Sağlıklı beyin hipofiz dilimleri Teleost balık hipofiz hücreleri elektrofizyolojik araştırmalar için

Hipofiz hücreleri ile yama-klemp tekniği kullanarak elektrofizyolojik kayıtlar ardından kalıcı beyin hipofiz doku dilimleri, teleost balık medaka (Oryzias latipes), kullanarak yapmak için en iyi duruma getirilmiş bir protokol makalede delikli yama yapılandırma.

Bu yöntem, nöroendokrinoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Hipofiz hücreleri nasıl iletişim kurar, beyinden salınan faktöre nasıl tepki verir? Bu tekniğin temel avantajı, bu ilk birincil hücre kültürüne kıyasla, bu prosedürün hücrelerin daha sağlam bir ortamda araştırılmasına izin vermesidir.

Her ne kadar bu yöntem Medaka'daki luteinize edici hormon üreten hücrelerin elektriksel özellikleri hakkında fikir verebilir. Sadece küçük ayarlamalarla, diğer hücre türleri veya diğer balık türleri için de kullanılabilir. Diseksiyon mikroskobu altında etanol sterilize edilmiş güçlü forsepsli ötenazi Teleost balığını tutarken, gözlerin arkasındaki iki optik siniri keskin forsepslerle kesin ve kafatası kemiklerini arkadan ön tarafa doğru kırın.

Kafatasını soymak ve omuriliği koparmak için forseps kullanın. Omuriliği forseps ile nazikçe kavrayarak beyni posteriordan anterior yöne çevirin ve organı buz gibi, kalsiyum içermeyen, ekstra hücresel ortamla dolu bir kaba yerleştirin. Daha sonra, bir nokta beş ila iki santimetre küp metal tutucuyu sıvı agaroz ile doldurun ve kalıbı buzun üzerine yerleştirin.

Agaroz katılaşmadan hemen önce, beyni omurilikten nazikçe almak için forsepsleri kullanın, forsepsleri bir parça laboratuvar kağıdı ile kurulayın ve beyni agarozun içine yerleştirin. Daha sonra, doku üzerinde kalan ekstra hücresel ortam izlerini seyreltmek için agarozu hızlı bir şekilde karıştırın ve beynin kalıp içindeki yönünü gerektiği gibi ayarlayın. Agaroz katılaştığında, dokunun etrafına kare bir agaroz bloğunu kesmek için bir neşter bıçağı kullanın ve numuneyi bir vibratom numune tutucusuna yapıştırmak için cerrahi yapıştırıcı kullanın.

Vibratom tutucunun küvetini buz gibi, kalsiyum içermeyen ekstra hücresel ortamla doldurun ve tutucuyu vibratomun içine yerleştirin. Yüksek bir frekans ve düşük bir hız kullanarak, 150 mikrometre parasagital kesitler yapmak için agaroz bloğunu kesin ve seçilen bölümü üç mililitre buz gibi, kalsiyum içermeyen ekstra hücresel çözelti içeren yama kelepçesi kayıt odalarına yerleştirin. Beyin agaroza eklendikten sonra hızlı hareket etmek önemlidir, çünkü doku kalıplanmış agarozda çok uzun süre bırakılırsa kurur ve bölümlere ayrılmadan önce havaya sınırlı erişimi vardır.

Tüm bölümler elde edildiğinde, doku bölümüne bir ızgara arpı yerleştirin ve kalsiyum içermeyen ekstra hücresel ortamı, sığır serum albümini ile desteklenmiş kalsiyum içeren ekstra hücresel ortamla değiştirin. Daha sonra dokuyu 10 dakika dinlendirin. Yama kelepçesini kurmak için, beyin hipofiz dilimi ile kayıt odasını yama kelepçesi kayıt mikroskobu aşamasına yerleştirin ve hipofiz bezini bulmak için 10X objektifi kullanın.

Topraklama elektrodunu %2 agar köprüsünden ekstra hücresel ortam banyosuna yerleştirin ve sağlıklı bir hücreyi bulmak için 40X objektifini kullanın. Amplifikatörü voltaj kelepçesi moduna ayarlayın ve conta test penceresini açın. Banyo konfigürasyonunu seçin ve pipet direncini izlemek için beş milivoltluk bir darbe kullanın.

Yama pipetinin arka kısmına Amfoterisin B ile takviye edilmiş hücre içi solüsyon eklemek için bir mikrodolgu şırıngası kullanmadan önce yama pipetinin ucunu antifungal içermeyen hücre içi ortamla doldurun. Pipet ucunun kirlenmesini önlemek ve yama pipet direncini değerlendirmek için yama pipetine hafif bir pozitif hava basıncı eklemek için bir mililitrelik bir şırınga kullanın. Pipetin ucuna herhangi bir parçacık bağlı değilse, yama pipetini hücreye yönlendirmek için mikro manipülatörleri kullanın.

Pipetin ucu hücrenin ortasından üçte bir mesafe kadar hücreye değecek şekilde hücrenin birkaç mikron üzerindeyken pipetin yeniden ayarlanması. Hücreye dokunmak için basıncı serbest bırakın ve bir sızdırmazlık sağlamak için hafif emme uygulayın. Yama pipeti içindeki pozitif basınç, hücrelere zarar verdikten yaklaşık bir dakika sonra mantar önleyici solüsyon sızıntısına neden olacağından, gigaseal'ı hızlı bir şekilde uygulamak önemlidir.

Conta yerine oturduğunda, hemen yama kelepçesi yazılımındaki yama penceresine geçin ve tutma potansiyelini eksi 50 ile eksi 60 milivolt arasında ayarlayın. Cam pipet tarafından oluşturulan hızlı kapasitansı sıfırlayın ve erişim direncini izlemeye başlamak için hücre penceresine geçin, yeterli erişimden sonra amplifikatör yazılımındaki membran kapasitansını sıfırlayın. Akım kelepçesine geçin ve I-Clamp penceresinde pipetin hızlı kapasitif akımlarının doğru değerini ayarlayın ve ortaya çıkan membran potansiyelini kontrol edin.

Daha sonra hücre, negatif 40 milivoltun altında bir zar potansiyeline sahip bir dokuya sıkıca bağlandıktan sonra, üreticinin protokolüne göre deneysel kayıtlara başlayın. Aksiyon potansiyelleri, negatif 50 ile negatif 60 milivolt arasındaki bir dinlenme potansiyelinden beş ila dokuz pikoamper akım enjeksiyonu kullanılarak hipofiz hücrelerinin bir alt kümesinde tetiklenebilir. Bu aksiyon potansiyelleri hızlı bir özete sahiptir ve yaklaşık dört ila altı dakika sonra, tetiklenen aksiyon potansiyelleri artık elde edilemez.

Amfoterisin B kullanılarak delikli yama konfigürasyonuna geçildiğinde, kaydedilen hücrelerin yaklaşık% 50'sinde spontan aksiyon potansiyelleri gözlemlenebilir ve aksiyon potansiyelleri, bir saate kadar kayıtlardan sonra bile, gözlemlenebilir bir özet olmaksızın bu hücrelerin% 95'inde tetiklenebilir. Gonadotropin salgılayan hormon bir, delikli yama konfigürasyonunda hücrelere fırlatılan puf, hücrelerin yanıtın ilk aşamasında hiper-polarize olduğu, iç depolardan kalsiyum salınımına neden olduğu ve ardından hücrelerin de-polarizasyonuna neden olduğu ve ikinci fazda bir ila iki hertz'den üç hertz'e artan aksiyon potansiyeli ateşleme frekansı. Bu prosedürü denerken, tüm çözeltilerin kullandığınız deneysel organizmanın fizyolojisine, bu durumda Medaka'ya uyarlanması gerektiğini ve bu değerin farklı sıcaklıklarda yaşayan türler arasında değiştiği için pH'a özellikle dikkat etmeniz gerektiğini hatırlamak önemlidir.