Name: Arıtma ve TRPV1 sulandırma spektroskopik analizi için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Öğrenin, TRPV1 iyon kanalının arıtma ve spektroskopik analiz yöntemlerini. EPR ve DEER teknikleriyle konformasyonel değişiklikleri inceleyerek memeli iyon kanallarının yapısal ve fonksiyonel özelliklerini keşfedin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. H. EPR ve geyik Spektrometreler erişim sağlamak için Mchaourab ve Dr. T. Rosenbaum tam uzunlukta sistein-az TRPV1 plazmid sağlamak için minnettarız.

<ol><li>Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+TRPV1+ion+channel+determined+by+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy.</a> Nature. 504, 107-112 (2013).</li>
<li>Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+structures+in+distinct+conformations+reveal+activation+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms.</a> Nature. 504, 113-118 (2013).</li>
<li>Gao, Y., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+structures+in+nanodiscs+reveal+mechanisms+of+ligand+and+lipid+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action.</a> Nature. , (2016).</li>
<li>Yang, F., Xiao, X., Cheng, W., Yang, W., Yu, P., Song, Z., Yarov-Yarovoy, V., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+mechanism+underlying+capsaicin+binding+and+activation+of+the+TRPV1+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural mechanism underlying capsaicin binding and activation of the TRPV1 ion channel.</a> Nat Chem Biol. 11, 518-524 (2015).</li>
<li>Bae, C., Anselmi, C., Kalia, J., Jara-Oseguera, A., Schwieters, C. D., Krepkiy, D., Won Lee, C., Kim, E. H., Kim, J. I., Faraldo-Gomez, J. D., Swartz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+mechanism+of+activation+of+the+TRPV1+channel+by+a+membrane-bound+tarantula+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the mechanism of activation of the TRPV1 channel by a membrane-bound tarantula toxin.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+the+KvAP+voltage-dependent+K%2B+channel+in+a+lipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of the KvAP voltage-dependent K+ channel in a lipid bilayer.</a> Science. 306, 491-495 (2004).</li>
<li>Cordero-Morales, J. F., Jogini, V., Lewis, A., Vasquez, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+driving+forces+determining+potassium+channel+slow+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular driving forces determining potassium channel slow inactivation.</a> Nat Struct Mol Biol. 14, 1062-1069 (2007).</li>
<li>Cordero-Morales, J. F., Cuello, L. G., Zhao, Y., Jogini, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+of+gating+at+the+potassium-channel+selectivity+filter%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants of gating at the potassium-channel selectivity filter.</a> Nat Struct Mol Biol. 13, 311-318 (2006).</li>
<li>Basak, S., Schmandt, N., Gicheru, Y., Chakrapani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+and+dynamics+of+a+lipid-induced+potential+desensitized-state+of+a+pentameric+ligand-gated+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Crystal structure and dynamics of a lipid-induced potential desensitized-state of a pentameric ligand-gated channel.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Vasquez, V., Sotomayor, M., Cordero-Morales, J., Schulten, K., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+mechanism+for+MscS+gating+in+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A structural mechanism for MscS gating in lipid bilayers.</a> Science. 321, 1210-1214 (2008).</li>
<li>Perozo, E., Kloda, A., Cortes, D. M., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+principles+underlying+the+transduction+of+bilayer+deformation+forces+during+mechanosensitive+channel+gating%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Physical principles underlying the transduction of bilayer deformation forces during mechanosensitive channel gating.</a> Nat Struct Biol. 9, 696-703 (2002).</li>
<li>Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+channel+structure+of+MscL+and+the+gating+mechanism+of+mechanosensitive+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels.</a> Nature. 418, 942-948 (2002).</li>
<li>Perozo, E., Cortes, D. M., Cuello, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+rearrangements+underlying+K%2B-channel+activation+gating%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural rearrangements underlying K+-channel activation gating.</a> Science. 285, 73-78 (1999).</li>
<li>Goehring, A., Lee, C. H., Wang, K. H., Michel, J. C., Claxton, D. P., Baconguis, I., Althoff, T., Fischer, S., Garcia, K. C., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+large-scale+expression+of+membrane+proteins+in+mammalian+cells+for+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies.</a> Nat Protoc. 9, 2574-2585 (2014).</li>
<li>Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography-based+thermostability+assay+for+membrane+protein+precrystallization+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening.</a> Structure. 20, 1293-1299 (2012).</li>
<li>Gonzales, E. B., Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pore+architecture+and+ion+sites+in+acid-sensing+ion+channels+and+P2X+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pore architecture and ion sites in acid-sensing ion channels and P2X receptors.</a> Nature. 460, 599-604 (2009).</li>
<li>McHaourab, H. S., Lietzow, M. A., Hideg, K., Hubbell, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motion+of+spin-labeled+side+chains+in+T4+lysozyme.+Correlation+with+protein+structure+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme. Correlation with protein structure and dynamics.</a> Biochemistry. 35, 7692-7704 (1996).</li>
<li>Columbus, L., Kalai, T., Jeko, J., Hideg, K., Hubbell, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+motion+of+spin+labeled+side+chains+in+alpha-helices%3A+analysis+by+variation+of+side+chain+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular motion of spin labeled side chains in alpha-helices: analysis by variation of side chain structure.</a> Biochemistry. 40, 3828-3846 (2001).</li>
<li>Zou, P., McHaourab, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+sensitivity+and+extended+range+of+distance+measurements+in+spin-labeled+membrane+proteins%3A+Q-band+double+electron-electron+resonance+and+nanoscale+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Increased sensitivity and extended range of distance measurements in spin-labeled membrane proteins: Q-band double electron-electron resonance and nanoscale bilayers.</a> Biophys J. 98, L18-L20 (2010).</li>
<li>Vasquez, V., Sotomayor, M., Cortes, D. M., Roux, B., Schulten, K., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+architecture+of+membrane-embedded+MscS+in+the+closed+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional architecture of membrane-embedded MscS in the closed conformation.</a> J Mol Biol. 378, 55-70 (2008).</li>
<li>Autzen, H. E., Myasnikov, A. G., Campbell, M. G., Asarnow, D., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+TRPM4+ion+channel+in+a+lipid+nanodisc%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc.</a> Science. 359, 228-232 (2018).</li>
<li>Efremov, R. G., Gatsogiannis, C., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Nanodiscs+as+a+Tool+for+High-Resolution+Structure+Determination+of+Membrane+Proteins+by+Single-Particle+Cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Lipid Nanodiscs as a Tool for High-Resolution Structure Determination of Membrane Proteins by Single-Particle Cryo-EM.</a> Methods Enzymol. 594, 1-30 (2017).</li>
<li>Guo, J., She, J., Zeng, W., Chen, Q., Bai, X. C., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+calcium-activated%2C+non-selective+cation+channel+TRPM4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4.</a> Nature. 552, 205-209 (2017).</li>
<li>McGoldrick, L. L., Singh, A. K., Saotome, K., Yelshanskaya, M. V., Twomey, E. C., Grassucci, R. A., Sobolevsky, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opening+of+the+human+epithelial+calcium+channel+TRPV6%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Opening of the human epithelial calcium channel TRPV6.</a> Nature. 553, 233-237 (2018).</li>
<li>Dang, S., Feng, S., Tien, J., Peters, C. J., Bulkley, D., Lolicato, M., Zhao, J., Zuberbuhler, K., Ye, W., Qi, L., Chen, T., Craik, C. S., Nung Jan, Y., Minor, D. L. Jr, Cheng, Y., Yeh Jan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structures+of+the+TMEM16A+calcium-activated+chloride+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structures of the TMEM16A calcium-activated chloride channel.</a> Nature. , (2017).</li>
<li>Velisetty, P., Stein, R. A., Sierra-Valdez, F. J., Vasquez, V., Cordero-Morales, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+Purification+of+the+Pain+Receptor+TRPV1+for+Spectroscopic+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Expression and Purification of the Pain Receptor TRPV1 for Spectroscopic Analysis.</a> Sci Rep. 7, 9861(2017).</li>
<li>Salazar, H., Llorente, I., Jara-Oseguera, A., Garcia-Villegas, R., Munari, M., Gordon, S. E., Islas, L. D., Rosenbaum, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+N-terminal+cysteine+in+TRPV1+determines+activation+by+pungent+compounds+from+onion+and+garlic%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A single N-terminal cysteine in TRPV1 determines activation by pungent compounds from onion and garlic.</a> Nat Neurosci. 11, 255-261 (2008).</li>
<li>Cao, E., Cordero-Morales, J. F., Liu, B., Qin, F., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+channels+are+intrinsically+heat+sensitive+and+negatively+regulated+by+phosphoinositide+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">TRPV1 channels are intrinsically heat sensitive and negatively regulated by phosphoinositide lipids.</a> Neuron. 77, 667-679 (2013).</li>
<li>Braman, J., Papworth, C., Greener, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+mutagenesis+using+double-stranded+plasmid+DNA+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Site-directed mutagenesis using double-stranded plasmid DNA templates.</a> Methods Mol Biol. 57, 31-44 (1996).</li>
<li>Gracheva, E. O., Cordero-Morales, J. F., Gonzalez-Carcacia, J. A., Ingolia, N. T., Manno, C., Aranguren, C. I., Weissman, J. S., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ganglion-specific+splicing+of+TRPV1+underlies+infrared+sensation+in+vampire+bats%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ganglion-specific splicing of TRPV1 underlies infrared sensation in vampire bats.</a> Nature. 476, 88-91 (2011).</li>
<li>Guan, B., Chen, X., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-electrode+voltage+clamp%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-electrode voltage clamp.</a> Methods Mol Biol. 998, 79-89 (2013).</li>
<li>Jarecki, B. W., Makino, S., Beebe, E. T., Fox, B. G., Chanda, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+Shaker+potassium+channels+produced+by+cell-free+translation+upon+injection+into+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Function of Shaker potassium channels produced by cell-free translation upon injection into Xenopus oocytes.</a> Sci Rep. 3, 1040(2013).</li>
<li>Jeschke, G., Polyhach, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distance+measurements+on+spin-labelled+biomacromolecules+by+pulsed+electron+paramagnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Distance measurements on spin-labelled biomacromolecules by pulsed electron paramagnetic resonance.</a> Phys Chem Chem Phys. 9, 1895-1910 (2007).</li>
<li>Pannier, M., Veit, S., Godt, A., Jeschke, G., Spiess, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dead-time+free+measurement+of+dipole-dipole+interactions+between+electron+spins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn+Reson%22%5BJournal%5D)">Dead-time free measurement of dipole-dipole interactions between electron spins.</a> J Magn Reson. 142, 331-340 (2000).</li>
<li>Mishra, S., Verhalen, B., Stein, R. A., Wen, P. C., Tajkhorshid, E., McHaourab, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+dynamics+of+the+nucleotide+binding+domains+and+the+power+stroke+of+a+heterodimeric+ABC+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Conformational dynamics of the nucleotide binding domains and the power stroke of a heterodimeric ABC transporter.</a> Elife. 3, e02740(2014).</li>
<li>Farahbakhsh, Z. T., Altenbach, C., Hubbell, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin+labeled+cysteines+as+sensors+for+protein-lipid+interaction+and+conformation+in+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Spin labeled cysteines as sensors for protein-lipid interaction and conformation in rhodopsin.</a> Photochem Photobiol. 56, 1019-1033 (1992).</li>
<li>Caterina, M. J., Schumacher, M. A., Tominaga, M., Rosen, T. A., Levine, J. D., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+capsaicin+receptor%3A+a+heat-activated+ion+channel+in+the+pain+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway.</a> Nature. 389, 816-824 (1997).</li>
<li>McHaourab, H. S., Steed, P. R., Kazmier, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+fourth+dimension+of+membrane+protein+structure%3A+insight+into+dynamics+from+spin-labeling+EPR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Toward the fourth dimension of membrane protein structure: insight into dynamics from spin-labeling EPR spectroscopy.</a> Structure. 19, 1549-1561 (2011).</li>
<li>Jeschke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEER+distance+measurements+on+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">DEER distance measurements on proteins.</a> Annu Rev Phys Chem. 63, 419-446 (2012).</li>
<li>Jeschke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distance+measurements+in+the+nanometer+range+by+pulse+EPR%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%22%5BJournal%5D)">Distance measurements in the nanometer range by pulse EPR.</a> Chemphyschem. 3, 927-932 (2002).</li>
<li>Chiang, Y. W., Borbat, P. P., Freed, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+determination+of+pair+distance+distributions+by+pulsed+ESR+using+Tikhonov+regularization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn+Reson%22%5BJournal%5D)">The determination of pair distance distributions by pulsed ESR using Tikhonov regularization.</a> J Magn Reson. 172, 279-295 (2005).</li>
<li>He, Y., Wang, K., Yan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+recombinant+expression+systems+for+structure+determination+of+eukaryotic+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">The recombinant expression systems for structure determination of eukaryotic membrane proteins.</a> Protein Cell. 5, 658-672 (2014).</li>
<li>Ghimire, H., McCarrick, R. M., Budil, D. E., Lorigan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significantly+improved+sensitivity+of+Q-band+PELDOR%2FDEER+experiments+relative+to+X-band+is+observed+in+measuring+the+intercoil+distance+of+a+leucine+zipper+motif+peptide+%28GCN4-LZ%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Significantly improved sensitivity of Q-band PELDOR/DEER experiments relative to X-band is observed in measuring the intercoil distance of a leucine zipper motif peptide (GCN4-LZ).</a> Biochemistry. 48, 5782-5784 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

İfade ve memeli membran proteinlerinin arınma için güncel teknolojileri protein spektroskopik çalışmalar14,15,16,42için yeterli miktarda elde etmek mümkün kılmıştır. Burada, hızlı, arındırmak, yeniden oluşturma ve spektroskopik çözümlemesi TRPV1 içinde bu teknolojiler adapte olması.
Arasında protokol kritik adımlarda, aşağıda TRPV1 için troubleshot olanlar ve bu diğe...

Tek-parçacık cryo-elektron mikroskobu (cryo-EM) son gelişmeler ile olağanüstü bir hızla memeli iyon kanal yapıları elde edilmiştir. Özellikle, polymodal iyon kanalları, geçici reseptör potansiyel vanilloid 1 (TRPV1), gibi yapısal çalışmaların daha fazla anlayış onun harekete geçirmek mekanizmaları1,2,3, sağladı 4 , 5. ancak, dinamik bir membran ortamında gömülü iyon kanalları vukuf onların polymodal perdeleme ve uyuşturucu bağlama düzenekleri anlamak için gereklidir.
Elektron paramagnetic rezonans (EPR) ve çift elektron-elektron rezonans (geyik) spectroscopies iyon kanalları6,7,8,9 için en kesin mekanik modellerin bazıları hazırladık , 10 , 11 , 12 , 13. bu yaklaşımlar prokaryotik incelenmesi için esas olarak sınırlı olmuştur ve archeal iyon kanalları çok miktarda bakteri overexpressed zaman deterjan saf protein verim. Ökaryotik membran protein üretiminde böcek ve fonksiyonel ve yapısal karakterizasyon14,15,16memeli hücreleri gelişmesiyle birlikte, şimdi biyokimyasal elde etmek mümkündür miktarda deterjan saf protein spektroskopik çalışmalar için.
EPR ve geyik sinyalleri bir tek-sistein kalıntı proteini içerisinde bağlı bir paramagneticspin etiket (SL) (Örneğin, methanethiosulfonate) ortaya. Spin-Etiketler üç yapısal bilgi türlerinden rapor: hareket, eriþebilirlik ve mesafeler. Bu bilgiler tortular protein içinde gömülü veya membran veya apo ve ligand bağlı Birleşik13,17,18,19sulu ortamda maruz belirleme sağlar. Yüksek çözünürlüklü bir yapı (varsa) bağlamında, EPR ve geyik veri dinamik modeller kendi doğal ortamlarında tersinir gating geçiş (yani, kapalı, açık, süre izleme türetmek için kısıtlamalar topluluğu sağlar. duyarlı ve desensitized). Ayrıca, x-ışını kristalografisi veya cryo-EM tarafından belirlemek zor olabilir esnek bölgeleri ikincil yapılar yanı sıra protein20içinde yer atamak için bu çevresel veri kümeleri kullanarak elde edilebilir. Cryo-EM yapıları lipid nanodiscs elde edilen sağlanan iyon geçişi hakkında değerli bilgi kanalları3,21,22,23,24, 25; Ancak, spektroskopik yaklaşımlar cryo-EM kullanarak belirlemek zor olabilir konformasyon Birleşik (Örneğin, termal değişiklikler) üzerinden dinamik bilgi sağlayabilir.
EPR ve geyik tüm sistein kalıntıları (özellikle bol miktarda memeli kanalları), düşük protein verim, protein istikrarsızlık arıtma sırasında ve sonrasında spin etiketleme kaldırırken protein fonksiyon eksikliği de dahil olmak üzere, uygulamak için birçok zorlukların üstesinden gelmek ve deterjan veya lipozomlar protein toplama. Burada, bu kritik engellerin üstesinden gelmek ve bir memeli duyusal reseptör için geyik ve EPR spectra bilgilerini aldıysanız protokolleri tasarladık. Burada amaç ifade, arıtma, etiketleme ve sulandırma fonksiyonel en az sistein-az sıçan TRPV1 (eTRPV1) spektroskopik analizleri için oluşturmak için yöntemleri tarif etmektir. Bu metodoloji işlevlerine sistein kalıntıları kaldırılması rağmen tutmak veya disülfür bağları oluşturan sistein içeren bu membran proteinlerinin için uygundur. Bu koleksiyon iletişim kurallarının diğer memeli iyon kanalları spektroskopik analiz için adapte.

<table><tbody><tr><td>QuikChange Yıldırım Sahaya Yönelik Mutajenez Kiti</td><td>Agilent Technologies</td><td>210519-5</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol (İzopropanol)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416</td><td></td></tr><tr><td>Albümin Sığır Serumu (BSA)</td><td>GoldBio.com</td><td>A-420-10</td><td></td></tr><tr><td>Amiloz reçinesi</td><td>NEB</td><td>E8021L</td><td></td></tr><tr><td>Arotinin</td><td>GoldBio.com</td><td>A-655-25</td><td></td></tr><tr>Soya <td>Fasulyesi Sigma</td><td>11145</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Bac-to-Bac Baculovirus Ekspresyon Sisteminden Asolektin</td><td>Invitrogen Yaşam Teknolojileri</td><td>10359016</td><td></td></tr><tr><td>Biobeads SM-2 Adsorbanları&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikat cam pipetler (3.5 '') (oosit inhiksiyonu)</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203 G/X</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikat cam pipetler (oosit kayıtları)</td><td>Sutter Instrument</td><td>B150-110-10HP</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 2H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>Karbenisilin (Disodyum)</td><td>GoldBio.com</td><td>C-103-5</td><td></td></tr><tr><td>Cellfectin Reaktifi</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10362-010</td><td></td></tr><tr><td>cellSens</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>C606SK</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz Tip 1</td><td>Worthington-Biochem</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>Critiseal</td><td>VWR</td><td>18000-299</td><td></td></tr><tr><td>D- (+) - Glikoz</td><td>Sigma ve nbsp;</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Maltoz Monohidrat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP684</td><td></td></tr><tr><td>DDM (n-Docesil-BD-Maltopiranosid)</td><td>Anatrace</td><td>D310S</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek glikozlu ortam (Dulbecco' s Modifiye Kartal' s Orta)</td><td>Sigma</td><td>D0572&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık PD-10 Tuz Giderme Kolonları</td><td>GE Healthcare</td><td>45-000-148</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>O2783</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Invitrogen Yaşam Teknolojileri</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>GenCatch Plus Plazmid DNA Mini Hazırlık</td><td>Kiti Epoch Life Science, Inc</td><td>2160250</td><td></td></tr><tr><td>GenCatch PCR Temizleme Kiti</td><td>Epoch Life Science, Inc</td><td>2360050</td><td></td></tr><tr><td>Gentamisin Sülfat</td><td>Lonza</td><td>17-518Z</td><td></td></tr><tr><td>Cam kılcal damar (25 ve mikro; l)</td> <td>VWR</td><td>53432-761</td><td></td></tr><tr><td>Cam Şişe 2800 mL</td><td>Pyrex USA</td><td>4423-2XL</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol Fisher</td><td>BioReagents</td><td>BP229</td><td></td></tr><tr><td>HEK293S GnTl-ATCC</td><td></td> <td>CRL-3022</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (izopropil-tiyo-B-galaktozit GoldBio.com</td><td></td> <td>I2481C25</td><td></td></tr><tr><td>Kanamisin Sülfat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Kimyasal</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>LB Et Suyu, Miller</td><td>Fisher bioReaktifler</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin Hemisülfat</td><td>GoldBio.com</td><td>L-010-5</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamin 2000</td><td>Invitrogen Yaşam Teknolojileri</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 6H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 7H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T7 Kiti</td><td>Ambion</td><td>AM1344</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fisher bioReagents</td><td>BP2936</td><td></td></tr><tr><td>MTSL (1-Oksil-2,2,5,5-tetrametilpirolidin-3-il) Metil Metanetisüfonat</td><td>Toronto Araştırma Kimyasalları, Inc</td><td>O873900</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>Kimyasal S271</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>31985-062</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin A</td><td>GoldBio.com</td><td>P-020-5</td><td></td></tr><tr><td>Plüronik Asit F-127 (% 20)</td> <td>PromoKine ve nbsp; &nbsp;</td><td>CA707-59004</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>GoldBio.com</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizin Çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Mühürlü kılcal</td><td>VitroCom</td><td>özel sipariş</td><td></td></tr><tr><td>SF-900 II SFM (böcek hücresi ortamı)</td><td>Gibco, Yaşam Teknolojileri</td><td>10902-088</td><td></td></tr><tr><td>Sf9 Hücreler (SFM Uyarlanmış)</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>11496-015</td><td></td></tr><tr><td>Soya Fasulyesi Polar Lipid Özü Avanti</td><td>Polar Lipids, Inc</td><td>541602C</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25590</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 Artış 10/300 GL</td><td>GE Sağlık</td><td>29091596</td><td></td></tr><tr><td>TCEP HCl</td><td>GoldBio.com</td><td>TCEP1</td><td></td></tr><tr><td>Tetrasiklin Hidroklorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP912-100</td><td></td></tr><tr><td>Tris Baz</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>Tripton</td><td>Difco</td><td>0123-01</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>GoldBio.com</td><td>X4281C</td><td></td></tr><tr><td>Xenopus oositleri</td><td>Nasco</td><td>LM00935M</td><td></td></tr><tr><td>XL1 - Mavi Yetkili Hücreler</td><td>Agilent Technologies, Inc</td><td>200249</td><td></td></tr><tr><td>Maya Özü</td><td>Difco</td><td>0127-01-7</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pack kromatografi kolonu</td><td>Bio-Rad</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX Lekesiz Prekast Jeller</td><td>Bio-Rad</td><td>17000436</td><td></td></tr><tr><td>pFastBac1 İfade Vektörü</td><td>Invitrogen Yaşam Teknolojileri</td><td>10360-014</td><td></td></tr><tr><td>DH10Bac Yetkin Hücreler</td><td>Invitrogen Yaşam Teknolojileri</td><td>10361-012</td><td></td></tr><tr><td>Critiseal kılcal boru sızdırmazlık maddesi</td><td>Leica Microsystems</td><td>02-676-20</td><td></td></tr><tr><td>ABI Model 3130XL Genetik Analiz Cihazları</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4359571</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipeti</td><td>Fishebrand</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr></tbody></table>

arıtma ve trpv1 sulandırma spektroskopik analizi için

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Polymodal iyon kanalları farklı doğada birden çok uyaranlara allosteric değişiklikler transduce; Bu dinamik biçimler belirlemek ve büyük ölçüde bilinmeyen kalmak için zorlu. Agonist bağlayıcı siteleri yapısal özellikleri ve birkaç iyon kanalları etkinleştirme mekanizması tek-parçacık cryo-elektron mikroskobu (cryo-EM) dökülme ışık son gelişmeler ile sahne onların perdeleme derinlemesine bir dinamik analiz için hazır Spektroskopik yaklaşımları kullanarak mekanizmaları. Spektroskopik teknikleri elektron paramagnetic rezonans (EPR) ve çift elektron-elektron rezonans (geyik) gibi esas olarak büyük miktarlarda saf prokaryotik iyon kanalları incelenmesi için sınırlı olmuştur. Fonksiyonel ve istikrarlı membran proteinlerinin büyük miktarda gereksinimini memeli iyon kanalları bu yaklaşımları kullanarak çalışma engel. EPR ve geyik birçok avantaj, x-ışını kristalografisi veya cryo-EM tarafından elde etmek zor olabilir, düşük çözünürlükte olsa, yapısının belirlenmesi ve mobil protein bölgelerin dinamik değişiklikler dahil olmak üzere ve geri dönüşümlü geçişi izleme sunar geçiş (sensitize ve desensitizedyani, kapalı, açık,). Burada, biz iletişim kuralları için EPR ve GEYİĞE Spektroskopi etiketli deterjan çözündürüldükten fonksiyonel geçici reseptör potansiyel ba * kanal Alt familya V üye 1 (TRPV1) miligram almak için sağlar.

En az sistein-az TRPV1 oluşturmak (eTRPV1) ve tek-sistein mutantlar fonksiyonel karakterizasyonu
Spektroskopik çalışmalar doğru ilk adım mühendisi ve fonksiyonel ve biyokimyasal proteinler miktarlarda verim sistein-az protein yapıları (Şekil 2A) karakterize olduğunu. eTRPV1 Ca2 + görüntüleme ve TEVC (Şekil 2B-C) tarafından belirlenen işlevseldir...

Bu makalede biyokimyasal miktarda deterjan çözündürüldükten TRPV1 spektroskopik analiz için elde için belirli yöntemleri açıklar. Kombine protokoller memeli iyon kanalları membran kontrollü bir ortamda yapısal ve fonksiyonel çalışmaları kolaylaştırmak için uyarlanmış Biyokimya ve biyofizik araçları sağlar.

Arıtma ve TRPV1 sulandırma spektroskopik analizi için

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Laboratuvarda, spektroskopik bir yaklaşım kullanmanın, geçici reseptör potansiyel iyon kanalı ailesindeki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabileceğini düşünüyoruz. Polimodal aktivasyon ile ilişkili dinamik bilgi değişikliklerinin belirlenmesi gibi. Bu protokolün ana avantajı, elektron paramanyetik rezonans ve çift elektron elektron rezonans epitroskopisi için miligram saf ve fonksiyonel kalan iyon kanalına izin vermesidir.Bu yöntem, 3B1'in termal ve ışıktan bağımsız kapılaması ile uyumlu konformasyonel değişiklikler hakkında bilgi sağlayabilir. Örneğin, 3B2 gibi diğer açma kanallarına da uygulanabilir. Bu prosedüre çevrimiçi araçlarla tasarım mutajenez primerleri ile başlayın.PCR reaksiyonunu metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlayın ve karışımı döndürün. Tüpleri termosiklere yerleştirin ve metin protokolünde listelenen PCR parametrelerini kullanarak PCR mutajenezi gerçekleştirin. Daha sonra reaksiyona iki mikrolitre DPN1 enzimi ekleyin ve karıştırın.Reaksiyonları 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Ardından, önceden soğutulmuş 14 mililitrelik steril bir tüpe 75 mikrolitre çözülmüş E.Coli yetkin hücresi ve 10 mikrolitre DPN1 ile muamele edilmiş PCR karışımı ekleyerek dönüşümü gerçekleştirin. Yavaşça karıştırdıktan sonra, reaksiyonu buz üzerinde 30 dakika inkübe edin.Tüpü 45 saniye boyunca 42 santigrat derecede tutun ve ardından hemen iki dakika boyunca buzun üzerine koyun. Karışımı karbenisilin içeren bir LB agar plakası üzerine koyun ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Tek kolonileri hasat ettikten ve metin protokolünde açıklandığı gibi gecelemeleri hazırladıktan sonra, gece boyunca kültürleri 10 dakika boyunca 8000 kez G'de döndürün.Ardından, piyasada bulunan mini hazırlama kitlerinin talimatlarını izleyerek DNA'yı çıkarın. Rekombinant bacmid oluşturmak için, 100 mikrolitre DH10bac E.Coli yetkin hücresini 7.5 nanogram rekombinant donör vektörü ile dönüştürün. Vektörler, fonksiyonel minimal sisteinsiz sıçan TRPV1, kısaltılmış eTRPV1 ve/veya tek sistein mutantlarını içerir.Metin protokolünde açıklandığı gibi hücreleri tohumladıktan ve inkübe ettikten sonra, mavi koloniler ilgilenilen ekten yoksun olduğu için iki milimetre çapında beyaz kolonileri seçin. Beyaz kolonilerin herhangi bir mavi nokta içermediğini doğrulamak için bir stereo mikroskop kullanın. En az üç tek koloniyi hasat edin ve bunları dört mililitre takviyeli LB ortamı içeren 14 mililitrelik steril bir tüpe aktarın.Hücreleri gece boyunca 250 RPM'de 37 santigrat derecede inkübe edin. Gece boyunca 1.5 mililitre kültür alın ve rekombinant bacmid DNA'sını izole edin. Rekombinant bakulovirüsü oluşturmak için, iki milimetre böcek hücresi ortamında bir milyon SF9 hücresi yerleştirin.Hücrelerin en az 45 dakika bağlanmasına izin verin. Bir mililitre taze ortamla bir kez yıkadıktan sonra, yıkama ortamını çıkarın ve hücrelere DNA transfeksiyon reaktif karışımı ekleyin. Hücreleri çalkalama olmadan beş saat boyunca 27 santigrat derecede inkübe edin.İnkübasyonun ardından, transfeksiyon karışımını çıkarın ve% 0.5 fetal sığır serumu içeren iki mililitre böcek hücresi ortamı ile değiştirin. Ardından, hücreleri beş gün boyunca 27 santigrat derecede inkübe edin. Hücre kültürü ortamını 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.Tüpü 4 santigrat derecede 15 dakika boyunca 8000 kez G'de döndürerek viral stoğun ilk geçişini izole edin. Süpernatanı 15 mililitrelik temiz bir santrifüj tüpüne aktarın ve hemen dört santigrat derecede saklayın. İkinci nesil viral stoktan, 125 mililitrelik bir şişeye %2 FBS içeren mililitrede bir milyon SF9 hücresinde 25 mililitrelik bir böcek hücresi ortamı süspansiyon kültürünü pipetleyin.25 mililitre kültüre 25 mikrolitre P1 virüsü ekleyin. Daha sonra kültürü 27 santigrat derecede 72 saat inkübe edin. P2 viral stoğunu hasat etmek için, kültürü 50 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 8000 kez G'de santrifüjleyin.Süpernatanı 50 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve hemen dört santigrat derecede saklayın. Bir litrelik kültüre bir mililitre P2 virüsü stoğu ekleyin ve 27 santigrat derecede 72 saat inkübe edin. Bir litrelik böcek hücresi süspansiyon kültürünü, dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 4500 G'de döndürerek hasat edin.Hücre peletini tartın. Altı ila dokuz gram civarında olması bekleniyor. Hücre peletini proteaz inhibitörlerinin varlığında 25 mililitre buz gibi soğuk tampon A'da yeniden süspanse edin.Homojen bir süspansiyon elde etmek için hücre kümelerini ayırın ve 20 dakika boyunca dört santigrat derecede döndürün. Hücreleri manuel veya yüksek basınçlı homojenizatör kullanarak kırın. Hücre kalıntılarını dört santigrat derece boyunca 20 dakika boyunca 8000 kez G'de santrifüjleme ile çıkardıktan sonra, süpernatanı toplayın ve dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 100.000 kez G'de tekrar santrifüjleyin.Santrifüjlemeyi takiben, süpernatanı atın ve membran peletini proteaz inhibitörleri ile desteklenmiş toplam 20 mililitre buz gibi soğuk tampon B hacminde askıya alın. 50 mililitrelik tüplere 20 mililitre membran süspansiyonu ekleyin. Protein saflaştırmasını gerçekleştirmek için tüp başına üç mililitre DDM ekleyin.Tüpleri dört santigrat derecede iki saat döndürün. Numuneyi dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 100.000 kez G'de santrifüjledikten sonra, süpernatanı toplayın ve bir mililitre temiz, ıslak amiloz reçinesi ekleyin. Karışımı dört santigrat derecede iki saat döndürün.Daha sonra protein amiloz karışımını yerçekimi akış kromatografisi kolonlarına yükleyin. Proteine bağlı amiloz reçinesini, buz gibi soğuk tampon C'nin yatak hacminin 10 katı ile yıkayın, ardından 10 yatak hacmi buz gibi soğuk tampon D.Elute eTRPV1 proteini, 0.5 mililitrelik fraksiyonlarla, beş mililitreye kadar buz gibi soğuk gazı alınmış tampon D ile desteklenmiş 20 milimolar maltoz ile desteklenmiştir. Yıkamaları ve elüsyonu dört santigrat derecede gerçekleştirin.100 kilodaltonluk bir kesme santrifüj filtre ünitesi kullanarak, etiketleme için fraksiyonları içeren eTRPV1'i mililitre başına iki ila 2,5 miligram arasında konsantre edin. Daha sonra, DMSO'daki 100 milimolar stok çözeltisinden konsantre proteine on kat fazla MTSSL spin etiketi ekleyin. Bunu her 30 dakikada bir iki kez tekrarlayın.Reaksiyonu karanlıkta oda sıcaklığında bir saat 30 dakika tutun, ardından gece boyunca dört santigrat derecede inkübasyon yapın. Ardından, hızlı bir protein sıvı kromatografi sistemi tarafından kontrol edilen, tampon E'de dengelenmiş bir boyut dışlama kromatografi sütunu üzerindeki döndürme etiketini eTRPV1'e yükleyin. eTRPV1 tetramer içeren fraksiyonları toplayın.10 miligram asolektini 40 santigrat derecede bir saat boyunca vakum altında döner bir buharlaştırıcı kullanarak kurutun. Azolektin lipozomları yapmak için, bir mililitre tampon F ekleyin ve karışımı 15 dakika boyunca veya numune homojen olana kadar sonikleştirin. İki milimolar nihai konsantrasyona DDM ekleyerek lipozomların dengesini bozun ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.Karışımı, metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi DDM kritik misel konsantrasyonuna ayarladıktan sonra, protein lipozom karışımının hacmini tampon F ile iki katına çıkarın. Oda sıcaklığında hafif çalkalama ile bir saatlik aralıklarla üç adet polar olmayan polistiren emici boncuk ekleyerek deterjanı çıkarın. Boncukları çıkarmak için karışımı bir kolon filtreye yükleyin ve proteolipozom karışımını bir ultra santrifüj tüpüne aktarın. Numuneleri dört santigrat derecede bir saat boyunca 100.000 kez G'de santrifüjleyin.Süpernatanı atın ve peleti 30 mikrolitre tampon F içinde yeniden süspanse edin ve ardından spektroskopik ölçümler ve analizler yapın. İlk kontrol noktası, ekspresyon ve saflaştırma protokollerini gerçekleştirmeden önce tek sistein mutantlarının fonksiyonel analizidir. Burada, yabani tip TRPV1, eTRPV1 ve mutantları eksprese eden hek293 hücreleri, floresan kalsiyum görüntüleme kullanılarak kapsaisin ile uyarılmış yanıtlar için analiz edildi.İkinci kontrol noktası, sulandırma ve spektroskopik analize devam etmeden önce boyut dışlama kromatografisi yoluyla spin etiketli tek sistein mutantlarının biyokimyasal karakterizasyonudur. Üçüncü kontrol noktası, spektroskopik analize başlamadan önce sulandırılmış spin etiketli tek sistein mutantlarının fonksiyonel karakterizasyonudur. A702C etiketli spin içeren proteolipozomlarla mikro enjekte edilen Xenopus oositlerinden iki elektrot voltaj kelepçesi ile belirlenen akım voltaj ilişkileri, pH5 ile sorgulandı ve kapsazepin tarafından bloke edildi.Son olarak, sürekli dalga EPR ile belirlenen spin etiketli eTRPV1 mutantlarının hareketliliklerini elde etmek mümkündür. İlk türev spektrumları, DDM çözeltisinde spin etiketli sistein mutantları için gösterilir ve azolektin lipozomlarında yeniden oluşturulur. Deterjan içindeki spin etiketli eTRPV1 mutantlarının mesafeleri ve hareketlilikleri de DEER tarafından belirlendi.Spin etiketli mutant E651C'nin DEER yankısı ve mesafe dağılımı gösterilmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, spektroskopik analiz için bir memeli iyon kanalının nasıl ifade edileceğini, güzelleştirileceğini ve yeniden oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız. Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler, sistein kalıntılarını giderirken protein fonksiyonunun olmaması, düşük protein verimi ve saflaştırmada ve spin etiketlemeden sonra protein kararsızlığı ve deterjan veya lipozomlarda protein agregasyonu nedeniyle mücadele edeceklerdir.Geliştirilmesinden sonra, bu protokoller, TRPV1 polimodal geçit için mekanik modelleri keşfetmek için mesafe ve dinamik değişikliklerin elde edilmesine izin verecektir.

purification-and-reconstitution-of-trpv1-for-spectroscopic-analysis

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Biz, ATP-kapılı P2X2 reseptörlerinin tam uzunlukta C terminus bağlamak beyin proteinleri tespit etmek için basit bir protokol açıklar. Bu yaklaşımın uzantısı ve sistematik bir uygulama tüm p2x reseptörlerine p2x reseptör sinyal daha iyi anlaşılmasına yol açması bekleniyor.

P2X2 Ligandla Gated Katyon Kanalları ile etkileşimde Proteinler tanımlamak için Proteomik

Isotachophoresis (ITP) toksini tanıma ve numune hazırlama kadar uygulamaları ile sağlam bir elektrokinetik ayırma ve zenginleştirme tekniktir. Ayırma ve küçük moleküller ve hücre kültürü lizatı nükleik asitlerin saflaştırılması tespiti: Biz ITP fiziksel prensipleri ve iki özel örnek uygulamalar için bu tekniği uygulayarak metodolojisi gözden geçirin.

İyonların ayrılması ve Nükleik Asit Saflaştırılması için on-chip Isotachophoresis

Mikro Termoforosis (MST) yaygın olarak hücre lizatlarından hedef proteinin arıtılmadan bağlanma afinitesinin belirlenmesinde kullanılabilir. Protokol, GFP-kaynaşık proteini, denatüre edici olmayan koşullar hücre parçalama ve ligand arasında değişen konsantrasyonlarda varlığında MST sinyalinin tespiti arasında aşırı içerir.

Mikro Termoforosis tarafından Bağlama Affinity belirlenmesi Protein Saflaştırma-ücretsiz Yöntemi

TRPV4 en incelemek için yaygın olarak kullanılan yöntemler tamamlamak için, iki yöntem tarif edilmiştir: Onun mechanosensitivity hipo-ozmotik tehdidi üzerine transgenik maya Ca 2 +-akorinden luminometri ele alınabilir. Ayrıca TRPV4-RNA incelenebilir on-hücre ya da kesilmiş modunda kelepçe bütün hücre iki elektrotlu voltaj kelepçe veya yama ile Xenopus oosit enjekte edilir.

Maya lüminometrik ve Xenopus Yumurta Elektrofizyolojik Sınavları

Protein fonksiyonunun temel adımları, özellikle omurga konformasyonel değişiklikleri ve proton transfer reaksiyonları, genellikle mikrosaniye ila milisaniye zaman ölçeğinde gerçekleşir. Bu dinamik süreçler, özellikle işlevi ışık tarafından tetiklenen proteinler için, zaman çözümlü adım taramalı Fourier dönüşümü kızılötesi spektroskopisi ile incelenebilir.

Tarafından Işığa Proteinler Proton Transferi ve Protein Konformasyon Dynamics Zamanda çözülmüş kızılötesi spektroskopi Fourier-dönüşümü Step-tarama

electroformation ve jel destekli şişme - dev tek tabakalı veziküller (GUVs) içine transmembran protein, KvAP, şifreden iki dehidrasyon-rehidrasyon yöntemleri için gösterilmiştir. Her iki yöntemde de, protein içeren küçük tek lamelli kesecikler, sonra, flüoresans mikroskopisi ve yama klempi elektrofizyoloji ile incelenebilir GUVs oluşturmak üzere bir araya birleştirilir.

Bir transmembran proteinin yeniden oluşturulması, Mikroskop ve yama kelepçe Çalışmaları Dev tek-katmanlı keseler içine Voltaj kapılı iyon kanalı, KvAP,

Bu el yazması, işlevselleştirilmiş düzlemsel destekli lipid çift tabakası ile temas halinde olan bir T hücresinin immünolojik sinapsı içinde meydana gelirken, T hücresi antijen reseptörü (TCR) ile antijenik peptit yüklü MHC molekülleri arasındaki bağlanma dinamiklerini ölçmek için (tek moleküllü) Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) tabanlı testlerin nasıl yapılacağını açıklar.

TCR-pMHC Bağlama Ölçüm<em&gt; In Situ</em&gt; Bir FRET tabanlı Mikroskopi Assay kullanılarak

bir heterolog ifade sistemi ile incelenmesi iyon kanalları biyomedikal araştırmalarda bir çekirdek tekniği haline gelmiştir. Bu yazıda, bir uyarılabilir promoterin kontrolü altında geçici transfeksiyon gerçekleştirerek sıkı bir şekilde kontrol iyon kanal ekspresyonunu elde etmek için bir zaman etkili bir yöntem sunmaktadır.

İndüklenebilir geçici transfeksiyon yoluyla kontrol edilebilir iyon kanal İfade

Bu iletişim kuralı tarafından cryo-elektron mikroskobu, verimli bir şekilde en az çaba ve toksisite, protein ayıklama, arıtma ile memeli hücrelerinde genlerin ifade etmek için kullanılan bir baculovirus sistemi de dahil olmak üzere iyon kanal yapılarını belirlemek için kullanılan teknikler açıklanır, ve kalite kontrol, örnek kılavuz hazırlık ve tarama, hem de veri toplama ve işleme.

İfade ve insan Lipid duyarlı ba * kanal TRPC3 arınma için tek-parçacık Cryo-elektron mikroskobu ile yapısal kararlılık

INAD protein kompleksinin montaj mekanizmasına dayanarak, bu protokolde, endojen Drosophila TRP kanalını saflaştırmak için modifiye edilmiş bir afinite saflaştırma artı rekabet stratejisi geliştirilmiştir.

Endojen Drosophila Geçici Reseptör Potansiyel Kanallarının Saflaştırılması

Bu protokol, moleküler kütlenin ve lipit membranlarla etkileşime giren makromoleküllerin difüzyon davranışının eşzamanlı olarak araştırılmasını sağlayan iSCAT tabanlı bir görüntü işleme ve tek parçacık izleme yaklaşımını açıklar. Numune hazırlama, kütleden kontrasta dönüştürme, film edinme ve son işleme için adım adım talimatlar, olası tuzakları önlemek için talimatlarla birlikte sağlanır.

Membranla İlişkili Makromolekül Dinamiğini Karakterize Etmek için Kütleye Duyarlı Partikül İzleme

Öğrenin, TRPV1 iyon kanalının arıtma ve spektroskopik analiz yöntemlerini. EPR ve DEER teknikleriyle konformasyonel değişiklikleri inceleyerek memeli iyon kanallarının yapısal ve fonksiyonel özelliklerini keşfedin.

Arıtma ve TRPV1 sulandırma spektroskopik analizi için

Daha fazla video keşfet