Name: Yumuşak silikon yüzeylerde sertlik ölçüm Widefield floresan mikroskop kullanarak Mechanobiology çalışmaları için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Öğrenin, yumuşak silikon jellerde Young modülünü geniş alan floresan mikroskop kullanarak ölçme yöntemini. Bu teknik, mekanobiyolojide hücrelerin substrat sertliğine yanıtlarını incelemek için araştırmacılara kolay erişilebilir bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Margaret Gardel cömertçe rheometer kullanımına izin verdiğiniz için teşekkür ederim. Bu eser etkin NIH (1R15GM116082) destek anıyoruz.

1. yumuşak silikon substrat imalatı
<ol><li>1,75 g bir bileşeni ve B bileşeni 1,75 gram ağırlığında (A:B = 1:1) (Polistiren) kullanarak yumuşak silikon elastomer Seti'nden tepsiler ağırlığında.</li>
	<li>B bileşeni tartı tepsisinde bir bileşeni eklemek ve bunları birlikte 5 min için bir uygun aplikatör stick kullanarak karıştırın.</li>
	<li>Yukarıdaki karışımı bir 35 mm Petri kabına ekleyin. Eşit yayılmış Petri kabına birkaç dakika karışım izin verin. Not: Seçtiğiniz bir Petri kabına çapı ve yumuşak silikon miktarı yumuşak silikon kalınlığı belirler. Burada, kalınlığı yaklaşık 3.5 mm olacak; tartışma bölümünde elastomer kalınlığı belirlemeyle ilgili daha çok.</li>
	<li>Herhangi bir hava kabarcıkları kaldırmak 15 dakika vakum odasında, kapak ile silikon karışımı ile Petri kabına yerleştirin. Bu süre içinde sıcak bir tabak ile 70 ° c ön ısı</li>
	<li>70 ° C sıcak plaka ulaştıktan sonra bir cam slayt üzerine yerleştirin ve cam slayt üzerinde silikon karışımı ile Petri kabına yerleştirin. Silikon izin tedavi için 30 dk 70 ° c. Petri kabına erime gibi polistren çanak doğrudan sıcak tabakta koymayın.</li>
</ol>2. yumuşak silikon için floresan lastikteki kaplin
<ol><li>Tedavi yumuşak silikon (içinde ele geçen Petri kabına) derin bir UV odası (185 ve 254 nm ışık dalga boylarında ve derin bir UV lamba ile bir kasada) yerleştirin. Yumuşak silikon örnek (~ 5-10 cm uzaklıkta UV lambası) derin UV ışık için 5 min için maruz.<ol>
<li>Silikon derin UV ışığına maruz iken, aşağıdaki adım 2.2-2.6 ile devam edin. Derin UV Işınlarına maruz kalma sonra örnek almadan önce en az 5 min için derin UV odası degas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bu arada, 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) 1.5 mL microcentrifuge tüp içinde 19 mg dışarı tartmak ve 500 μL deiyonize su (DI) su ekleyin. EDC tüpü hafifçe sallayarak geçiyoruz.</li>
	<li>Bir ayrı 1.5 mL microcentrifuge tüp N- hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) 11 mg tartmak, 500 μL DI su ekleyin ve tüpü hafifçe sallayarak sulfo NHS geçiyoruz. Sonra bir tek microcentrifuge tüp EDC ve sulfo-NHS çözümlerinde birleştirir.</li>
	<li>Bu EDC/sulfo-NHS, 30 μL 0,44 mikron çapında kırmızı (veya Floresan Mikroskobu kullanılabilir filtre küpleri göre başka bir floresan renk) değiştiren karboksilat floresan lastikteki (ile % 1 w/v hisse senedi toplama) ekleyin.</li>
	<li>EDC/sulfo-NHS/boncuk karışıma kollajen 0,02 mg (dan fare kuyruğu, hisse senedi 4 mg/mL 0,02 M asetik asit konsantrasyonu) 0,02 mg/mL konsantrasyonu elde etmek için.</li>
	<li>Girdap EDC/NHS/boncuk/kollajen ben karışımı kısa bir süre boncuk eşit boyunca, kaplin önce dağınık emin olun.</li>
	<li>Pipet EDC/NHS/boncuk/kollajen 1 mL ben karışımı parafilm başka bir sığ, düz kapak (daha küçük çaplı) üzerine yerleştirilen bir parçası üzerinde. Yumuşak silikon yüzey karışımı bağlantı kurar ama doğrudan küçük Petri kabına kapağı aşağıdaki yüzey dokunmatik değil böylece bu karışım üzerinde yumuşak silikon ile Petri kabına tersine çevirin. Ters Petri kabına artırmak için bir veya iki cam slayt ters Petri kabına çubukları iki tarafında altında kullanın. Not: Lütfen adım 2.7 nasıl gerçekleştirildiğini görmek için Şekil 1 ' e bakın.</li>
	<li>Alüminyum folyo ile örnek kapak ve 30 dk için oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
	<li>Petri kabına yumuşak silikon ile kaldırın ve dik ayarlayın (silikon-yan).</li>
	<li>Yemek için PBS (pH 7,4) 2 mL ekleyerek yumuşak silikon yüzeyi fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) ile yıkayın. Birkaç dakika için oturup izin. PBS Aspire edin ve silikon PBS 2 mL ile tekrar yıkayın. Silikon tedavisi daha da yaklaşık bir gün ver. Bu nedenle, yumuşak silikon örnek 37 ° C'de gecede PBS içinde yerleştirin.</li>
</ol>3. küre Widefield floresan mikroskop kullanarak girinti ile silikon sertlik ölçümü
<ol><li>Petri kabına yumuşak silikon ile almak ve en az 1 mL silikon yüzeyi sıvı yüzeyinin altında birkaç mm için PBS içerdiğinden emin olun.</li>
	<li>Sivri uçlu cımbız kullanarak, beş 1 mm Zirkonyum küre indentors yumuşak silikon üzerinde bırakın. Küre sıvı orta bırakın ve bırakın, silikon katmanı ve diğer indentors konumunu uzak en az 5 indentor çapları kenarlarını uzak. Not: sıvı yüzeyi üzerinde bıraktığımda, küreler sıvı orta (float) girmek sıvı orta 's yüzey gerilimi nedeniyle başarısız olabilir.</li>
	<li>Petri kabına temel görüntüyü mümkün böylece Petri kabına yumuşak silikon ile mikroskop sahne alanı'nda yer.</li>
	<li>10 X amacı ile faz Imaging'i kullanma (Kuru 10 X gibi objektif na 0,30), bulun ve bir küre indentor odak haline getirmek.</li>
	<li>Bir faz görüntü bir bölümünün ya da indentor bütün al ve bu resmi kaydedin. Bir kiremit tarama varsa kullanır. İndentor görünür herhangi bir kusur varsa, atın ve eski yerine koymak o ile başka bir indentor.</li>
	<li>Çerçevenin sol kenar en az ~1.5 R indentor Merkezi'nden bir mesafe olması canlı faz görüntüleme altında indentor'ın kenar sola çevir. İndentor merkezinin sağ tarafında görüntü çerçeve sağ kenarına yakın görünür kalmasını sağlamak. Bir faz görüntü alın ve kaydedin.</li>
	<li>Kırmızı floresan kanal için aydınlatma için mikroskop ışık kaynağı geçin. X- ve y-küre indentor'ın merkezi altında kırmızı floresan lastikteki kadar değişmeden koordinatları ( x-y konumu indentor merkezinin içinde ancak çerçevenin sağ kenarına yakın), focus (azalış Z) aşağı odak dışında git.</li>
	<li>Lastikteki silikon (yakın görüntüleme çerçevesinin sol kenarı) indentor uzak üst tabakası içinde odak dışında gidene 0.5 µm her z-artışı için görüntü yığınıyla z al.</li>
	<li>Örnek olarak diğer indentors ile 3.4-3,8 arasındaki adımları yineleyin.</li>
</ol>4. silikon'ın sertlik (Young katsayısı) hesaplama
<ol><li>ImageJ, tıkırtı üstünde çizgi aracını kullanarak indentor faz görüntüyü açmak ve indentor'ın çapı piksel cinsinden ölçün. Tıklatın ve bir noktada indentor kenarda tutun kenarında taban tabana zıt bir noktasına imleci hareket ve uzunluğu, pixel imleç serbest bırakmadan önce ImageJ ana pencerenin durum çubuğunda görüntülenen dikkat edin.<ol>
<li>Analiz tıklatarak uzunluk birimi piksel olarak ayarlandığından emin olun | Ayarla ölçek ve uzunluk birimikontrol.</li>
		<li>İndentor'ın RADIUS piksel cinsinden nesnel büyütme ve CCD kamera piksel boyutunu dikkate alarak mikron için dönüştürmek (mikron R piksel CCD kamera piksel boyutunu mikron x = R / nesnel büyütme).</li>
	</ol>
</li>
	<li>(Eğer lastikteki kırmızı floresan) kırmızı kanal z yığını microbead görüntüleri ImageJ içinde dosyası açmak | Alma | Görüntü sırası ve yığındaki herhangi bir görüntü seçin ve yığın açmak için Tamam ' ı tıklatın. Not: F1 hangi lastikteki indentor Merkezi altında en iyi olası odakta ve F2 (at ~1.5 R boncuk merkezinden bölgesi) lastikteki çerçevenin sol kenar yakınındaki en iyi olası odakta olan çerçeve numarası çerçeve sayısıdır. Z-iki kare arasındaki farktır girinti derinlik δ.<ol>
<li>Çizgi aracı ImageJ kullanarak, görüntü iyi tanımlanmış bir microbead arasında bir çizgi çizin. Tıkırtı üstünde analiz | Profil Arsa ve farklı çerçeve seçerken boncuk Güncellenme Zamanı satır tarama yoğunluğu elde etmek için Live düğmesini tıklayın. Maksimum yoğunluk en yüksek değerini verir kare kare odak olarak seçilebilir.</li>
		<li>Z-artış z-yığın çerçeveler arasında 0.5 mikron olduğundan, mikron olarak δ girinti derinlemesine hesaplamak (F2-F1) = 0.5 x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yani üzerinde jel (eksi karşıt batmaz kuvvet), ağırlığı nedeniyle indentor tarafından sarf güç hesaplamak, girinti kuvvet F, (indentor - sıvı Orta yoğunluk yoğunluğu) x indentor x ivme yerçekimi nedeniyle hacmi olarak. Denklem F kullanın (4/3) x = (ρindentor - ρOrta) x (R3) x 3.142 indentor yarıçapı R nerede g x ρindentor olduğunu indentor, ρOrta yoğunluk sıvı Orta yoğunluk ve g ivmesi (9,81 m/s2) yerçekimi nedeniyle. Tüm miktarlar SI birimlerinde F (N) elde etmek için sağ taraftaki hızlı.</li>
	<li>Young katsayısı (E) değiştirilmiş bir11 Hertz model12 denklemi kullanarak silikon Hesapla: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57797/57797eq1.jpg"> Nerede: c = o; aşağıdaki Hertz modeli ifade değiştirir bir düzeltme faktörü v = Poisson oranı (0.5 incompressible malzemeler7gelince olarak alınan); silikon jel F = girinti kuvvet; R indentor RADIUS; = ve Δ girinti derinlik =. Tüm miktarlar SI birimlerinde E PA elde etmek için sağ taraftaki hızlı<ol>
<li>3aşağıdaki gibi düzeltme faktörü c Hesapla: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57797/57797eq2.jpg"> Nerede: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57797/57797eq3.jpg"> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57797/57797eq4.jpg">; ve <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57797/57797eq5.jpg">. Bu düzeltme faktörü ne zaman sadece yumuşak silikon de Petri kabına (veya sert silikon) (Bu durumda burada) onun altına'nin özel olarak kullanılmak üzere olduğunu belirtmek.</li>
		<li>S silikon eklendi ve Petri kabına çapı miktarına göre yumuşak silikon tabaka yüksekliği hesaplayabilirsiniz. Alternatif olarak, doğrudan silikon tabakanın alt ve üst yüzeyleri z koordinatını faz görüntüleme tarafından belirlenerek h elde etmek (küçük yabancı maddelerin her iki yüzeyde odak haline gelir). Bir büyük h için dikkat edin (s2 &gt; Rδ), düzeltme faktörü c yakın 1'dir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>4.1-4.4 her indentor için yineleyin. Young katsayısı silikon örnek için Ortalama Young katsayısı elde etmek için her indentor elde edilen ortalama.</li>
</ol>

<ol><li>Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+stiffness+dictates+development%2C+homeostasis%2C+and+disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression.</a> Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).</li>
<li>Pelham, R. J., Wang, Y. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (25), 13661-13665 (1997).</li>
<li>Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+movement+is+guided+by+the+rigidity+of+the+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell movement is guided by the rigidity of the substrate.</a> Biophysical Journal. 79, 144-152 (2000).</li>
<li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+cells+feel+and+respond+to+the+stiffness+of+their+Substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue cells feel and respond to the stiffness of their Substrate.</a> Science. 310, 1139-1143 (2005).</li>
<li>Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyacrylamide+hydrogels+for+cell+mechanics%3A+steps+toward+optimization+and+alternative+uses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses.</a> Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).</li>
<li>Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/0960-1317/24/3/035017/meta">Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017(2014).</li>
<li>Style, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+force+microscopy+in+physics+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Traction force microscopy in physics and biology.</a> Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).</li>
<li>Lee, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+the+cytoplasmic+domain+of+N-cadherin+reduces%2C+but+does+not+eliminate%2C+traction+force-transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Deletion of the cytoplasmic domain of N-cadherin reduces, but does not eliminate, traction force-transmission.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (4), 1640-1646 (2016).</li>
<li>Frey, M. T., Engler, A., Discher, D. E., Lee, J., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+methods+for+measuring+the+elasticity+of+gel+substrates+for+cell+culture%3A+microspheres%2C+microindenters%2C+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microscopic methods for measuring the elasticity of gel substrates for cell culture: microspheres, microindenters, and atomic force microscopy.</a> Methods Cell Biol. 83, 47-65 (2007).</li>
<li>Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+confocal+microscopy+indentation+method+for+hydrogel+elasticity+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement.</a> Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).</li>
<li>Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+elastic+moduli+of+thin+layers+of+soft+material+using+the+atomic+force+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope.</a> Biophysical Journal. 82 (5), 2798-2810 (2002).</li>
<li>Hertz, H. <a target="_blank" href="https://www.degruyter.com/view/j/crll.1882.issue-92/crll.1882.92.156/crll.1882.92.156.xml">Über die Berührung fester elastischer Körper.</a> Journal für die reine und angewandte Mathematik. 92, 156-171 (1882).</li>
<li>Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. Protein micropatterns: a direct printing protocol using deep UVs. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0091679X10970088">Microtubules: In Vivo</a>. Cassimeris, L., Tran, P. , Academic Press. Burlington, San Diego. 133-146 (2010).</li>
<li>Bashirzadeh, Y., Qian, S., Maruthamuthu, V. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0924424717321118">Non-intrusive measurement of wall shear stress in flow channels.</a> Sensors and Actuators A: Physical. 271, 118-123 (2018).</li>
<li>Muhamed, I., Chowdhury, F., Maruthamuthu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+tools+to+study+cellular+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Biophysical tools to study cellular mechanotransduction.</a> Bioengineering (Basel). 4 (1), 12(2017).</li>
<li>Dumbali, S. P., Mei, L., Qian, S., Maruthamuthu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+sheet-averaged+tension+within+a+large+epithelial+cell+colony%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Endogenous sheet-averaged tension within a large epithelial cell colony.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 139 (10), 101008(2017).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Küre girinti yöntemi uygulamak çok kolay olmakla birlikte, indentor seçimi ve yumuşak silikon örnek kalınlığı dikkat ödenmelidir. Denklem Young katsayısı hesaplamak için kullanılan birtakım koşullar11altında geçerli olduğundan ve silikon örnek kalınlığı > %10 indentor yarıçap olduğunda bunlar genellikle memnun musunuz ve < ~ 13 x indentor yarıçapı. 5-10 x silikon kalınlığı indentor RADIUS neyin örnek kalınlığı çok yüksek değil iyi bir seçim olduğunu ortaya koymuştur (yani, nesnel çalışma ...

Yumuşak doku hücrelerinde bir mikro-kimin sertlik kilopascal Aralık1, doku kültürü yemekleri olan sertlik büyüklükte birkaç emir daha yüksek olduğunu aksine ortamı yer alır. Hücre dışı matriks proteini kaplı yumuşak yüzeylerde hücrelerdeyse ile erken deneyler yüzey sertliği nasıl hücreleri üzerinde hareket yanı sıra2,3altında hücre dışı matriks uygun etkiler gösterdi. Aslında, yüzey sertliği temelde yaygın biyokimyasal sinyalleri için benzer bir şekilde hücre fonksiyonu4 etkiler. Polyacrylamide (hücre dışı matriks proteinleri ile kaplı) jelleri (su-permeating) kapsamlı5mechanobiology çalışmalar için kültür yüzeylerde hücre olarak kullanılmış olan hydrogels. POLYDİMETHYLSİLOXANE (PDMS), en sık kullanılan silikon (polysiloxane), yaygın sert bir silikon ile megapascal menzilli sertlik mikron ölçekli imalat6için kullanılmıştır. Son zamanlarda, daha yumuşak silikon yüzeyler ile sertlik daha fizyolojik ilgili kilopascal aralığındaki hücre kültür yüzeyler için mechanobiology çalışmalar7,8olarak istihdam edilmiştir.
Atomik kuvvet mikroskobu, makroskopik deformasyon küreler kullanarak ve küresel microindentors9 uçlu depoladığınız ve Reolojisi, germe üzerine tüm örnekleri de dahil olmak üzere esnek yüzeylerde sertliği ölçmek için çeşitli yöntemler kullanılmıştır . Her tekniği kendine özgü avantajları ve dezavantajları olsa da, girinti bir küre ile yalnızca erişmesi gereken widefield floresan mikroskop bir özellikle basit ama oldukça doğru yöntemdir. Girinti metalik bir küre ile ön çalışma3,9,10hydrogels sertliği ölçmek için kullanılmaktadır. Yüzey sertliği hücre hareketi için önemini gösterdi erken dönem çalışmaları hidrojel yüzey sertliği3belirlemek için bu yöntemi kullanılmıştır. Daha yakın zamanlarda, confocal mikroskobu da zarif karakterizasyonu10için kullanılmıştır.
Burada, floresan boncuk kaplin yumuşak silikon yüzey hazırlama adım adım bir iletişim kuralı mevcut (ve bir hücre dışı matriks protein kollajen gibi ben) düşsel bir indenting küre ve üst yüzey kullanarak sadece üst yüzeye, faz ve Imaging, sırasıyla ve nihayet Young katsayısı, silikon substrat hesaplamak için görüntüleri analiz floresan. Bu şekilde hazırlanan yumuşak silikon substrat çekiş kuvveti mikroskopisi deneyler için kolayca kullanılabilir. Yumuşak silikon üs olarak (yerine bir petri) sert silikon kullanımı da mechanobiology çalışmaları harici bir streç kullanarak sağlar. Garanti nerede pratik hususlar komplikasyonlar kaçınmak için gerekli ayrıca belirtilir.

<table><tbody><tr><td>CY 52-276 A/B silikon elastomer kiti</td><td> Dow Corning</td><td>CY 52-276</td><td>Oda sıcaklığında saklayın</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Pierce EDC</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI22980</td><td>-20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&nbsp; Pierce Sulfo-NHS çapraz bağlayıcı</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-24510</td><td>Mağazası 4 derece; C</td></tr><tr><td>Karboksil floresan pembe parçacıklar, 0.4-0.6 &mikro; m, 2 mL</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>CFP-0558-2</td><td>4 derecede saklayın; C, donmayın</td></tr><tr><td>1.0 mm Asitle yıkanmış Zirkonyum boncuklar</td><td>OPS Diagnostics LLC</td><td>BAWZ 1000-250-33</td><td></td></tr><tr><td>Ozon tahliye cihazlı derin UV odası</td><td>Novascan Technologies, Inc.</td><td>PSD-UV4, OES-1000D</td><td></td></tr><tr><td>Geniş alan floresan mikroskobu</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMi8</td><td></td></tr><tr><td>Kollajen I, sıçan kuyruğundan</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>Stok konsantrasyonu = 4 mg / ml; 4 derecede saklayın; C</td></tr><tr><td>ImageJ-NIH</td><td>N/A</td><td>N/A Kamu</td><td>malı yazılım</td></tr></tbody></table>

yumuşak silikon yüzeylerde sertlik ölçüm widefield floresan mikroskop kullanarak mechanobiology çalışmaları için

Stiffness Measurement of Soft Silicone Substrates for Mechanobiology Studies Using a Widefield Fluorescence Microscope

İnsan vücudunda yumuşak dokular genellikle kilopascal (kPa) aralığında sertlik var. Buna göre silikon ve hidrojel esnek yüzeylerde kısmen vivo içinde koşulları taklit eden bir fiziksel microenvironment hücrelerde kültür için yararlı yüzeylerde olmak kanıtlanmış oldu. Burada, Young'ın dönmeler izotropik doğrusal elastik yüzeyler genellikle mechanobiology çalışmaları için kullanılan, karakterize için basit bir protokol mevcut. Protokol bir Petri kabına veya sert silikon yumuşak silikon yüzey hazırlama, silikon substrat floresan boncuklar ile üst yüzey kaplama, floresan Imaging üst yüzeyi (yerçekimi) tarafından girintilemek için bir milimetre çaplı küre kullanarak oluşur boncuk floresan mikroskop kullanarak ve Young katsayısı, silikon substrat hesaplamak için sonuç görüntüleri analiz girintili silikon yüzeyi. Substrat'ın üst yüzeyi dönmeler hücre dışı matriks proteini (ek floresan boncuklar) ile kaplin kolayca sonraki çalışmalar traksiyon kuvvet mikroskobu deneyler kullanarak ve hücre kaplama için kullanılmak üzere silikon yüzey sağlar. Yumuşak silikon temeli olarak bir petri yerine sert silikon kullanımı dış streç içeren mechanobiology çalışmalar kullanımını etkinleştirir. Bu iletişim kuralı belirli bir avantajı birçok laboratuvarlarında yaygın olarak kullanılabilir, widefield floresan mikroskop büyük ekipman bu yordam için gerekli olmasıdır. Biz bu iletişim kuralı, yumuşak silikon yüzeylerde farklı elastik dönmeler, Young katsayısı ölçerek göstermek.

Yukarıda ayrıntılı iletişim kuralını kullanarak, biz 35 mm Petri kabına yumuşak silikon hazırlanan, 70 ° c 30 dk için tedavi ve floresan lastikteki birleştiğinde (ve kollajen ben) Şekil 1' de şematik olarak tasvir üst yüzeyi için. Derin UV yüzeylerde13için kaplin nihai protein için daha önce kullanılmış. Biraz daha bir gün boyunca tedavi etmek için yumuşak silikon beklendiği gibi (I) burada kullanılan kür koşulları bu yumuşak sili...

Yüzeyler ile sertlik kilopascal aralıktaki hücreler yanıt fizyolojik ilgili mikro-çevre sertlik olarak çalışmaya yararlıdır. Sadece bir widefield floresan mikroskop kullanarak, yumuşak silikon jelleri, Young katsayısı ile uygun bir küre bir girinti kullanarak belirlenebilir.

Yumuşak silikon yüzeylerde sertlik ölçüm Widefield floresan mikroskop kullanarak Mechanobiology çalışmaları için

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been ...

Bu yöntem, mekanobiyoloji, hücre göçü ve birinci nesildeki temel fenomenleri incelemek için kullanılan substratları kategorize etmek için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, birçok laboratuvarda yaygın olarak bulunan bir ekipman parçası olan geniş alan mikroskobunun kullanılmasını gerektirmesidir. Bu yöntem, Young'ın silikon veya poliakrilamid jel modülünün yanı sıra yumuşak izotropik doğrusal elastik malzemeden herhangi birini ölçmek için uygulanabilir.Bu yöntemle hazırlanan ve karakterize edilen alt tabaka, sert silikon taban ile kendi kendine germe deneyleri için de kullanılabilir. Yumuşak silikon elastomer kitinden A ve B bileşenlerinin her biri yaklaşık 1,75 gram ağırlıklandırıldıktan sonra yumuşak silikon alt tabakayı imal etmek için, A bileşeninin tartılan kısmının çoğunu B bileşeni polistiren tartım tepsisine ekleyin ve iki bileşeni beş dakika boyunca karıştırmak için uygun bir aplikatör çubuğu kullanın. Karışımı 35 milimetrelik bir Petri kabına aktarın ve alt tabakanın birkaç dakika boyunca Petri kabına eşit şekilde yayılmasına izin verin.Ardından, hava kabarcıklarını gidermek için Petri kabını 15 dakika boyunca bir vakum odasına yerleştirin ve sıcak bir plakayı önceden ısıtın. Sıcak plaka 70 santigrat dereceye ulaştığında, sıcak plakanın üzerine bir cam slayt yerleştirin ve Petri kabını cam tarafa yerleştirin. Ardından, silikonun 70 santigrat derecede 30 dakika kürlenmesine izin verin.Yumuşak silikonu floresan boncuklarla birleştirmek için, kürlenmiş silikonu UV lambasından beş ila on santimetre uzakta derin bir UV odasına yerleştirin ve numuneyi beş dakika boyunca derin UV ışığına maruz bırakın. Silikon tedavi edilirken, 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde 500 mikrolitre deiyonize su içinde 19 miligram EDC'yi çözün. Ve kimyasalı çözmek için tüpü girdaplayın.Daha sonra, ikinci bir 1.5 mililitrelik tüpte 11 miligram sülfo-NHS'ye 500 mikrolitre deiyonize su ekleyin. Ve kimyasalı çözmek için girdap. Ardından, EDC ve sülfo-NHS çözeltilerini tek bir mikrosantrifüj tüpünde birleştirin.Şimdi, karışıma 30 mikrolitre uygun bir floro-4 konjuge karboksilat modifiye mikro boncuk süspansiyonu ve 0.02 miligram sıçan kuyruğu Kollajen 1 ekleyin. Kısa bir süre girdaplamadan sonra, daha küçük çaplı ikinci bir kapağın kapağına bir parça Parafilm yerleştirin ve bir mililitre EDC-NHS boncuk Kollajen 1 karışımını Parafilm'e aktarın. Yumuşak silikon içeren Petri kabını karışımın üzerine ters çevirin, çanağı her iki taraftan iki cam sürgü ile destekleyin, böylece yumuşak silikon yüzey, alttaki daha küçük çaplı kapağın yüzeyine doğrudan temas etmeden boncuk çözeltisine temas eder.Ardından, silikonu iki kez yıkamadan önce, yıkama başına iki mililitre PBS ile numuneyi oda sıcaklığında 30 dakika boyunca alüminyum folyo ile örtün ve silikonun gece boyunca 37 santigrat derecede iki mililitre taze PBS'de dik olarak kürlenmesine izin verin. Ertesi sabah, silikon tabakasının kenarlarından en az bir mililitre PBS ve diğer girintilerin konumundan en az beş girinti çapı uzakta yumuşak silikon üzerine beş milimetre zirkonyum küre girintisi örtmek için sivri uçlu cımbız kullanın. Daha sonra, yumuşak silikon tabağını geniş alanlı bir mikroskop aşamasına yerleştirin ve herhangi bir görünür kusur olmadan tüm bir girintinin faz görüntüsünü elde etmek için 10x objektifi kullanın.Görüntüyü kaydettikten sonra, floresan mikro boncukları görselleştirmek için uygun floresan kanalını seçin. Girinti merkezi çerçevenin sağ kenarına yakın olacak şekilde, küre girintisinin merkezinin altındaki floresan mikro boncuklar odak dışına çıkana kadar z koordinatlarını azaltın. Ardından, silikonun üst katmanında, görüntüleme çerçevesinin sol kenarına yakın bir yerde bulunan mikro boncuklar içeri girene ve ardından odak dışına çıkana kadar her 0,5 mikrometre z artışı için bir görüntü içeren bir z yığını elde edin.Silikon sertliğini hesaplamak için önce ImageJ'de girinti fazı görüntüsünü açın ve analiz et'e tıklayın ve ölçeği ayarlayın ve uzunluğun piksel olarak ayarlandığını onaylamak için uzunluk birimini kontrol edin. Çizgi aracını kullanarak, imleci taban tabana zıt kenardaki bir noktaya hareket ettirerek girinti kenarındaki bir noktaya tıklayın ve basılı tutun, girintinin çapını ölçmek ve imleci bırakmadan önce ImageJ ana penceresinin durum çubuğundaki piksel cinsinden uzunluğu not etmek için. Ardından, dosya menüsünü açın ve floresan mikro boncuk görüntülerinin z yığınındaki bir görüntünün seçilmesine izin vermek için bir görüntü dizisini içe aktar'ı seçin ve yığını açmak için Tamam'a tıklayın.Çizgi aracını kullanarak, tek bir görüntüde iyi tanımlanmış bir mikro boncuk boyunca bir çizgi çizin ve farklı kareler seçerken boncuk boyunca güncellenmiş çizgi tarama yoğunluğunu elde etmek için çizim profilini canlı olarak analiz et'e tıklayın. Maksimum yoğunluğun en yüksek değerini veren kare daha sonra odaktaki kare olarak seçilebilir. Silikonun üst yüzeyindeki mikro boncukların xy çerçeve konumunda çekilen floresan görüntüleri, girintinin altındaki bölgeyi çerçevenin en sağ tarafına yerleştirir.Çerçevenin en sol tarafındaki bölge daha sonra girintiden uzak bölge olarak seçilir. Tek bir mikro boncuk boyunca ölçülen bu temsili yoğunluk çizgisi taramaları setinde, odak 0,5 mikrometrelik z-artışlarıyla değişir. Odaktaki görüntüye karşılık gelen z değeri, daha sonra en yüksek maksimum yoğunluğa sahip çizgi taramasına karşılık gelen z değerine dayalı olarak objektif olarak seçilebilir.Burada, çeşitli A: B bileşen karışım oranları için silikonun Young modülü, az önce gösterildiği gibi yönteme dayalı olarak elde edildi. Bu videoyu izledikten sonra, yumuşak silikon alt tabakaların nasıl hazırlanacağını, floresan boncukların nasıl üzerlerine yerleştirileceğini ve geniş alanlı bir floresan mikroskobu kullanarak alt tabakanın sertliğini nasıl ölçeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

stiffness-measurement-soft-silicone-substrates-for-mechanobiology

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Biz, küresel ya da lokalize gerginlik uygulama yanıt tek, yaşayan yapışık hücrelere kaynaklı nükleer ve iskelet deformasyonları ölçmek için, iki bağımsız, mikroskop tabanlı araçlar sunuyoruz. Bu teknikler, nükleer sertliği belirlemek için (yani, deformabilitesi) ve, çekirdek ve hücre iskeletinin arasındaki hücre içi kuvvet iletim prob kullanılır.

Fazlararası Hücre Çekirdek Mekanik Özellikleri Probe Biyofiziksel Tahliller: Yüzey Gerilme Uygulama ve Microneedle Manipülasyon

İşte biz cep sertliği ölçmek için hızlı ve basit bir yöntem sunduk. Bu yaklaşımın genel prensip hücre yüzeyine bir mikropipet yoluyla uygulanan iyi tanımlanmış bir negatif basınca tepki olarak zar deformasyon ölçmektir. Bu yöntem substrat bağlı hücrelerin biyomekanik özelliklerini incelemek için güçlü bir araç sağlar.

Substrat bağlı Hücrelerinin Mikropipet Aspirasyon Hücre Rijitlik tahmin etmek

Bu kağıt bir atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanarak microindentation ile canlı hücrelerin mekanik özelliklerini karakterize etmek için bir protokol göstermektedir.

Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanarak Yaşam Hücrelerinin Mekanik Özellikleri Ölçme

Burada, poliakrilamid jellerin çok kuyulu plaka formatında hızlı, verimli ve ucuz bir şekilde hazırlanmasını sağlayan bir yöntem açıklanmaktadır. Yöntem herhangi bir özel ekipman gerektirmez ve herhangi bir araştırma laboratuvarı tarafından kolayca benimsenebilir. Sertliğe bağlı hücre tepkilerini anlamaya odaklanan araştırmalarda özellikle yararlı olacaktır.

Basit Poliakrilamid-tabanlı Sertlik bağımlı Hücre Yanıtların Çalışmaları multiwell Sertlik Deneyi

Canlı hücrelerdeki mekanik zorlanmaya gerçek zamanlı tepkilerin ölçülmesine izin vermek için özel bir motor tahrikli mekanik aktüatör kullanılarak yeni bir görüntüleme protokolü geliştirilmiştir. Mekanobiyoloji ile ilgili olarak, sistem konfokal veya atomik kuvvet mikroskobu ile neredeyse gerçek zamanlı görüntülemeye izin verirken %20'ye kadar suşlar uygulayabilir.

Mekanik Stretch sırasında Canlı Hücre Görüntüleme

Aortların fareden izolasyonu ve atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak elastik modüllerinin ölçümü için ayrıntılı protokoller sunuyoruz.

sertliği ölçme<em&gt; Ex Vivo</emAtomik Kuvvet Mikroskobu Kullanma&gt; Fare aorta

Daha önce tasarlanmış bir cihazı kullanarak bağlı hücrelere mekanik gerilme uygulamak için, bu yazıda bir yeniden tasarlanan substratum geometrisi ve 100 x yağ daldırma amacı ile gergin hücrelerin yüksek çözünürlüklü tek hücreli görüntüleme için özelleştirilmiş bir cihaz açıklanmaktadır.

Tek eksenli çekme gerinim altında canlı hücrelerde nükleer dinamiklerin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi

Yakın zamanda retina kapiller sertleşmesini diyabetle ilişkili retina disfonksiyonu için yeni bir paradigma olarak tanımladık. Bu protokol, fare retina kılcal damarlarının ve subendotel matrisinin retinal endotel kültürlerinden izolasyon adımlarını detaylandırır ve ardından atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak sertlik ölçüm tekniğinin bir açıklaması yapılır.

Atomik Kuvvet Mikroskobu Kullanılarak Sertlik Ölçümü için Fare Retina Kılcal Damarlarının ve Subendotelyal Matriksin İzolasyonu

Burada, pnömatik olarak çalıştırılan ve yüksek çözünürlüklü mikroskopi ile uyumlu çok yönlü bir eşbiaksiyel germe cihazı sunuyoruz.

Yüksek Büyütmeli Canlı Hücre Konfokal Floresan Mikroskobu için Equibiaxial Germe Cihazı

Uzun zincirli altın Alkan tiyoller oluşan Kendinden monte mono tabakaları (SAMs), protein desen ve hücre hapsi oluşumu için iyi tanımlanmış substratları sağlar. Microcontact baskı ile dolgu takip polidimetilsiloksan (PDMS) damga kullanarak hexadecanethiol glikol-sonlandırılır Alkan tiyol monomer damgalı hexadecanethiol bölgede sadece protein ve hücreler adsorbe bir desen üretir.

Protein ve hücre Etrafının İki Boyutlu Desenli Yüzeyler Oluşturma

Öğrenin, yumuşak silikon jellerde Young modülünü geniş alan floresan mikroskop kullanarak ölçme yöntemini. Bu teknik, mekanobiyolojide hücrelerin substrat sertliğine yanıtlarını incelemek için araştırmacılara kolay erişilebilir bir araç sunar.

Yumuşak silikon yüzeylerde sertlik ölçüm Widefield floresan mikroskop kullanarak Mechanobiology çalışmaları için

Daha fazla video keşfet