Name: Farklılaşma, bakım ve insan Retina Pigment epitel hücre Analizi: BEST1 mutasyonlar için bir tabak içinde hastalık modeli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Öğrenin, insan çok potansiyelli kök hücrelerinden retinal pigment epitel hücrelerinin farklılaşmasını ve BEST1 mutasyonlarının hastalık mekanizmalarını incelemeyi. Bu yöntem, bestrofinopatiler için tedavi stratejileri geliştirmede değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu proje NIH hibe EY025290, GM127652 ve Rochester başlangıç finansman Üniversitesi tarafından finanse edildi.

1. hPSC RPE için farklılaşma
<ol><li>Korumak ve geçit hPSCs daha önce18açıklandığı gibi. Not: tüm hücreleri (hPSCs ve hPSC-RPEs dahil olmak üzere) %5 CO2 büyüme ve farklılaşma protokolleri süresi boyunca 37 ° C'de yetiştirilen.</li>
	<li>
Farklılaşma önce önceden kaplanmış 6-şey plakaları için konfluent hPSCs bölme.
	<ol>
<li>Tabak kat, membran matris yaklaşık 1 h için buz çözme, 1:50, 4 ° C DMEM orta liquidized matris askıya için seyreltme, her şey için 800 µL kaplama karışımı ekleyin ve en az 1 h 37 ° C'de için kuluçkaya</li>
		<li>Kaplama tamamlandığında karışım Aspire edin ve hemen 1.5-2 mL orta kuyu ekleyin.</li>
		<li>HPSCs eski kültür plakalar üzerinden kaldırmak için PBS artı 0,5 mM EDTA, oda sıcaklığında 5 min için hücrelerle kuluçkaya, çözüm Aspire edin ve kültür orta ile küçük kümeleri hücrelerde resuspend.</li>
		<li>~ % 20 confluency Yeni tabaklar içinde Tohum hücreleri. Not:-20 ° C'de 100 µL aliquots membran matris depolamak ve bir 6-şey plaka kat için bir aliquot kullanın. Kaplama süre 4 h 37 ° C'de veya gecede oda sıcaklığında genişletilebilir. Askıya alma ve hPSCs 3-5 hücreler yerine tek hücreleri küçük kümeleri tohum önemlidir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücreler için tam confluency büyüdüğün zaman, farklılaşma Orta (4 mL/de) ile kültür orta yerine (Tablo 1, aktivin olmadan-A). Kültür 14 gün, Orta (4 mL/de) değiştirme 3 x / hafta. Not: HPSC plaka yoğunluğu çiftler yaklaşık her 24 h önemli hücre ölümü farklılaşma yordamı başladıktan sonra bekleniyor. Toplamları ölü hücreleri ve enkaz Wells orta değişiklikler sırasında çıplak gözle görülebilir.</li>
	<li>Gün 15 gün 28, farklılaşma orta 100 ng/mL insan aktivin-A (Tablo 1, insan aktivin-A) ile ek. Orta (4 mL/de) değiştirin 3 x / hafta.</li>
	<li>Gün 29 (Tablo 1, insan aktivin-A olmadan) başlangıç aktivin-A takviyesi durdurmak. Hücre farklılaşması ortamda 8 – 10 pigmente hPSC-RPE kümeleri (Şekil 1A-B) görününceye hafta kültür devam edin. Not: Pigmentli hücreleri kümeleri olarak bir hücre kültür plaka üzerinde küçük karanlık noktalar (Şekil 1A-B, üst) çıplak gözle görülebilir. İmza Arnavut kaldırımı şeklinde bireysel pigmentli hücreleri 20 X mikroskop (Şekil 1A-B, alt) altında görülebilir.</li>
</ol>2. izolasyon ve farklılaştırılmış RPE hücrelerinin kültür
<ol><li>Farklılaşma orta kaldırmak, yıkama bir kez PBS ile % 0.05 tripsin artı 1 U/µL her kuyuya collagenase 1 mL ekleyin ve 20-30 dk. Kaldır tripsin/collagenase 37 ° C'de kuluçkaya ve yavaşça önceden ısıtılmış RPE orta 6-şey plaka her kuyuya 2 mL ekleyin (< C0 > tablo 2). Not: ters bir mikroskop tripsin/collagenase tedavi öncesi poligonal, hPSC-RPE hücrelerinin morfolojisi izlemek için kullanın ve sonra yeterli sindirim yuvarlak haline.</li>
	<li>
Pasteur pipetler çekme cam bir Bunsen burner kullanın.
	<ol>
<li>İki elle, uzun bir (9 inç) Pasteur pipet yatay bu yüzden her iki ucunda ve Bunsen burner yukarıda tutun yaklaşık 2/3 pipet ince parçası uzunluğu aşağı.</li>
		<li>Hızlı bir şekilde cam alev yumuşak olur sonra öyle ki mikro kazıyıcı gibi bahşiş pipet (Şekil 2) yeni sonunda oluşan iki ucu ayrı, çek.</li>
		<li>Birden çok hücre"Kazıma aletleri" oluşturmak için birkaç kere tekrar edin. Sterilizasyon için % 70 etanol ile çekti pipetler sprey ve onları hücre kültür mahallede kuruması.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mikroskop altında bir mikro "hücre kazıyıcı" kullanmak yavaşça plaka kümelerden pigmente hPSC-RPE ayırmak için.
	<ol>
<li>Hafifçe dokunun (değil kazımak) doğrudan pigmentli hücreleri üzerinde hangi float kadar kültür orta bir kez onlar kuyunun dibinden ayırmak.</li>
		<li>Hemen 20 µL micropipette yavaşça Disosiye hPSC-RPE hücrelerinin emiş ve önceden kaplanmış bir 6-şey plakasına RPE orta24ile aktarmak için kullanın.</li>
		<li>Her iyi bir 12-şey tabak adımları 2.3.1–2.3.2 birden çok kez, gerektiğinde tekrar ederek ön kaplamalı ~ 5 x 103 hücre (20 X mikroskop altında gözlemlediği gibi ~ %10 confluency) toplamak. Orta son hacmi 2 mL getir. Not: Disosiye hücreleri ortamda yüzen ama hala yerel olarak konsantre kalır bu Disosiye hPSC-RPE önlemek için yüzen gelen hücreler, hareket plakaların ayrılma işlemi sırasında kaçının.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kültür yeni izole hPSC RPE hücreleri (P0) 12-şey plakaları RPE ortamda başka bir 6-8 hafta pigmentli monolayer (Şekil 1 c) oluşturmak izin vermek için.</li>
	<li>Orta 3 değiştirmek x / hafta. Orta değiştirirken, eski orta yaklaşık 1/3 hacmi her kuyuya bırakın ve taze, önceden ısıtılmış RPE orta hacmi 2/3 ekleyin. Bu aşamada, her şey bir 12-şey plaka RPE Orta 2 mL kullanmak (böylece, orta 1.3 mL her zaman değişimi). Not: P0 hPSC-RPE hücrelerinin monolayer kubbeler, hücrelerin aktif olarak sıvı taşınması ve sıkı kavşak25tarafından demirlemiş düşündüren oluşabilir. Bu nedenle, kubbenin oluşumu olgun RPE durumunun bir göstergesidir.</li>
</ol>3. RPE kader doğrulama Immunoblotting tarafından
<ol><li>HPSC-RPE hücre lysate memeli protein ayıklama tampon İndinavir inhibitörü ile birlikte kullanarak kokteyl yapmak. 30 dk aralıklarla 13.000 x g 4 ° C'de undissolved hücre artıkları atmak için 15 dk için de önce buz lysate cepten kuluçkaya. Toplam protein konsantrasyonu lysate ölçmek.</li>
	<li>40 denatüre µg toplam protein Laemmli SDS örnek arabelleği 75 ° C'de 10 dk. ayırmak için protein örnekleri 15 dk ve sonra 150 V boya açık ulaşır kadar 90 V sabit voltaj, % 10 Tris-glisin SDS-sayfa jel üzerinde alt jel.</li>
	<li>Proteinler nitroselüloz membran 100 V 1 h için % 10 metanol ile takıma önceden soğutulmuş Tris-glisin arabellekte üzerine aktarın.</li>
	<li>Tris arabelleğe alınmış serum %0,1 non-iyonik deterjan (TBST) ve % 5 yağsız Kuru süt oda sıcaklığında 1 h için membran engelleyin.</li>
	<li>Membran gecede 4 ° C'de engelleme arabellekte seyreltilmiş birincil antikorlar ile kuluçkaya. RPE belirli işaret proteinler aşağıdaki gibi hedefleme antikorlar seyreltik: RPE65, 1:1, 000; CRALBP, 1:1, 000; BEST1, 1:1, 000. β-aktin, β-aktin yükleme denetimi olarak algılamaya 1:10,000 karşı antikor sulandırmak.</li>
	<li>Membran TBST 3 kez, 5 min her yıkama için ile ile yıkayın.</li>
	<li>Fareyle fluorophore konjuge keçi Anti-IgG seyreltilmiş ikincil antikor 1:10,000 oda sıcaklığında 1 h için engelleme arabellekte membran kuluçkaya.</li>
	<li>Membran TBST 4 kez, 10 min her yıkama için ile ile yıkayın.</li>
	<li>Bir kızılötesi görüntüleme sistemi (Şekil 3) kullanarak proteinler algılamak.</li>
</ol>4. BEST1 hücre altı yerelleştirme Immunostaining tarafından kontrol
<ol><li>HPSC-RPE hücrelerinin PBS 2 mL ile bir kez yıkama ve % 4 paraformaldehyde 45 dakika oda sıcaklığında 2 mL fix.</li>
	<li>PBS 2 mL ile iki kez yıkama ve PBS 2 mL % 0,1 iyonik olmayan yüzey aktif ve % 2 eşek serum spesifik olmayan bağlayıcı siteleri engellemek 45 dk ile hücrelerde kuluçkaya.</li>
	<li>BEST1 antikor (1: 200 seyreltme) Oda sıcaklığında 2 h için hücrelerle kuluçkaya.</li>
	<li>PBS 3 kez 2 mL hücrelerle yıkayın. İle kuluçkaya fluorophore Birleşik oda sıcaklığında 1 h için ikincil IgG (1:1, 000).</li>
	<li>İlişkisiz ikincil antikor kaldırmak için PBS 3 kez 2 mL ile yıkayın.</li>
	<li>Lekeli hücreleri confocal mikroskobu (Şekil 4) gözlemlemek.</li>
</ol>5. kayıt Ca2 +-hPSC-RPE tarafından bütün hücreli yama kelepçe bağımlı Cl- akım
<ol><li>24-72 saat önce yama kelepçe, bölünmüş bir tam konfluent de (12-şey plaka) üzerinde olgun P0 hPSC-RPE hücrelerinin (Arnavut kaldırımı şeklinde ve Pigmentli). Orta, yıkama bir kez PBS ile Aspire edin ve 1 mL % 0.05 tripsin artı 1 U/µL collagenase kuyunun içine ekleyin. Not: önceden tripsin/collagenase kullanmadan önce 37 ° c sıcak.</li>
	<li>8 dk. 37 ° C'de kuluçkaya. Not: Bu adımdan sonra hala yapışık ve bağlı hPSC-RPE hücrelerdir.</li>
	<li>1 mL micropipette hücreleri plaka dışına hafifçe yıkamak için kullanın ve sindirim karışımı hücrelerde 15 mL konik tüp aktarın. Önceden ısıtılmış tripsin/collagenase kalan hücreleri toplamak ve onları 15 mL konik tüp içine birleştirmek için 1 mL ile iyi yıkayın. Not: HPSC-RPE hücrelerinin bu noktada hala büyük kümeleri vardır. Dinç pipetting tarafından hücre kümeleri kırmaya çalışmayın. Bazı kümeleri 1 mL ucu iç duvara yapışabilir.</li>
	<li>8 dk. 37 ° C kuru banyo konik tüp kuluçkaya.</li>
	<li>1 mL micropipette hafifçe alçalarak pipet için 10-15 kat sindirim karışımı kullanın. Not: Hücre kümeleri çok daha küçük ama hala görünür hale gelir. Dinç pipetting kaçının.</li>
	<li>Önceki iki adımı yineleyin. Not: Çoğu hücreleri tek hücre süspansiyon pipetting sonra olmalıdır. Kabul edilebilir bazı küçük hücre kümeleri olabilir. İsteğe bağlı: bir ek 5 min nazik pipetting tarafından takip için 37 ° C'de konik tüp kuluçkaya. Tripsin/collagenase 37 ° C'de toplam zaman 30 dk (8 + 8 + 8 + 5 = 29) aşmaması gerekir.</li>
	<li>Önceden ısıtılmış RPE orta 5 mL sindirilir hücreleri içeren 15 mL konik tüp ekleyin. 200 x g hücreleri toplamak 5 min için de spin. Ön kaplamalı 35 mm yemekleri, 10-%20 confluency yeniden askıya alma ve tohum hücreleri (Örneğin, % 100 de % 10 confluency için beş 35 mm yemekleri için 12-şey tabakta konfluent). Not: her zaman, güçlü pipetting, kaçının hangi aralıklarla sonra belirgin karanlık hücre artıkları süpernatant içinde gösterdiği gibi önemli hücre ölümüne neden olabilir. İyi ayrılmış tek hücreli tohum yama kelepçe kayıt için gereklidir.</li>
	<li>Bütün hücre yama gerçekleştirmek18,26,27,28,29,30,31daha önce açıklandığı gibi kelepçe. Aileden adım potansiyelleri olan geçerli izleri elde (-100 + 100 için mV holding potansiyel 0 dan mV) (Şekil 5). Not: İç ve dış çözümleri tarifleri Tablo 3 ve Tablo 4, sırasıyla açıklanmıştır.</li>
</ol>

<ol><li>Allikmets, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+Best+disease+gene+in+patients+with+age-related+macular+degeneration+and+other+maculopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies.</a> Hum Genet. 104 (6), 449-453 (1999).</li>
<li>Burgess, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biallelic+mutation+of+BEST1+causes+a+distinct+retinopathy+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans.</a> Am J Hum Genet. 82 (1), 19-31 (2008).</li>
<li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Missense+mutations+in+a+retinal+pigment+epithelium+protein%2C+bestrophin-1%2C+cause+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa.</a> Am J Hum Genet. 85 (5), 581-592 (2009).</li>
<li>Kramer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+VMD2+gene+are+associated+with+juvenile-onset+vitelliform+macular+dystrophy+%28Best+disease%29+and+adult+vitelliform+macular+dystrophy+but+not+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration.</a> Eur J Hum Genet. 8 (4), 286-292 (2000).</li>
<li>Marquardt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+a+novel+gene%2C+VMD2%2C+encoding+a+protein+of+unknown+properties+cause+juvenile-onset+vitelliform+macular+dystrophy+%28Best%27s+disease%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best's disease).</a> Hum Mol Genet. 7 (9), 1517-1525 (1998).</li>
<li>Petrukhin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+gene+responsible+for+Best+macular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy.</a> Nat Genet. 19 (3), 241-247 (1998).</li>
<li>Yardley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+of+VMD2+splicing+regulators+cause+nanophthalmos+and+autosomal+dominant+vitreoretinochoroidopathy+%28ADVIRC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC).</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (10), 3683-3689 (2004).</li>
<li>Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEST1%3A+the+Best+Target+for+Gene+and+Cell+Therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies.</a> Mol Ther. 23 (12), 1805-1809 (2015).</li>
<li>Marmorstein, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bestrophin%2C+the+product+of+the+Best+vitelliform+macular+dystrophy+gene+%28VMD2%29%2C+localizes+to+the+basolateral+plasma+membrane+of+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).</li>
<li>Boon, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spectrum+of+ocular+phenotypes+caused+by+mutations+in+the+BEST1+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The spectrum of ocular phenotypes caused by mutations in the BEST1 gene.</a> Prog Retin Eye Res. 28 (3), 187-205 (2009).</li>
<li>Marmorstein, A. D., Cross, H. E., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+of+bestrophins+in+ocular+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Functional roles of bestrophins in ocular epithelia.</a> Prog Retin Eye Res. 28 (3), 206-226 (2009).</li>
<li>Fujii, S., Gallemore, R. P., Hughes, B. A., Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+for+a+basolateral+membrane+Cl-+conductance+in+toad+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Direct evidence for a basolateral membrane Cl- conductance in toad retinal pigment epithelium.</a> Am J Physiol. 262, C374-C383 (1992).</li>
<li>Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+DIDS+on+the+chick+retinal+pigment+epithelium.+II.+Mechanism+of+the+light+peak+and+other+responses+originating+at+the+basal+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Effects of DIDS on the chick retinal pigment epithelium. II. Mechanism of the light peak and other responses originating at the basal membrane.</a> J Neurosci. 9 (6), 1977-1984 (1989).</li>
<li>Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-evoked+modulation+of+basolateral+membrane+Cl-+conductance+in+chick+retinal+pigment+epithelium%3A+the+light+peak+and+fast+oscillation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation.</a> J Neurophysiol. 70 (4), 1669-1680 (1993).</li>
<li>Li, Y., Nguyen, H. V., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+Biopsy+and+Patient-Specific+Stem+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Skin Biopsy and Patient-Specific Stem Cell Lines.</a> Methods Mol Biol. 1353, 77-88 (2016).</li>
<li>Milenkovic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bestrophin+1+is+indispensable+for+volume+regulation+in+human+retinal+pigment+epithelium+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Bestrophin 1 is indispensable for volume regulation in human retinal pigment epithelium cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (20), E2630-E2639 (2015).</li>
<li>Moshfegh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BESTROPHIN1+mutations+cause+defective+chloride+conductance+in+patient+stem+cell-derived+RPE%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">BESTROPHIN1 mutations cause defective chloride conductance in patient stem cell-derived RPE.</a> Hum Mol Genet. 25 (13), 2672-2680 (2016).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+mutations+impair+BESTROPHIN1%27s+essential+role+in+mediating+Ca2%2B-dependent+Cl-+currents+in+human+RPE%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1's essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Marmorstein, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+light+peak+of+the+electroretinogram+is+dependent+on+voltage-gated+calcium+channels+and+antagonized+by+bestrophin+%28best-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1).</a> J Gen Physiol. 127 (5), 577-589 (2006).</li>
<li>Volland, S., Esteve-Rudd, J., Hoo, J., Yee, C., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+some+organizational+characteristics+of+the+mouse+central+retina+and+the+human+macula%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A comparison of some organizational characteristics of the mouse central retina and the human macula.</a> PLoS One. 10 (4), e0125631(2015).</li>
<li>Kamao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+cell+sheets+aiming+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application.</a> Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).</li>
<li>Idelson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+retinal+pigment+epithelium+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional retinal pigment epithelium cells.</a> Cell Stem Cell. 5 (4), 396-408 (2009).</li>
<li>Mandai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+Induced+Stem-Cell-Derived+Retinal+Cells+for+Macular+Degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Autologous Induced Stem-Cell-Derived Retinal Cells for Macular Degeneration.</a> N Engl J Med. 376 (11), 1038-1046 (2017).</li>
<li>Maminishkis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).</li>
<li>Maruotti, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+scalable+process+for+the+differentiation+of+retinal+pigment+epithelium+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">A simple and scalable process for the differentiation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Transl Med. 2 (5), 341-354 (2013).</li>
<li>Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-inspired+voltage-dependent+calcium+channel+blockers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers.</a> Nat Commun. 4, 2540(2013).</li>
<li>Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preassociated+apocalmodulin+mediates+Ca2%2B-dependent+sensitization+of+activation+and+inactivation+of+TMEM16A%2F16B+Ca2%2B-gated+Cl-+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (51), 18213-18218 (2014).</li>
<li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+selectivity+in+bestrophin+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure and selectivity in bestrophin ion channels.</a> Science. 346 (6207), 355-359 (2014).</li>
<li>Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+RGK+GTPases+differentially+use+alpha1-+and+auxiliary+beta-binding-dependent+mechanisms+to+inhibit+CaV1.2%2FCaV2.2+channels%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels.</a> PLoS One. 7 (5), e37079(2012).</li>
<li>Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+molecules+for+inducibly+inactivating+CaV+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels.</a> Nat Chem Biol. 3 (12), 795-804 (2007).</li>
<li>Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rem%2C+a+member+of+the+RGK+GTPases%2C+inhibits+recombinant+CaV1.2+channels+using+multiple+mechanisms+that+require+distinct+conformations+of+the+GTPase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase.</a> J Physiol. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).</li>
<li>Gong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+Human+Protein-Induced+Pluripotent+Stem+Cells+toward+a+Retinal+Pigment+Epithelial+Cell+Fate%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differentiation of Human Protein-Induced Pluripotent Stem Cells toward a Retinal Pigment Epithelial Cell Fate.</a> PLoS One. 10 (11), e0143272(2015).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+activates+bestrophin+ion+channels+through+direct+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">ATP activates bestrophin ion channels through direct interaction.</a> Nat Commun. 9 (1), 3126(2018).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

En önemli hastalık içinde yemek yaklaşım için hPSCs RPE BEST1için olduğunu doğru hücre lineage bir hastalığa neden olan mutasyona ile ayırt etmek için işlemdir. Böylece, her farklılaşma deneyden sonra elde edilen hPSC-RPE hücrelerinin dikkatle olgun durumları için RPE özel türleri Morfoloji ve protein işaretleri16,17,18tarafından doğrulanması. Klonal artifakı en aza indirmek için birden çok hiPSC klonlar aynı hastadan v...

En az beş Retina Dejeneratif hastalıkları BEST1 gen1,2,3,4,5,6 genetik mutasyonlar neden olduğu belgelenmiş oldu , 7 , 8, bildirilen mutasyonlar zaten üzerinde 200 ve hala artan sayıda. Bu BEST1-ilişkili hastalıklar, olarak da bilinen bestrophinopathies, neden ilerleyici görme kaybı ve hatta körlüğe ve şu anda hiçbir etkili tedaviler vardır. Protein ürünü olan BEST1, yani BESTROPHIN1 (BEST1), bu bir Ca2 +-özellikle retina pigment epiteli gözler5,6, içinde (RPE) ifade aktif Cl- kanal (CaCC) 8,9. Önemlisi, BEST1, bir klinik fenotip-ilişkili hastalıklar yanıttır azaltılmış görsel ışık tepe (LP) electrooculogram10,11'; ölçülen denilen hafif uyaranlara LP RPE12,13,14CaCC tarafından aracılı inanılıyor. BEST1 mutasyonlar patolojik mekanizmaları daha iyi anlamak için ve potansiyel tedaviler doğru çalışması için mutant BEST1 kanalları endogenously ifade insan RPE hücrelerinde çalışma esastır.
RPE alma hücreleri doğrudan doğruya--dan canlı hastalar ise son derece pratik. Her ne kadar yerel RPE hücrelerinin insan kadavra ve fetusa biyopsi--dan hasat edilebilir, bu kaynakları için zor erişilebilirlik önemli ölçüde bilimsel araştırma sınırlar. Bu nedenle, insan gözü dışında alternatif RPE kaynaklar için önemlidir. Fonksiyonel RPE hücrelerinin şimdi insan pluripotent kök embriyonik kök hücreler (hESCs) de dahil olmak üzere hücre (hPSCs), Ayrıştırılan ve pluripotent kök hücreler (hiPSCs), ikinci indüklenen gibi bu çağrı kök hücre teknikleri, son gelişmeler tarafından yanıtlandı Birincil deri fibroblastlar bağış16,17,18yeniden programlama tarafından oluşturulan. Önemlisi, kendini yenileme ve pluripotency hPSCs, RPEs, hiPSCs hasta özgüllük ve hESCs (Örneğin, CRISPR tarafından) potansiyelini genomik değişiklik için çok yönlü bir çanak içinde hastalık modeli sunarken oluşturmak için güvenilir bir kaynak sağlamak İstenen BEST1 mutasyonlar.
hPSC-RPE fareler RPE modelleri birçok avantajı vardır: 1) BEST1 nakavt fareler fareler ve insanlar; arasında BEST1 RPE içinde farklı genetik gereksinimi olasılığını yükseltmek herhangi bir retina anormallik19, görüntü yok 2) yalnızca %3 insan RPE hücrelerinin binucleate, fareler%2035 aksine; 3) hiPSC-RPE potentiates klinik olarak otolog transplantasyon Retina tedavisinde bozuklukları21. Yine de hayvan modelleri hala canlı bir sistem içinde RPE fizyolojisi ve patoloji eğitimi için vazgeçilmezdir ve hiPSC oncogenic potansiyelini göz ardı edemem.
Araştırma ve klinik amaçlar için kullanılabilir RPE farklılaşma protokolü için kullanışlı ve orta derecede basit hPSC burada ile ilgili yordamı açıklamaktadır. HPSCs için daha fazla RPE ayırt etmek için tedavi aktivin-a. tarafından indüklenen olduğu sinir dokusu, farklılaşma çoğaltmak için nikotinamid (B3 vitamini) bu iletişim kuralını kullanır Nikotinamid tedavi pigmentli hücreleri (bir işareti farklılaşma RPE içine), sayısını artırmak için muhtemelen apoptotik hücreler22ayırt faaliyet inceltiyorum tarafından gösterilmiştir. Elde edilen hPSC-RPE hücreler aynı anahtar işaretleri, Arnavut kaldırımı Morfoloji ve hücresel işlevselliği yerel insan RPE hücrelerinin22görüntüler. Böylece, bir araştırma ortamda elde edilen hPSC-RPE hücrelerinin immunoblotting, immunostaining ve bütün hücreli yama kelepçe, kendisi için de ayrıntılı deneysel yordamlar sağlanmaktadır gibi aşağı akım fonksiyonel analizleri için uygundur. Klinik olarak, kök hücrelerden türetilmiş RPE hücrelerinin glokom tedavisinde nakli için büyük bir potansiyel hayvan çalışmaları ve insan denemeler23göstermiştir.

<table><tbody><tr><td>Nakavt (KO) DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>KO serum replasmanı</td><td>ThermoFisher</td><td>10829028</td><td></td></tr><tr><td>Esansiyel olmayan amino asitler</td><td>ThermoFisher</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>ThermoFisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-streptomisin</td><td>ThermoFisher</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>Nikotinamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>İnsan aktivin-A</td><td>PeproTech</td><td>120-14</td><td></td></tr><tr><td>MEM (bir modifikasyon)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4526</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>N1 takviyesi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6530</td><td></td></tr><tr><td>Glutamin-penisilin-streptomisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1146</td><td></td></tr><tr><td>Esansiyel olmayan amino asitler</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7156</td><td></td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>Hidrokortizon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0386</td><td></td></tr><tr><td>Triiyodo-tironin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5516</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR-1 orta</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356230</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz</td><td>Gibco</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>VWR</td><td>45000-664</td><td></td></tr><tr><td>M-PER memeli protein ekstraksiyon reaktifi</td><td>Pierce</td><td>78501</td><td></td></tr><tr><td>proteinaz inhibitörü kokteyli</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>RPE65 antikoru</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-355</td><td></td></tr><tr><td>CRALBP antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab15051</td><td></td></tr><tr><td>BEST1 antikoru</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB300-164</td><td></td></tr><tr><td>Beta Aktin antikoru</td><td>ThermoFisher</td><td>MA5-15739</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 konjuge eşek anti-fare IgG</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-fare IgG</td><td>ThermoFisher</td><td>SA5-35521</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-Tavşan IgG</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-68071</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>ThermoFisher</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>HEKA EPC10 yama kelepçesi amplifikatör</td><td>Warner Instruments</td><td>895000</td><td></td></tr><tr><td>Yama Yöneticisi</td><td>Warner Instruments</td><td>895040</td><td></td></tr></tbody></table>

farklılaşma, bakım ve insan retina pigment epitel hücre analizi: best1 mutasyonlar için bir tabak içinde hastalık modeli

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Genetik mutasyonların 200'den fazla insan BEST1 gen tespit ve Retina dejeneratif hastalıklara bağlı olsa da, patolojik mekanizmaları özellikle BEST1 çalışmak için iyi vivo içinde manken eksikliği nedeniyle zor kalır ve onun mutasyonlar fizyolojik koşullar altında. BEST1 kodlar bir iyon kanalı, yani BESTROPHIN1 (BEST1), hangi işlevleri retina pigment epiteli (RPE); Ancak, yerel insan RPE hücrelerinin için son derece sınırlı erişilebilirlik bilimsel araştırmalar için büyük bir sorun temsil eder. Bu iletişim kuralı, insan RPEs insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) üzerinden indüklenen farklılaşma tarafından BEST1 hastalığa neden olan mutasyonlar taşıyan oluşturmak açıklar. HPSCs kendi kendine yenilenebilir olduğu gibi bu yaklaşım araştırmacılar hPSC-RPEs immunoblotting, ayirt ve yama kelepçe, gibi çeşitli deneysel analizleri için sabit bir kaynağı olmasını sağlar ve böylece için çok güçlü bir çanak içinde hastalık modeli sağlar BEST1-Retina koşulları ilişkili. Özellikle, bu strateji RPE (patho) Fizyoloji ve diğer genler özgün olarak içinde RPE ifade ilgi çalışmaya uygulanır.

Farklılaştırılmış P0 hPSC-RPE popülasyondan alınmış bir yüksek saflıkta elde amaçlamaktadır el ile yalıtım teknik açıdan en zor adımdır. Sonra başarılı bir yalıtım &gt; P0 popülasyonda % 90 hücreleri büyüyecek ve imza RPE türleri morfoloji (Şekil 1 c) görüntülemek için olgun. RPE sigara veya P0 nüfus olgunlaşmamış RPE hücrelerinde küçük bir bölümünü varlığını neredeyse kaçınılmaz ama ezici pigmente ve Arnavut kaldırımı şeklind...

Burada retina pigment epiteli (RPE) hücreleri insan pluripotent kök hücre hasta kaynaklı mutasyonlar taşıyan ayırt etmek için bir iletişim kuralı mevcut. Mutant hücre hatları immunoblotting, ayirt ve yama kelepçe gibi fonksiyonel analizleri için kullanılabilir. Bu hastalık içinde yemek yaklaşım yerel insan RPE hücrelerinin alma zorluğu kaçınmanızı sağlar.

Farklılaşma, bakım ve insan Retina Pigment epitel hücre Analizi: BEST1 mutasyonlar için bir tabak içinde hastalık modeli

Although over 200 genetic mutations in the human BEST1 gene have been identified and linked to retinal degenerative diseases, the pathological mechanisms ...

Bu yöntem, iyon kanalı ile ilgili retina hastalıkları alanında BEST1 mutasyonlarının moleküler mekanizmaları ve bestrofinopatilerin patolojisi hakkındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, RPE hücrelerinin insanlardan doğrudan elde edilmesinin zorluğunu ortadan kaldırmasıdır. Bu tekniğin etkileri, RPE hücreleri hem araştırma amaçlı hem de hücre replasman tedavileri için kullanılabildiğinden, Best hastalığı da dahil olmak üzere bestrofinopatilerin tedavisine kadar uzanır.hPSC kültürü birleşime ulaştığında, kültür ortamını altı oyuklu bir plakanın oyuğu başına dört mililitre farklılaşma ortamı ile değiştirin. İki haftalık kültürden sonra, farklılaşma ortamını mililitre insan aktivin-A başına 100 nanogram ile destekleyin ve takviye edilen ortamı 14 gün daha haftada üç kez değiştirin. 29. günde, pigmentli RPE hücre kümeleri ortaya çıkana kadar sekiz ila 10 hafta daha takviye edilmemiş farklılaşma ortamına geçin.Pigmentli RPE hücrelerini izole etmek için, önce tek tek dokuz inçlik cam Pasteur pipetlerini bir Bunsen brülörünün alevi üzerinde, pipetin ince kısmının uzunluğunun yaklaşık üçte ikisi kadar yatay olarak tutun. Isıtılmış cam yumuşadığında, pipetin yeni ucunda mikro kazıyıcı benzeri bir uç oluşturmak için iki ucu hızla ayırın. Çekilen pipetlere %70 etanol püskürtün ve bir hücre kültürü davlumbazında kurumaya bırakın.Pipetler hazır olduğunda, farklılaşma kültürünün her bir oyuğunu PBS ile yıkayın ve her oyuğa mikrolitre kollajenaz başına bir birim ile takviye edilmiş bir mililitre% 0.05 tripsin ekleyin. 37 santigrat derecede 20 ila 30 dakika sonra, altı oyuklu bir plakanın oyuğu başına iki mililitre 37 santigrat derece RPE ortamı ile sindirimi durdurun ve plakayı bir mikroskop aşamasına yerleştirin. Çekilmiş bir pipet kullanarak pigmentli RPE kümelerine hafifçe vurun.Hücreler kuyu dibinden ayrılır ayrılmaz, ayrışmış hücreleri RPE ortamı içeren yeni bir hücre kültürü plakasının ayrı oyuklarına aktarmak için 20 mikrolitrelik bir mikropipet kullanın. 12 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna yaklaşık 5.000 RPE hücresi eklendiğinde, son hacmi taze RPE ortamı ile iki mililitreye getirin ve izole edilmiş hPSC-RPE hücrelerini, pigmentli ve parke taşı şeklinde olgun RPE hücrelerinin tek tabakası gözlenene kadar altı ila sekiz hafta daha kültürleyin. Yama kelepçesinden 24 ila 72 saat önce, pigmentli tek tabakalı hücreleri iki mililitre PBS ile yıkayın, daha sonra PBS'yi çıkardıktan sonra, 37 santigrat derecede sekiz dakikalık bir inkübasyon süresi boyunca 12 oyuklu bir plakanın her bir oyuğundaki hücrelere bir mililitre% 0.05 tripsin artı mikrolitre başına bir birim kollajenaz ekleyin.Hücreler ayrılmaya başladığında, hücreleri kuyu dibinden nazikçe yıkamak için bir mililitrelik bir mikropipet kullanın ve hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe koyun. Kuyuya bir mililitre 37 santigrat derece tripsin-kollajenaz çözeltisi ekleyin. 37 santigrat derecede sekiz dakika daha inkübe edin, daha sonra kuyu dibinden kalan hücreleri yıkayın ve hücre süspansiyonunu aynı 15 mililitrelik konik tüpe birleştirin.Hücreleri 37 santigrat derece kuru bir banyoda sekiz dakika inkübe edin, ardından hücreleri 10 ila 15 kez nazikçe ezmek için bir mililitrelik bir mikropipet kullanın. Hücreleri iki kez daha inkübe ettikten ve ezdikten sonra, tek hücreli süspansiyona beş mililitre 37 santigrat derece RPE ortamı ekleyin ve hücreleri santrifüjleme ile peletleyin. Peletleri, %10 ila 20 birleşme noktasında kapak kızakları ile önceden kaplanmış plakalara tohumlama için uygun hacimde yeniden süspanse edin ve standart protokollere göre tam hücre yama kelepçesi gerçekleştirin.Başarılı bir izolasyondan sonra, pasaj sıfır popülasyonundaki hücrelerin %90'ından fazlası, imza RPE hücre morfolojisini gösterecek şekilde olgunlaşmalıdır. hPSC-RPE tabanlı bir çanakta hastalık yaklaşımıyla, hastaya özgü her BEST1 mutasyonu, RPE patolojik mekanizmalarını aydınlatmak için kritik bilgiler elde etmek için protein ekspresyonu, membran trafiği ve iyon kanalı işlevi açısından kapsamlı bir şekilde karakterize edilebilir. Bazı BEST1 mutasyonlarının protein ekspresyonunu etkileyebileceğine dikkat edilmelidir, bu nedenle diğer iyi bilinen RPE belirteçleri de kontrol edilmelidir.İnsan pluripotent kök RPE hücre farklılaşması, insan pluripotent kök hücre hattına ve mutasyon tipine bağlı olarak üç ila altı ay sürer ve farklılaşmış insan pluripotent hücrelerinin izolasyonu, uygun şekilde yapılırsa iki saat içinde tamamlanabilir. Yama kelepçesi için hücreleri bölmeye çalışırken, fazla hücre ölümünü önlemek için hücreleri çok nazikçe ezmeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, RPE hücrelerinin apikal ve bazal membranları üzerindeki iyon taşınmasının BEST1 mutasyonlarından nasıl etkilendiğine dair ek soruları yanıtlamak için 3D RPE hücre kültürü gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.Bu teknik, geliştirilmesinden sonra retinal dejeneratif hastalıklar alanındaki araştırmacıların hasta kaynaklı RPE hücrelerinin fizyolojik fenotiplerini ve patolojik mekanizmalarını keşfetmelerinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, pluripotent kök hücreleri retina pigment epitel hücrelerine nasıl ayırt edeceğinizi ve RPE hücrelerini tam hücre yama kelepçesi için nasıl hazırlayacağınızı iyi anlamış olmalısınız.

differentiation-maintenance-analysis-human-retinal-pigment-epithelium

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Biz insan fetal retina pigment epitel hücreleri (hfRPE) hücrelerin kültür konfluent mono tabakaları, morfoloji, fizyoloji, polarite, ve yetişkin doğal doku protein ve gen ekspresyonu sergilediği için tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Bu çalışma, çeşitli göz hastalıkları bir hayvan modeli uzatıldı.

Retina Pigment Epitel Fizyoloji ve Patofizyoloji Çalışma Deneysel Modeller

Kök hücre kaynaklı retina pigment epitel (RPE) hücreleri, retina dejenerasyonu için hücre bazlı tedaviler, hastalık modellemesi ve ilaç çalışmaları dahil olmak üzere birçok uygulama için kullanılabilir. Burada, kök hücrelerden RPE'nin tekrarlanabilir bir şekilde türetilmesi için basit bir protokol sunuyoruz.

Kök Hücreleri Retina pigment epiteli hücrelerinin Verimli türetilmesi

Bu iletişim kuralı, retina pigment epitel hücreleri (RPE) pluripotent kök hücre üretmek açıklar. Yöntem farklılaşma kök hücre içine olgunlaşmamış RPE on dört gün ve olgun, fonksiyonel RPE üç ay sonra büyüme faktörleri ve küçük moleküller bir arada kullanır.

Hızlı, yönlendirilmiş farklılaşma insan embriyonik veya İndüklenmiş Pluripotent kök hücrelerinden retina Pigment epitel hücrelerinin

Bu iletişim kuralı, yaşlı ve/veya hastalıklı insan Bruch'ın membran retina pigment epitel (RPE) hücre kültürü çalışmalarının göstermek için hedeftir. Bu yöntem RPE hücre davranış güvenliği aşılan bir hücre dışı matriks üzerinde çalışmaya uygundur.

Bir Ex Vivo modeli yaşlı insan Bruch'ın membran bir retina Pigment epitel hücrelerinin kültürü

İlk olarak 20161'deFernandez-Godino ve arkadaşları tarafından bildirilen bu protokol, Transwell plakalarında bir hafta içinde işlevsel ve polarize bir RPE monolayer oluşturan fare RPE hücrelerini verimli bir şekilde izole etmek ve kültüre etmek için bir yöntem tanımlamaktadır. İşlem yaklaşık 3 saat sürer.

Birincil Fare Retina Pigment Epitel Hücrelerinin Verimli Diseksiyonu ve Kültürü

İnsan olmayan primat (NHP), anatomik ve genetik benzerlikler nedeniyle insan retina hücresel terapötiklerini incelemek için ideal bir modeldir. Bu makalede, NHP gözündeki retina pigment epitel hücrelerinin submaküler nakli için bir yöntem ve makula manipülasyonu ile ilişkili intraoperatif komplikasyonları önleme stratejileri açıklanmaktadır.

Dejeneratif Retina Hastalıkları için İnsan Dışı Primat Modelinde Retina Pigment Epitel Transplantasyonu

Bu yazıda retinal pigmente epitel (RPE) hücrelerinin fare gözlerinden kademeli olarak izole edilmesi için basitleştirilmiş bir protokol anlatılmaktadır. Protokol, fare gözlerinin enükleasyonunu ve diseksiyonunu, ardından RPE hücrelerinin izolasyonunu, tohumlanmasını ve kültürlenmesini içerir.

Primer Fare Retinal Pigmentli Epitel Hücrelerinin İzolasyonu

Bu protokol, hiPSC'leri göz alanı kümelerine ayırmanın ve hem yapışkan hem de süspansiyon kültür sistemlerini içeren basitleştirilmiş kültür koşullarını kullanarak nöro-retinal organoidler üretmenin etkili bir yöntemini açıklamaktadır. RPE ve kornea epiteli gibi diğer oküler hücre tipleri de retina kültürlerinde olgun göz alanlarından izole edilebilir.

Sağlıklı ve Retina Hastalığına Özgü İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Retinal Organoidlerin Üretimi

Fare modelleri, retinal pigmentli epitelin (RPE) biyolojisini araştırmak için yararlı araçlar olabilir. Farelerin bir dizi RPE patolojisi geliştirebileceği tespit edilmiştir. Burada, ışık, iletim elektronu ve konfokal mikroskopi kullanarak farelerde RPE patolojilerini aydınlatmak ve ölçmek için bir fenotipleme protokolü tarif ediyoruz.

Yaşa Bağlı Makula Dejenerasyonunun Fare Modellerinde Retinal Pigmentli Epitel Patolojilerini Değerlendirme ve Ölçme Protokolü

Burada, fizyolojik oksijen koşulları sırasında mRNA'nın 5' başlığını bağlayan translasyon başlatma faktörlerini analiz etmek için insan hücre kültürü protokollerini sunuyoruz. Bu yöntem, Agaroz bağlantılı bir m7GTP başlık analoğu kullanır ve kapak bağlama faktörlerini ve bunların etkileşen ortaklarını araştırmak için uygundur.

Fizyolojik Oksijen Koşullarına Maruz İnsan hücrelerinde Cap-bağlayıcı proteinlerin analizi

Öğrenin, insan çok potansiyelli kök hücrelerinden retinal pigment epitel hücrelerinin farklılaşmasını ve BEST1 mutasyonlarının hastalık mekanizmalarını incelemeyi. Bu yöntem, bestrofinopatiler için tedavi stratejileri geliştirmede değerlidir.

Farklılaşma, bakım ve insan Retina Pigment epitel hücre Analizi: BEST1 mutasyonlar için bir tabak içinde hastalık modeli

Daha fazla video keşfet