Farklılaşma, bakım ve insan Retina Pigment epitel hücre Analizi: BEST1 mutasyonlar için bir tabak içinde hastalık modeli

Bu yöntem, iyon kanalı ile ilgili retina hastalıkları alanında BEST1 mutasyonlarının moleküler mekanizmaları ve bestrofinopatilerin patolojisi hakkındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, RPE hücrelerinin insanlardan doğrudan elde edilmesinin zorluğunu ortadan kaldırmasıdır. Bu tekniğin etkileri, RPE hücreleri hem araştırma amaçlı hem de hücre replasman tedavileri için kullanılabildiğinden, Best hastalığı da dahil olmak üzere bestrofinopatilerin tedavisine kadar uzanır.

hPSC kültürü birleşime ulaştığında, kültür ortamını altı oyuklu bir plakanın oyuğu başına dört mililitre farklılaşma ortamı ile değiştirin. İki haftalık kültürden sonra, farklılaşma ortamını mililitre insan aktivin-A başına 100 nanogram ile destekleyin ve takviye edilen ortamı 14 gün daha haftada üç kez değiştirin. 29. günde, pigmentli RPE hücre kümeleri ortaya çıkana kadar sekiz ila 10 hafta daha takviye edilmemiş farklılaşma ortamına geçin.

Pigmentli RPE hücrelerini izole etmek için, önce tek tek dokuz inçlik cam Pasteur pipetlerini bir Bunsen brülörünün alevi üzerinde, pipetin ince kısmının uzunluğunun yaklaşık üçte ikisi kadar yatay olarak tutun. Isıtılmış cam yumuşadığında, pipetin yeni ucunda mikro kazıyıcı benzeri bir uç oluşturmak için iki ucu hızla ayırın. Çekilen pipetlere %70 etanol püskürtün ve bir hücre kültürü davlumbazında kurumaya bırakın.

Pipetler hazır olduğunda, farklılaşma kültürünün her bir oyuğunu PBS ile yıkayın ve her oyuğa mikrolitre kollajenaz başına bir birim ile takviye edilmiş bir mililitre% 0.05 tripsin ekleyin. 37 santigrat derecede 20 ila 30 dakika sonra, altı oyuklu bir plakanın oyuğu başına iki mililitre 37 santigrat derece RPE ortamı ile sindirimi durdurun ve plakayı bir mikroskop aşamasına yerleştirin. Çekilmiş bir pipet kullanarak pigmentli RPE kümelerine hafifçe vurun.

Hücreler kuyu dibinden ayrılır ayrılmaz, ayrışmış hücreleri RPE ortamı içeren yeni bir hücre kültürü plakasının ayrı oyuklarına aktarmak için 20 mikrolitrelik bir mikropipet kullanın. 12 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna yaklaşık 5.000 RPE hücresi eklendiğinde, son hacmi taze RPE ortamı ile iki mililitreye getirin ve izole edilmiş hPSC-RPE hücrelerini, pigmentli ve parke taşı şeklinde olgun RPE hücrelerinin tek tabakası gözlenene kadar altı ila sekiz hafta daha kültürleyin. Yama kelepçesinden 24 ila 72 saat önce, pigmentli tek tabakalı hücreleri iki mililitre PBS ile yıkayın, daha sonra PBS'yi çıkardıktan sonra, 37 santigrat derecede sekiz dakikalık bir inkübasyon süresi boyunca 12 oyuklu bir plakanın her bir oyuğundaki hücrelere bir mililitre% 0.05 tripsin artı mikrolitre başına bir birim kollajenaz ekleyin.

Hücreler ayrılmaya başladığında, hücreleri kuyu dibinden nazikçe yıkamak için bir mililitrelik bir mikropipet kullanın ve hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe koyun. Kuyuya bir mililitre 37 santigrat derece tripsin-kollajenaz çözeltisi ekleyin. 37 santigrat derecede sekiz dakika daha inkübe edin, daha sonra kuyu dibinden kalan hücreleri yıkayın ve hücre süspansiyonunu aynı 15 mililitrelik konik tüpe birleştirin.

Hücreleri 37 santigrat derece kuru bir banyoda sekiz dakika inkübe edin, ardından hücreleri 10 ila 15 kez nazikçe ezmek için bir mililitrelik bir mikropipet kullanın. Hücreleri iki kez daha inkübe ettikten ve ezdikten sonra, tek hücreli süspansiyona beş mililitre 37 santigrat derece RPE ortamı ekleyin ve hücreleri santrifüjleme ile peletleyin. Peletleri, %10 ila 20 birleşme noktasında kapak kızakları ile önceden kaplanmış plakalara tohumlama için uygun hacimde yeniden süspanse edin ve standart protokollere göre tam hücre yama kelepçesi gerçekleştirin.

Başarılı bir izolasyondan sonra, pasaj sıfır popülasyonundaki hücrelerin %90'ından fazlası, imza RPE hücre morfolojisini gösterecek şekilde olgunlaşmalıdır. hPSC-RPE tabanlı bir çanakta hastalık yaklaşımıyla, hastaya özgü her BEST1 mutasyonu, RPE patolojik mekanizmalarını aydınlatmak için kritik bilgiler elde etmek için protein ekspresyonu, membran trafiği ve iyon kanalı işlevi açısından kapsamlı bir şekilde karakterize edilebilir. Bazı BEST1 mutasyonlarının protein ekspresyonunu etkileyebileceğine dikkat edilmelidir, bu nedenle diğer iyi bilinen RPE belirteçleri de kontrol edilmelidir.

İnsan pluripotent kök RPE hücre farklılaşması, insan pluripotent kök hücre hattına ve mutasyon tipine bağlı olarak üç ila altı ay sürer ve farklılaşmış insan pluripotent hücrelerinin izolasyonu, uygun şekilde yapılırsa iki saat içinde tamamlanabilir. Yama kelepçesi için hücreleri bölmeye çalışırken, fazla hücre ölümünü önlemek için hücreleri çok nazikçe ezmeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, RPE hücrelerinin apikal ve bazal membranları üzerindeki iyon taşınmasının BEST1 mutasyonlarından nasıl etkilendiğine dair ek soruları yanıtlamak için 3D RPE hücre kültürü gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.

Bu teknik, geliştirilmesinden sonra retinal dejeneratif hastalıklar alanındaki araştırmacıların hasta kaynaklı RPE hücrelerinin fizyolojik fenotiplerini ve patolojik mekanizmalarını keşfetmelerinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, pluripotent kök hücreleri retina pigment epitel hücrelerine nasıl ayırt edeceğinizi ve RPE hücrelerini tam hücre yama kelepçesi için nasıl hazırlayacağınızı iyi anlamış olmalısınız.