonra, boncuklara 100 mikrolitre yeniden süspansiyon çözeltisi ekleyin ve 15 saniye boyunca girdap yapın. Girdaplamadan sonra, tüpü oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Beş dakika sonra, manyetik boncukların bulunduğu tüpü mıknatıs üzerine iki dakika boyunca aktarın.

İki dakika sonra, süpernatanı pipetleyin ve atın. Ardından, boncuklara 200 mikrolitre boncuk engelleme çözeltisi ekleyin. Blokaj solüsyonundaki boncukları yeniden süspanse etmek için, oda sıcaklığında 15 saniye boyunca iyice girdaplayın.

Ardından, tüpü 16 saat boyunca dört santigrat derecede çok tüplü bir döndürücüde bırakın. Lizatı hazırlamak için, bir hücre kazıyıcı kullanın ve transfekte edilmiş HEK293T hücrelerini laminer kaputun altına kazıyın. Ardından, hücre süspansiyonunu iki mililitrelik bir mikrofüj tüpüne aktarın.

Daha sonra, hücre süspansiyonunu beş dakika boyunca 1.500 g'da santrifüjlemeye tabi tutun. Santrifüjleme sonrası, hücre peletini pH 7.2'de tutulan 1x fosfat tamponlu salin içinde çözün. Artık ortamsız bir pelet elde etmek için santrifüjleme işlemini tekrarlayın.

Santrifüjleme bittikten sonra, peleti hızlı bir şekilde buz üzerine aktarın. Ardından, taze hücre lizis tamponu hazırlayın. Tamponu hazırladıktan sonra, mikrofuj tüpündeki numuneye 260 mikrolitre tam hücre lizis tamponu ekleyin.

Homojen süspansiyon için hücre peletini birkaç kez pipetleyin. Hücreleri parçalamak için, tüpleri 80 santigrat derecede 10 ila 15 dakika inkübe edin. Ardından hücreleri buzun üzerinde bırakın.

Santrifüjleme işlemini 16.000 g'da dört santigrat derecede bir tezgah üstü santrifüjde beş dakika boyunca tekrarlayın. Santrifüjlemeden sonra, lizat içeren süpernatanı steril bir 1.7 mililitrelik mikrofüj tüpüne buz üzerine aktarın ve peleti dışarı atın. Süpernatanın, bir molarin nihai konsantrasyonunu elde etmek için beş molar sodyum klorür ekleyin.

İlk olarak, aşağı açılır yıkama tamponunu hazırlayın. Boncuk blokajı sonrası gece boyunca inkübasyondan sonra, manyetik boncukları içeren tüpü mıknatıs üzerine iki dakika boyunca aktarın. Kuluçka döneminden sonra süpernatanı atın.

Boncuklara 150 mikrolitre buz gibi soğuk aşağı çekme tamponu ekleyin. Ardından, boncukları oda sıcaklığında 15 saniye boyunca girdaplayın. Ve hemen oda sıcaklığında 30 ila 60 saniye inkübe edin.

Bir dakika sonra, manyetik boncukları içeren tüpü mıknatıs üzerine iki dakika boyunca aktarın. Kuluçka döneminden sonra süpernatanı atın. Ardından, boncukları 300 mikrolitrelik tam aşağı çekme tamponunda yeniden süspanse edin.

Sodyum klorür ekledikten sonra, 300 mikrolitre hücre lizatını 300 mikrolitre boncukla doldurulmuş bir mikrofüj tüpüne aktarın. Daha sonra karışımı oda sıcaklığında bir saat somun sıkma mikserinde bırakın. Bir saat sonra, tüpü mıknatısın üzerine beş dakika boyunca aktarın.

Kuluçka döneminden sonra süpernatanı atın. Ardından, boncuklara 300 mikrolitre buz gibi soğuk tam açılır yıkama tamponu ekleyin. Tampon eklendikten sonra, boncukları oda sıcaklığında 15 saniye boyunca vorteksleyin.

Ardından, tüpü beş dakika boyunca mıknatısın üzerine yerleştirin. Kuluçka döneminden sonra süpernatanı atın. Daha sonra boncukları 100 mikrolitre nükleaz içermeyen suda çözün ve buz üzerinde saklayın.

Toplam RNA'yı boncuklardan izole edin. Daha sonra izole edilen RNA'yı 25 mikrolitre nükleaz içermeyen suda çözün. Ardından, spektrofotometredeki RNA konsantrasyonunu ölçün.

Son olarak, RNA'nın çalışma stoğu çözeltisini mikrolitre başına 50 nanogramda hazırlayın. Daha sonra, üreticinin talimatlarını izleyerek tamamlayıcı DNA sentezlemek için toplam izole edilmiş RNA'nın 50 nanogramını kullanın. Ardından, 20 mikrolitrelik son hacme oligo primerleri ekleyin.

PCR tüpünü termocycler'a yerleştirin ve çalıştırmaya başlayın. qPCR tamamlandıktan sonra, plakanın her bir oyuğuna dokuz mikrolitre PCR reaksiyon karışımı aktarın. Her oyuğa, 10 mikrolitrelik bir son hacim elde etmek için bir mikrolitre ücretsiz DNA ekleyin.

Ardından, PCR plakasını kapatmak ve termocycler'a yüklemek için ısıya dayanıklı PCR plaka kapatıcı kullanın. Ardından, programı termocycler'da başlatın. miR-125b'nin hedeflerini doğrulamak için, PARP-1 ve p53'ün hedef mRNA'larının ekspresyon seviyeleri incelenmiştir.

İlginç bir şekilde, PARP-1 ve p53 mRNA'ların ekspresyon seviyeleri, negatif kontrol olan Aktin mRNA'dan nispeten daha yüksektir. Deneyde kullanılan diğer negatif kontroller şablon değildir ve üç ana biyotinile karıştırılmış dizidir. Ek olarak, PARP-1 ve p53'ün niceliksel olarak ölçülmüş üç ana çevrilmemiş bölgesi de değişen seviyelerde amplifikasyon gösterir.

Bu, Aktin, şablon yok ve üç ana biyotinile karıştırılmış dizi gibi negatif kontrollerle karşılaştırılır. PARP-1 ve p53'ün bu amplifikasyonu, bunların hücresel miR-125b'nin güçlü hedefleri olduğunu gösterir. Bir kez ustalaştıktan sonra, hücrelerin kaplanması ile başlayan, biyotin etiketli LNA taklitlerinin transfeksiyonuna kadar uzanan ve PCR analizi ile sonuçlanan bu teknik, uygun şekilde yapılırsa bir hafta içinde yapılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, memeli hücrelerinde varsayılan mRNA hedeflerinin nasıl doğrulanacağını iyi anlamış olmalısınız. Bu, memeli hücrelerinde üç ana biyotin etiketli kilitli nükleik asit taklidi bazlı transfeksiyonun tanıtılmasıyla yüksek özgüllük ve düşük gürültü oranı ile elde edilebilir. RNA ile, özellikle mikro RNA'lar gibi küçük RNA'larla çalışmanın oldukça hassas ve bozulmaya eğilimli olabileceğini unutmayın.

Bu nedenle, bu test yapılırken nükleaz içermeyen su, nükleaz içermeyen mikrofüj tüpleri ve steril tamponlar gibi gerekli önlemler alınmalı ve daha iyi duyarlılık ve daha iyi sonuçlar elde etmek için bu test yapılırken taze hazırlanmış tamponlar ve reaktifler göz önünde bulundurulmalıdır.