Yumuşak silikon yüzeylerde sertlik ölçüm Widefield floresan mikroskop kullanarak Mechanobiology çalışmaları için

Bu yöntem, mekanobiyoloji, hücre göçü ve birinci nesildeki temel fenomenleri incelemek için kullanılan substratları kategorize etmek için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, birçok laboratuvarda yaygın olarak bulunan bir ekipman parçası olan geniş alan mikroskobunun kullanılmasını gerektirmesidir. Bu yöntem, Young'ın silikon veya poliakrilamid jel modülünün yanı sıra yumuşak izotropik doğrusal elastik malzemeden herhangi birini ölçmek için uygulanabilir.

Bu yöntemle hazırlanan ve karakterize edilen alt tabaka, sert silikon taban ile kendi kendine germe deneyleri için de kullanılabilir. Yumuşak silikon elastomer kitinden A ve B bileşenlerinin her biri yaklaşık 1,75 gram ağırlıklandırıldıktan sonra yumuşak silikon alt tabakayı imal etmek için, A bileşeninin tartılan kısmının çoğunu B bileşeni polistiren tartım tepsisine ekleyin ve iki bileşeni beş dakika boyunca karıştırmak için uygun bir aplikatör çubuğu kullanın. Karışımı 35 milimetrelik bir Petri kabına aktarın ve alt tabakanın birkaç dakika boyunca Petri kabına eşit şekilde yayılmasına izin verin.

Ardından, hava kabarcıklarını gidermek için Petri kabını 15 dakika boyunca bir vakum odasına yerleştirin ve sıcak bir plakayı önceden ısıtın. Sıcak plaka 70 santigrat dereceye ulaştığında, sıcak plakanın üzerine bir cam slayt yerleştirin ve Petri kabını cam tarafa yerleştirin. Ardından, silikonun 70 santigrat derecede 30 dakika kürlenmesine izin verin.

Yumuşak silikonu floresan boncuklarla birleştirmek için, kürlenmiş silikonu UV lambasından beş ila on santimetre uzakta derin bir UV odasına yerleştirin ve numuneyi beş dakika boyunca derin UV ışığına maruz bırakın. Silikon tedavi edilirken, 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde 500 mikrolitre deiyonize su içinde 19 miligram EDC'yi çözün. Ve kimyasalı çözmek için tüpü girdaplayın.

Daha sonra, ikinci bir 1.5 mililitrelik tüpte 11 miligram sülfo-NHS'ye 500 mikrolitre deiyonize su ekleyin. Ve kimyasalı çözmek için girdap. Ardından, EDC ve sülfo-NHS çözeltilerini tek bir mikrosantrifüj tüpünde birleştirin.

Şimdi, karışıma 30 mikrolitre uygun bir floro-4 konjuge karboksilat modifiye mikro boncuk süspansiyonu ve 0.02 miligram sıçan kuyruğu Kollajen 1 ekleyin. Kısa bir süre girdaplamadan sonra, daha küçük çaplı ikinci bir kapağın kapağına bir parça Parafilm yerleştirin ve bir mililitre EDC-NHS boncuk Kollajen 1 karışımını Parafilm'e aktarın. Yumuşak silikon içeren Petri kabını karışımın üzerine ters çevirin, çanağı her iki taraftan iki cam sürgü ile destekleyin, böylece yumuşak silikon yüzey, alttaki daha küçük çaplı kapağın yüzeyine doğrudan temas etmeden boncuk çözeltisine temas eder.

Ardından, silikonu iki kez yıkamadan önce, yıkama başına iki mililitre PBS ile numuneyi oda sıcaklığında 30 dakika boyunca alüminyum folyo ile örtün ve silikonun gece boyunca 37 santigrat derecede iki mililitre taze PBS'de dik olarak kürlenmesine izin verin. Ertesi sabah, silikon tabakasının kenarlarından en az bir mililitre PBS ve diğer girintilerin konumundan en az beş girinti çapı uzakta yumuşak silikon üzerine beş milimetre zirkonyum küre girintisi örtmek için sivri uçlu cımbız kullanın. Daha sonra, yumuşak silikon tabağını geniş alanlı bir mikroskop aşamasına yerleştirin ve herhangi bir görünür kusur olmadan tüm bir girintinin faz görüntüsünü elde etmek için 10x objektifi kullanın.

Görüntüyü kaydettikten sonra, floresan mikro boncukları görselleştirmek için uygun floresan kanalını seçin. Girinti merkezi çerçevenin sağ kenarına yakın olacak şekilde, küre girintisinin merkezinin altındaki floresan mikro boncuklar odak dışına çıkana kadar z koordinatlarını azaltın. Ardından, silikonun üst katmanında, görüntüleme çerçevesinin sol kenarına yakın bir yerde bulunan mikro boncuklar içeri girene ve ardından odak dışına çıkana kadar her 0,5 mikrometre z artışı için bir görüntü içeren bir z yığını elde edin.

Silikon sertliğini hesaplamak için önce ImageJ'de girinti fazı görüntüsünü açın ve analiz et'e tıklayın ve ölçeği ayarlayın ve uzunluğun piksel olarak ayarlandığını onaylamak için uzunluk birimini kontrol edin. Çizgi aracını kullanarak, imleci taban tabana zıt kenardaki bir noktaya hareket ettirerek girinti kenarındaki bir noktaya tıklayın ve basılı tutun, girintinin çapını ölçmek ve imleci bırakmadan önce ImageJ ana penceresinin durum çubuğundaki piksel cinsinden uzunluğu not etmek için. Ardından, dosya menüsünü açın ve floresan mikro boncuk görüntülerinin z yığınındaki bir görüntünün seçilmesine izin vermek için bir görüntü dizisini içe aktar'ı seçin ve yığını açmak için Tamam'a tıklayın.

Çizgi aracını kullanarak, tek bir görüntüde iyi tanımlanmış bir mikro boncuk boyunca bir çizgi çizin ve farklı kareler seçerken boncuk boyunca güncellenmiş çizgi tarama yoğunluğunu elde etmek için çizim profilini canlı olarak analiz et'e tıklayın. Maksimum yoğunluğun en yüksek değerini veren kare daha sonra odaktaki kare olarak seçilebilir. Silikonun üst yüzeyindeki mikro boncukların xy çerçeve konumunda çekilen floresan görüntüleri, girintinin altındaki bölgeyi çerçevenin en sağ tarafına yerleştirir.

Çerçevenin en sol tarafındaki bölge daha sonra girintiden uzak bölge olarak seçilir. Tek bir mikro boncuk boyunca ölçülen bu temsili yoğunluk çizgisi taramaları setinde, odak 0,5 mikrometrelik z-artışlarıyla değişir. Odaktaki görüntüye karşılık gelen z değeri, daha sonra en yüksek maksimum yoğunluğa sahip çizgi taramasına karşılık gelen z değerine dayalı olarak objektif olarak seçilebilir.

Burada, çeşitli A: B bileşen karışım oranları için silikonun Young modülü, az önce gösterildiği gibi yönteme dayalı olarak elde edildi. Bu videoyu izledikten sonra, yumuşak silikon alt tabakaların nasıl hazırlanacağını, floresan boncukların nasıl üzerlerine yerleştirileceğini ve geniş alanlı bir floresan mikroskobu kullanarak alt tabakanın sertliğini nasıl ölçeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.