Yanıt olarak lokalize kalsiyum iyon degradeler dev veziküller membran Remodeling

Lokalize kalsiyum iyon gradyanları kullanarak dev veziküllerin manipülasyonu için bir teknik sunuyoruz. Bu tekniğin ana avantajı, vezikül yüzeyinin tamamen temassız olarak uyarılması ve kalsiyum iyonları ile etkileşim üzerine lipid zarının yeniden şekillenmesinin doğrudan görselleştirilmesidir. Yaklaşımımız, hücre mikro ortamındaki değişiklikler üzerine hücre zarının yeniden şekillenme mekanizmalarını incelemek için yeni mekanlar sağlayarak, kalsiyum iyon zarı etkileşimlerinin ayrıntılarını ele almak için bir araç sunar.

Bu işleme başlamak için, kloroformda bir lipit çözeltisi hazırlayın. Kloroformdaki nihai lipit konsantrasyonu mililitre başına bir miligramdır ve son kütle 0.6 miligramdır. İçeriği ortam ışığından korumak için lipit karışımını içeren cam şişeyi metal folyo ile sarın.

Metal folyoya sarılmış numune şişesini bir cam kabın içine yerleştirin. Kloroformu çıkarmak için, çözücüyü döner bir buharlaştırıcıda üç saat boyunca buharlaştırın ve basınç 80 rpm'de yedi kilopaskal vakuma ulaşır. Buharlaşmadan sonra cam şişenin dibinde kuru bir lipit filmi oluşur.

Kurutulmuş lipit filmin üzerine yavaşça 600 mikrolitre fosfat tamponlu salin solüsyonu ekleyin. Tamponun eklenmesini takiben, çok katmanlı bir veziküle veya GUV-MLV'ye bağlı dev bir unilamellar vezikül oluşumu sırasında numuneyi tam dehidrasyondan korumak için yavaşça altı mikrolitre gliserol ekleyin. Cam şişeyi Parafilm kullanarak kapatın.

Ve ortam ışığından korumak için metal folyo ile örtün. Şişeyi gece boyunca dört santigrat derecede saklayın. Ertesi gün, oda sıcaklığında bir ultra-sonication banyosu kullanarak çözeltiyi içeren cam şişeyi bir dakika boyunca sonikasyona tabi tutun.

Parafilmi çıkarın ve görsel olarak homojen bir küçük lipid vezikül çözeltisi oluşana kadar pipetleyin. Elde edilen küçük lipid vezikül çözeltisinin 30 mikrolitresini ayrı ayrı 0,5 mililitrelik plastik tüplere alın. Oda sıcaklığında küçük lipid veziküllerinin donmuş süspansiyonunun bir alikotunu içeren plastik bir tüpü çözün.

Maksimum hızda bir girdap karıştırıcı kullanarak tüpü bir ila iki saniye boyunca dört kez vorteksleyin. Küçük, yuvarlak bir damlacık oluşturmak için küçük lipid vezikül süspansiyonunun beş mikrolitresini bir cam kapak kaymasının yüzeyine yerleştirin. Herhangi bir ön temizleme adımı olmadan bir cam lamel kullanın.

Şimdi, cam lamel 20 dakika boyunca bir vakumlu desikatöre yerleştirin. Kurutulmuş lipit filmi oda sıcaklığında dört dakika saklayın. Ardından, rehidrasyon için kuru lipit filmin üzerine 50 mikrolitre 10 milimolar HEPES tamponunu yavaşça pipetleyin.

GUV-MLV komplekslerini hazırlamak için beş dakika bekleyin. Mikroskobun tablasında bir cam lamel ortalayın. Ardından, üzerine 300 mikrolitre HEPES tamponu pipetleyin ve damlacığın merkezini objektifin üzerine yerleştirin.

50 mikrolitre önceden oluşturulmuş GUV-MLV solüsyonunu HEPES solüsyonuna aktarın. Seyrek şekillendirilmiş GUV-MLV komplekslerinin cam lamel yüzeyine sıkıca yapışmasını sağlamak için 25 dakika bekleyin. Mikropipeti mikropipet tutucuya takarken kırılmasını önlemek için kılcal uçları bir mum alevine nazikçe yerleştirerek borosilikat cam kılcal damarların kenarlarını yuvarlayın.

Otomatik bir lazer çektirme kullanarak en az üç cam kılcal damarı çekin. Uç açıklığı yaklaşık 0,3 mikron çapında olan bir mikropipet elde etmek için metinde atıfta bulunulan borosilikat cam kılcal damarları kullanın. Pipet ucunun tıkanmasını önlemek için, kullanmadan önce 0,2 ila 0,5 mikronluk bir şırınga filtresi kullanarak HEPES tampon çözeltisinde beş milimolar kalsiyum klorür çözeltisini filtreleyin.

Ardından, bir Mikro Yükleyici kullanarak her bir mikropipeti sekiz mikrolitre kalsiyum klorür çözeltisiyle geri doldurun. Bir mikropipet tutucuyu bir mikromanipülatöre bağlayın. Mikropipeti mikropipet tutucuya sıkıca monte edin.

Ardından besleme borusunu kullanarak enjeksiyon pompasını ve kılcal tutucuyu bağlayın. Enjeksiyon pompasını çalıştırdıktan sonra, enjeksiyon pompasındaki ayarları 20 hektopaskal enjeksiyon basıncına ayarlayın. Ayrıca beş hektopaskal dengeleme basıncı ayarlayın.

Mikroskobu parlak alan moduna ayarlayın. Diferansiyel girişim kontrastı için yapılandırın. Mikropipeti GUV-MLV komplekslerini içeren damlacığın üzerine yerleştirmek için kaba mikromanipülatörü kullanın.

Mikropipetin ucunu objektifin üzerine yerleştirin ve kaba mikromanipülatörü kullanarak pipeti damlacığa indirin. Mikroskobu floresan moduna ayarlayın. MTP'lerin oluşmasına izin vermek için mikropipetten kalsiyum klorür çözeltisini enjekte ederken mikropipet ucunu zar yüzeyinden üç mikron uzağa yerleştirin.

MTPS'yi GUV yüzeyi boyunca çevirmek için, ince mikromanipülatörü kullanarak pipet ucunu GUV yüzeyi etrafında yavaşça hareket ettirin. Kalsiyum iyonu enjeksiyonuna devam ederken GUV yüzeyi ile mikropipet ucu arasında yaklaşık olarak aynı mesafeyi koruyun. Mikroenjeksiyonu durdurmak için enjeksiyon pompasını kapatın.

Bir cam lamel yüzeyinde hareketsiz hale getirilmiş bir GUV-MLV kompleksinin temsili bir floresan mikroskobu görüntüsü burada gösterilmektedir. GUV yüzeyinde kalsiyum iyonlarının lokalize enjeksiyonu üzerine oluşan membran tübüler çıkıntıları bu görüntülerde görülebilir. Mikropipet ucunun okla gösterildiği gibi zarın yüzeyi etrafındaki translasyonu, zar boru şeklindeki çıkıntıların kalsiyum iyon kaynağı yönünde hareketini tetikler.

Özetlemek gerekirse, kalsiyum iyonları ile lokalize stimülasyon üzerine membran tübüler çıkıntıların oluşumu ile sonuçlanan dev lipid veziküllerinin temassız membran yeniden şekillenmesine izin veren bir teknik öneriyoruz. Bu yöntemin gelecekteki uygulamaları arasında sentetik lipid veziküllerden doğal biyolojik membranlara geçiş veya bu yaklaşımın temassız mikromanipülasyon platformları geliştirmek amacıyla polimerik sistemlere uygulanması yer almaktadır.