Name: Bir Maya 2-melez ekran Protein etkileşimleri karşılaştırmak için bir toplu iş (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Öğrenin, maya 2-melez sisteminde toplu işlemeyle çoklu yem proteinlerinin etkileşim profillerini derin dizileme kullanarak karşılaştırın. Bu yöntem, protein-protein etkileşimlerini ve farklı etkileşim ağlarını kapsamlı şekilde analiz etmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz personel içinde Enstitüsü, insan genetiği NGS Kütüphane hazırlık ve sıralama için teşekkür ederim. Einat Snir genomik Kütüphanesi parçaları burada yapılan Y2H plazmid Kütüphane için hazırlarken onun uzmanlık alanı için teşekkür ediyoruz. Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir: NIH R21 EB021870-01A1 ve NSF araştırma projesi hibe: 1517110.

<ol><li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).</li>
<li>Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+two-hybrid%2C+a+powerful+tool+for+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology.</a> International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).</li>
<li>Vidal, M., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+two-hybrid+assay%3A+still+finding+connections+after+25+years%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The yeast two-hybrid assay: still finding connections after 25 years.</a> Nature Methods. 11 (12), 1203-1206 (2014).</li>
<li>Pashkova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEEPN+as+an+Approach+for+Batch+Processing+of+Yeast+2-Hybrid+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">DEEPN as an Approach for Batch Processing of Yeast 2-Hybrid Interactions.</a> Cell Reports. 17 (1), 303-315 (2016).</li>
<li>Rajagopala, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+Protein-Protein+Interactome+Networks+Using+Yeast+Two-Hybrid+Screens%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Mapping the Protein-Protein Interactome Networks Using Yeast Two-Hybrid Screens.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 883, 187-214 (2015).</li>
<li>Weimann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Y2H-seq+approach+defines+the+human+protein+methyltransferase+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A Y2H-seq approach defines the human protein methyltransferase interactome.</a> Nature Methods. 10 (4), 339-342 (2013).</li>
<li>Yachie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pooled-matrix+protein+interaction+screens+using+Barcode+Fusion+Genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Pooled-matrix protein interaction screens using Barcode Fusion Genetics.</a> Molecular Systems Biology. 12 (4), 863(2016).</li>
<li>Trigg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CrY2H-seq%3A+a+massively+multiplexed+assay+for+deep-coverage+interactome+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping.</a> Nature Methods. , (2017).</li>
<li>Estojak, J., Brent, R., Golemis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+two-hybrid+affinity+data+with+in+vitro+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Correlation of two-hybrid affinity data with in vitro measurements.</a> Molecular and Cellular Biology. 15 (10), 5820-5829 (1995).</li>
<li>Rajagopala, S. V., Hughes, K. T., Uetz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+yeast+two-hybrid+systems+using+the+interactions+of+bacterial+motility+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Benchmarking yeast two-hybrid systems using the interactions of bacterial motility proteins.</a> Proteomics. 9 (23), 5296-5302 (2009).</li>
<li>James, P., Halladay, J., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+libraries+and+a+host+strain+designed+for+highly+efficient+two-hybrid+selection+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genomic libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast.</a> Genetics. 144 (4), 1425-1436 (1996).</li>
<li>Barbas, C. F. 3rd, Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+DNA+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quantitation of DNA and RNA.</a> CSH Protoc. 2007, pdb ip47(2007).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22485921">SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (4), (2006).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Alegria-Schaffer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting+using+chemiluminescent+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Western blotting using chemiluminescent substrates.</a> Methods in Enzymology. 541, 251-259 (2014).</li>
<li>Plank, J. Practical application of Phenol/Chloroform extraction. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://bitesizebio.com/3651/practical-application-of-phenolchloroform-extraction/">http://bitesizebio.com/3651/practical-application-of-phenolchloroform-extraction/</a> (2018).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), (2012).</li>
<li>Harper, J. W., Adami, G. R., Wei, N., Keyomarsi, K., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+p21+Cdk-interacting+protein+Cip1+is+a+potent+inhibitor+of+G1+cyclin-dependent+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The p21 Cdk-interacting protein Cip1 is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases.</a> Cell. 75 (4), 805-816 (1993).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa yoktur

Burada bir rehber en iyi duruma getirilmiş yöntemleri kullanarak toplu iş iş işlemde Y2H deneyleri gerçekleştirmeye ilişkin sağlamak. Halkın seçimi altında gelebileceğini söyledi Maya başlangıç Kütüphane temsilcisidir ve yeterli başlangıç Maya nüfusun bu değişkenliği sınırlamak için seçim geçmesi için kullanılan emin olmak için yordamda birkaç kritik adım vardır . Önemlisi, bu kriterler geleneksel bir Y2H yöntemi, böylece bu yaklaşım çoğu laboratuvarlar için standart moleküler biyoloji donatılmış erişilebilir yapmak için...

Hücre biyolojik süreçlerin tam bir anlayış moleküler mekanizmaları altında yatan protein etkileşim ağları bulmaya dayanır. Protein etkileşimleri tanımlamak için bir yaklaşım iki protein etki alanı ilgi bir başkasına1bind sonra işleyen chimeric transkripsiyon faktörü birleştirerek çalışır Maya 2-hibrid (Y2H) tahlil olduğunu. Tipik bir Y2H ekran etkileşen proteinler transkripsiyon harekete geçirmek için erimiş kodlama plazmidler her iki bir kütüphane evler Maya nın nüfusu oluşturularak gerçekleştirilir (Örn., 'füzyon protein av') ve protein oluşan bir verilen 'yem' plazmid bir DNA bağlayıcı etki alanına (Örneğin, Gal4 ters yönde aktive dizisine bağlar Gal4 DNA'ya bağlanıcı etki alanı) ilgi erimiş. Y2H yaklaşım ana avantajlarından biri nispeten kolay ve ucuz tipik bir laboratuarda yapmak rutin moleküler biyolojik iş2için donatılmış olmasıdır. Ancak, geleneksel olarak gerçekleştirildiğinde, bir kullanıcı seçimi olumlu Y2H etkileşimi için üzerine ortaya çıkan bireysel kolonileri örnekler. Bu ciddi bir şekilde anket Kütüphane 'av' klonlar sayısını sınırlar. Belirli bir etkileşen av bolluğu diğerleri düşük bereket av plazmid müdahalesini algılama şansı azalan göre çok yüksek olduğunda bu sorunu bileşik olduğunu.
Proteom kapsamlı kapsama Y2H ilkesini kullanarak için bir çözüm neyin bilinen tek tek av plazmid içeren bir dizi dijital olarak sorguya bir matris biçimli yaklaşım kullanımıdır. Ancak, böyle bir yaklaşım proteinler veya etki alanları3az sayıda interactome tanımlamada ilgilenen bireysel araştırmacılar için kolayca erişilebilir veya maliyet-etkin değil bir altyapı gerektirir. Ayrıca, birden çok parçaya etkileşen proteinlerin kodlamak çok karmaşık av kitaplıkları için pratik boyutları böyle matris dizileri boyutunu artıracağı. Deneyleri karmaşık kütüphaneler ile toplu olarak gerçekleştirmek ve etkileşen klon massive paralel yüksek üretilen iş sıralama4kullanan olup olmadığını değerlendirmek için bir alternatiftir. Bu tipik bir kullanarak birden çok koloniler halinde ortaya av plazmidlerin varlığı tahlil uygulanabilir Y2H biçimlendirilmiş hangi Maya hücreleri füzyon protein etkileşen bir çifti konut üzerinde plaka5,6büyümeye izin yaklaşım. Bu genel bir fikir sorgu her iki birden fazla yem artırmak ve bileşenleri aynı saat7,8av vurgulu.
Yine de, birçok araştırmalar daha kolay bir henüz daha fazla çaba sadece birkaç protein 'yemler üzerinde' odaklı gerektirir ve daha ayrıntılı ve yarı kantitatif sorgusu, bir tek karmaşık av kütüphane tarafından yararlanabilir. Biz geliştirdik ve geniş ölçekli protein etkileşim çalışmaları toplu biçimi4' te bir Y2H ilkesini kullanarak gerçekleştirmek için bir yaklaşım doğrulanmış. Bu belirli av plazmid genişleme hızı Y2H etkileşim9göreli gücü için bir proxy sunucu olarak kullanır. Bir nüfus içinde tüm plazmid derin sıralama için normal büyüme tabi veya seçici büyüme koşulları üreten güçlü ve zayıf Y2H etkileşimleri verim klonların tam bir harita. İnteractors repertuar elde edilen ve doğrudan birden fazla yem plazmid karşılaştırılır. DEEPN (Protein ağları değerlendirme için dinamik zenginleştirme) olarak adlandırdığı elde edilen iş akışı böylece fark interactomes proteinler, vs. başka bir protein arasında karşılaştırma izin tanımlamak için aynı av kitaplıklarındaki tanımlamak için kullanılabilir.
Burada, biz DEEPN göstermek ve hangi Şekil 1' de özetlenen onun kullanımını kolaylaştırmak laboratuvar yöntemleri gelişmeler tanıtmak. Önemli iyileştirmeler şunlardır:
Av Maya nüfus nesil. Bir DEEPN anahtar gereksinimleri Maya plazmid av kütüphanelerin aynı dağıtım var farklı yem Plasmid'ler ile nüfus oluşturuyor. Av plazmid Kütüphane eşdeğer taban çizgisi nüfus farklı yemler interactomes arasında doğru karşılaştırmaları yapmak için gereklidir. Bu en iyi zaman bir kütüphane plazmid zaten haploit Maya nüfus içinde yer alan ve verilen yem plazmid nüfus hareketli bir diploid üretmek için çiftleşme tarafından elde elde edilir. Burada, nasıl böyle nüfus haploit Maya yer alan ticari kitaplıklarını kullanma yapmak bir net rehber sağlamak. Her ne kadar diploitler yüksek bir sayı üretmek yöntemleri bulduk, bu ticari kitaplığı içeren maya suşları genel çiftleşme verimliliğini düşüktü. Bu nedenle, biz tepki çiftleşme başına çok daha fazla diploitler verimleri av kitaplıkları ev yeni bir yük inşa.
Yeni yem plazmidler ayarla. Oluşan 'yem' füzyon protein faiz ve DNA'ya bağlanıcı etki alanı protein Hızlı birçok geçerli plazmid 2µ onları onların kopya sayısını yükseltmek için izin, tabanlıdır. Bu kopya sayısı oldukça değişken nüfus ve değişkenlik Y2H transkripsiyon yanıt yol. Bu sırayla yetenek seçimi altında hücre büyüme yanıtı dayalı bir verilen protein etkileşimin gücünü ölçmek için çarpık. Bu kısmen bazıları daha önce piyasada bulunan pDEST3210gibi tarif var bir düşük kopya plazmid kullanarak adres olabilir. Biz Gal4 DNA'ya bağlanıcı etki alanı füzyon proteinler de yem parçaları her iki akıntıya karşı klonlama sağlar Kanr direnç geni taşıyan bir TRP1 düşük kopya şeması tabanlı plazmid içinde üreten yeni bir yem plazmid (pTEF-GBD) inşa ve Gal4 DNA'ya bağlanıcı etki alanının aşağı akım.
Yeni yüksek yoğunluklu Y2H parçasını kitaplık. Biz ev Y2H av kitaplıklara yeni bir plazmid inşa ve rastgele yamultulmuş genomik DNA parçaları Saccharomyces cerevisiaeyapılan son derece karmaşık bir Y2H kütüphane oluşturmak için kullanılır. Dizi analizi bu kitaplığın 1 milyondan fazla farklı elemanları, yukarıda açıklanan Maya genomik Y2H plazmid kitaplıkları11çok daha karmaşık olduğunu göstermiştir. Bu yeni kütüphane ile DEEPN iş akışı karmaşık kütüphaneleri güvenilir ve tekrarlanabilir bir şekilde pek çok farklı Plasmid'ler ile karşılamak için güçlü olduğunu göstermek başardık.

<table><tbody><tr><td>Illumina HiSeq 4000</td><td>Illumina</td><td></td><td>derin dizileme platformu</td></tr><tr><td>Monoklonal anti-HA antikorları</td><td>Biolegend</td><td>901514</td><td>pGal4AD'de HA ekspresyonunu tespit etmek için Primer Antikor</td></tr>, <tr><td>Poliklonal anti-myc antikorları</td><td>oluşturur QED Biosciences Inc</td><td>18826</td><td>pTEF-GBD yapılarında MYC ekspresyonunu tespit etmek için Primer Antikor,</td></tr><tr><td>NarI</td><td>New England BioLabs</td> <td>yaparR0191S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3236S</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Polietilen Glikol 3350, toz</td><td>JT Baker</td><td>U2211-08</td><td></td></tr><tr>Fisher Scientific <td>50-948-286 tarafından satılan</td> <td>Somon Sperm DNA</td><td>Trevigen, Inc</td><td>maya transformasyonu için taşıyıcı DNA, bölüm 3.2.1.</td></tr>DNA agaroz jelleri yapmak için kullanılan <tr><td>Kanamisin Monosülfat</td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası</td><td>K22000</td><td></td></tr><tr><td>LE Agarose</td><td>GeneMate</td><td>E-3120-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası</td><td>S23025</td><td></td></tr><tr><td>Tripton</td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası</td><td>T60060</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası</td><td>S23080</td><td></td></tr><tr><td>Lityum Asetat Dihidrat</td><td>MP Biyomedikal</td><td>155256</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum Klorür</td><td>ThermoFisher</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Sodyum Tuzu</td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası</td><td>E57020</td><td></td></tr><tr><td>Maya Özü Tozu</td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası</td><td>Y20020</td><td></td></tr><tr><td>Maya Azot Baz (amonyum sülfat) amino asitler</td> <td>olmadanAraştırma Ürünleri Uluslararası</td><td>Y20040</td><td></td></tr><tr><td>CSM-Trp-Leu+40ADE</td><td>Formedium</td><td>DCS0789</td><td></td></tr><tr><td>CSM-Trp-Leu-His+40ADE</td><td>Formedium</td><td>DCS1169</td><td></td></tr><tr><td>CSM-Leu-Met</td><td>Formedium</td><td>DCS0549</td><td></td></tr><tr><td>CSM-Trp-Met</td><td>Bio 101, Inc</td><td>4520-922</td><td></td></tr><tr><td>L-Metionin</td><td>Formedium</td><td>DOC0168</td><td></td></tr><tr><td>Adenin</td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası</td><td>A11500</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glikoz</td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası</td><td>G32045</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td>bölüm 1'de ortam plakaları yapmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Pepton</td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası</td><td>P20240</td><td></td></tr><tr><td>3-amino-1,2,4 Triazol</td><td>Sigma</td><td>A8056</td><td></td></tr><tr><td>2- Merkaptoehanol (BME)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>USBiolojik</td><td>Z1004</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum fosfat dibazik</td><td>Sigma</td><td>P8281</td><td></td></tr><tr><td>Fenol: Kloroform: IAA</td><td>Ambion</td><td>AM9732</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum Asetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238074</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Laboratuvarları, INC</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>ThermoFisher</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Üre Araştırma</td><td>Ürünleri Uluslararası</td><td>U20200</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası</td><td>L22010</td><td></td></tr><tr><td>gliserol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Gibco</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>bromofenol mavisi</td><td>Amresco</td><td>449</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Montaj Klonlama Kiti</td><td>New England Biolabs</td><td>E5510S</td><td>Bölüm 2'de plazmitlerin klonlanması için hızlı montaj yöntemi</td></tr><tr><td>NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0541S</td><td>Bölüm 2.3'te Gibson Montajı için ürünlerin amplifikasyonu ve ayrıca bölüm 6.2.1'de DEEPN derin dizilimi için numune hazırlama için kullanılır</td></tr><tr><td>Etidyum Bromür</td><td>Amresco</td><td>0492-5G</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR saflaştırma kiti</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Bölüm 6.2.3'te pcr ürünlerinin saflaştırılması için kullanılır</td></tr><tr><td>Qiaquick DNA Jel Ekstraksiyon Kiti</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Bölüm 2.1'de sindirilmiş pTEF-GBD'nin saflaştırılması için kullanılır</td></tr><tr><td>KAPA Hiper Hazırlık kiti</td><td>Derin dizileme için</td><td>KAPA</td><td>Biosystems KK8500</td> hazırlık kiti</tr><tr><td>Kodon optimizasyonu</td><td>http://www.jcat.de</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gBlocks</td><td></td> https://www.idtdna.com/CodonOpt <td></td>kodon optimizasyonu Entegre DNA Teknolojileri <td></td> Bölüm 2.2'de klonlama için kullanılan DNA parçaları</tr><tr><td>Dizeler</td> Bölüm <td>2.2'de klonlama için kullanılan</td><td>Thermofisher</td><td></td> DNA parçaları</tr><tr><td>GenCatch Plazmid DNA mini hazırlık Kiti</td><td>EPOCH Yaşam Bilimleri</td><td></td><td>Bölüm 2.3'te DNA miktarlarını hazırlamak için kullanılır</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Covaris E220</td><td>Covaris</td><td></td><td>yüksek performanslı ultrasonikatör bölüm 7</td></tr><tr><td>oligo nucelotide 5'- CGGTCTT CAATTTCTCAAGTTTCAG -3'</td><td>Plazmid yapımı sırasında pcr amplifikasyonu ve dizileme için kullanılan</td> <td>entegre DNA Teknolojileri veya Thermofisher</td><td></td> 5</tr><tr><td>'-GAGTAACG ACATTCCCAGTTGTTC-3'</td><td>Plazmid yapımı sırasında pcr amplifikasyonu ve dizileme için kullanılan</td> <td>entegre DNA Teknolojileri veya Thermofisher</td><td></td> 5</tr><tr><td>'-CACCGTAT TTCTGCCACCTCTTCC-3'</td>Pcr amplifikasyonu ve dizileme için kullanılan <td>Entegre DNA Teknolojileri veya Thermofisher</td><td></td><td>Plazmid yapımı sırasında 3' insert pTEF-GBD</td></tr><tr><td>oligo nucelotide 5'-GCAACCGC ACTATTTGGAGCGCTG-3'</td><td>Plazmit yapımı sırasında pcr amplifikasyonu ve dizileme için kullanılan</td> <td>entegre DNA Teknolojileri veya Thermofisher</td><td></td> pTEF-GBD</tr><tr><td>ekleyin oligonükleotid 5'-GTTCCGATG CCTCTGCGAGTG-3'</td>pGAL4AD oligonükleotid 5'-GCACATGCT AGCGTCAAATACC-3'ün <td>insert amplifikasyonu için kullanılan</td> <td>entegre DNA Teknolojileri veya Thermofisher</td><td></td> 5' Pimer</tr><tr><td></td>pGAL4AD oligonükleotid 5'-ACCCAAGCA<br/<td>> GTGGTATCAACG-3'ün insert amplifikasyonu için kullanılan</td> <td>entegre DNA Teknolojileri veya Thermofisher</td><td></td> 3' Pimer</tr><tr><td></td>pGADT7 oligonükleotid 5'- TATTTAGA AGTGTCAACAACGTA -3'ün <td>insert amplifikasyonu için kullanılan</td> <td>entegre DNA Teknolojileri veya Thermofisher</td><td></td> 5' Pimer</tr><tr><td></td>James P, Halladay J, Craig EA: Genomik Kütüphaneler ve mayada yüksek verimli iki hibrit seçim için tasarlanmış bir konakçı suş http://depts.washington.edu/yeastrc/ pGADT7 PJ69-4A MatA maya <td>suşunun insert amplifikasyonu için kullanılan</td> <td>Entegre DNA Teknolojileri veya Thermofisher</td><td></td> 3' Pimer</tr><tr><td></td><td>. GENETİK 1996 144:1425-1436</td><td></td><td>MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7</td></tr><tr><td>pTEF-GBD</td><td>Dr. Robert Piper Lab</td><td></td><td>Gal4-DNA bağlayıcı doimain ekspresyon plazmid</td></tr><tr><td>pGal4AD (pPL6343)</td><td>Dr. Robert Piper Lab</td><td></td><td>Gal4-aktivasyon alanı ekspresyonu plazmid</td></tr><tr><td>100 mm petri kapları</td><td>Kord-Vallmark VWR</td><td>2900</td><td></td> tarafından satılmaktadır</tr><tr><td>125 mL PYREX Erlenmeyer şişesi</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63270</td><td></td></tr><tr><td>250 mL PYREX Erlenmeyer şişesi</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63271</td><td></td></tr><tr><td>1.000 mL PYREX Erlenmeyer şişesi</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63274</td><td></td></tr><tr><td>2.000 mL PYREX Erlenmeyer şişesi</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63275</td><td></td></tr><tr><td>20 X 150 mm Tek Kullanımlık Kültür</td><td>Tüpü Thermofisher</td><td>14-961-33</td><td></td></tr><tr><td>pipet yardımcısı</td><td>Drummond</td><td>4-000-100</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Serolojik Pipet</td><td>Denville</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Serolojik Pipet</td><td>Denville</td><td>P7128</td><td></td></tr><tr><td>25 mL Serolojik Pipet</td><td>Denville</td><td>P7129</td><td></td></tr><tr><td>1.000 mL PYREX Griffin</td><td>Beher Fisher Scientific</td><td>02-540P</td><td></td></tr><tr><td>1.000 mL PYREX Yeniden Kullanılabilir Medya Depolama</td><td>Şişesi Fisher Scientific</td><td>06-414-1D</td><td></td></tr><tr><td>1.000 mL dereceli silindir</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-572-6G</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax 190</td><td>Hücrelerin Optik Yoğunluğunu ölçmek için kullanılan</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td>DNA Elektronik UV miktarını ölçmek için kullanılan spektrofotometre</td></tr><tr><td> transilluminator</td><td>Ultra Lum</td><td>MEB 20</td>, <td>bir Etidyum Bromür agaroz jelinde DNA'yı görselleştirmek için kullanılır</td></tr><tr><td>P1000 Gilson PIPETMAN</td><td>Fisher Scientific</td><td>F123602G</td><td></td></tr><tr><td>P200 Gilson PIPETMAN</td><td>Fisher Scientific</td><td>F123601G</td><td></td></tr><tr><td>P20 Gilson PIPETMAN</td><td>Fisher Scientific</td><td>F123600G</td><td></td></tr><tr><td>P10 Gilson PIPETMAN</td><td>Fisher Scientific</td><td>F144802G</td><td></td></tr><tr><td>1250 ve mikro; L Düşük Tutma Pipet Uçları</td><td>GeneMate</td><td>P-1236-1250</td><td></td></tr><tr><td>200 & LLow Tutma Pipet Uçları</td><td>VWR</td><td>10017-044</td><td></td></tr><tr><td>10 & L XL Düşük Tutmalı Pipet Uçları</td><td>VWR</td><td>10017-042</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konik boru</td><td>VWR</td><td>490001-627</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konik boru</td><td>VWR</td><td>490001-621</td><td></td></tr><tr><td>hücre sıyırıcı</td><td>Denville Scientific</td><td>TC9310</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Mikrosantrifüj tüpleri</td><td>ABD Bilimsel</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fluka Analitik</td><td>318949-1L</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>J.T. Baker</td><td>5674-02</td><td></td></tr><tr><td>Ahşap aplikatörler</td><td>Solon Care</td><td>55900</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf mikrosantrifüj 5424</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-400-005</td><td>mikrosantrifüj</td></tr><tr><td>Sorvall ST16R</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004381</td><td>tezgah üstü santrifüj</td></tr><tr><td>Amersham ECL Tavşan IgG, HRP'ye bağlı bütün Ab (eşekten itibaren)</td> <td>GE Sağlık Hizmetleri</td><td>NA934-1ML</td><td>İkincil Antikor</td></tr><tr><td>Amersham ECL Fare IgG, HRP'ye bağlı bütün Ab (koyundan)</td> <td>GE Healthcare</td><td>NA931-1ML</td><td>İkincil Antikor</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Kemilüminesan Yüzey</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34080</td><td>ECL algılama çözümü</td></tr><tr><td>Isotemp İnkübatör</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td></td><td>İnkübatör</td></tr><tr><td>Mutitron 2</td><td>INFORS HT</td><td></td><td>Çalkalama inkübatörü</td></tr><tr><td>Isotemp Dijital Kontrollü Su Banyosu Model 205</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>su banyosu</td></tr><tr><td>Y2H fare cDNA kitaplığı Y187 (tava dokusu)</td><td>Clontech</td><td>630482</td><td>ticari olarak temin edilebilen cDNA Kitaplığı</td></tr><tr><td>Y2H fare cDNA kitaplığı Y187'de (fare beyni)</td><td>Clontech</td><td>630488</td><td>ticari olarak temin edilebilen cDNA Kitaplığı</td></tr><tr><td>pGADT7 AD Vektörü</td><td>Clontech</td><td>630442</td><td>birçok cDNA kitaplığını barındıran ticari olarak temin edilebilen AD Vektörü</td></tr><tr><td>pGBKT7 DNA-BD Vektörü</td><td>Clontech</td><td>630443</td><td>ticari olarak temin edilebilen DNA-BD Vektör</td></tr><tr><td>Biolaz DNA Polimeraz</td><td>Bioline</td><td>BIO-21042</td><td>Bölüm 2.4 için kullanılan DNA polimeraz</td></tr><tr><td>GeneMate GCL-60 Termal Döngüleyici</td><td>BioExpress</td><td>P-6050-60</td><td>pcr makinesi</td></tr><tr><td>TempAssure 0.5 mL PCR tüpleri</td><td>ABD Bilimsel</td><td>1405-8100</td><td></td></tr></tbody></table>

bir maya 2-melez ekran protein etkileşimleri karşılaştırmak için bir toplu iş

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Maya 2-hibrid tahlil kullanarak protein-protein etkileşimleri için tarama uzun etkili bir araç olmuştur ama kullanımı büyük ölçüde son derece etkileşen adaylar Kütüphanesi'ndeki zenginleştirilmiş yüksek benzeşme interactors keşfi için sınırlı olmuştur. Geleneksel bir biçimde düşük benzeşme interactors bulunduğu düşük sıkılık yürütülen çözümlemek için çok fazla kolonileri Maya 2-hibrid tahlil yol açabilir. Ayrıca, farklı yem plazmid karşı aynı Kütüphanesi bir kapsamlı ve eksiksiz sorgulama karşılaştırmalı bir analiz elde edilemez. Her ne kadar bazı bu sorunları dizilmiş av kütüphaneleri kullanarak ele alınabileceği böyle ekranlar çalışması için gereken altyapı ve maliyetini engelleyici olabilir. Alternatif olarak, aynı anda geçici düzinelerce ortaya çıkarmak için Maya 2-hibrid tahlil adapte olması ve bir strateji kullanarak tek bir ekran içinde statik protein etkileşimler olarak adlandırdığı DEEPN (dinamik zenginleştirme değerlendirme Protein ağları için), hangi yüksek işlem hacmi DNA sıralama ve hesaplama etkileşen ortakları kodlamak plazmid nüfusu evrimi takip içerir. Burada, özelleştirilmiş reaktifler ve kolayca ve uygun maliyetli yürütülecek bir DEEPN ekran izin iletişim kurallarını açıklar.

Y2H tahlil protein: protein etkileşimleri bulmak için yaygın olarak kullanılmaktadır ve çeşitli uyarlamalar ve sistemleri geliştirilmiştir. Çoğunlukla, bu önceki yaklaşımlar ile başarı sağlamak aynı konuları DEEPN için önemlidir. Bazı önemli kriterler şunlardır: Füzyon protein, sahte düşük bir arka plan onun + ilgi bir boş av plazmid, yem yüksek bir çiftleşme verimliliği ile yem içeren diploitler artış sağlanması ifade DNA'ya bağlanıcı etki alanının sağlanması MATA Maya ile Kütüphane içer...

Toplu işleme Maya 2-hibrid ekranlarının birden fazla yem protein etkileşim profilleri av füzyon protein son derece karmaşık bir dizi doğrudan karşılaştırma sağlar. Burada, rafine yöntemleri, yeni reaktifler ve bunların kullanımı böyle ekranlar için nasıl açıklar.

Bir Maya 2-melez ekran Protein etkileşimleri karşılaştırmak için bir toplu iş

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

Bu yöntem, çeşitli moleküler ve hücresel süreçler hakkındaki temel soruları yanıtlayan protein-protein etkileşimlerini tanımlamak için her iki popülasyonda maya 2-hibrit sistem ilkesini kullanır. Bu teknik, bir proteinin diğerine karşı etkileşimlerini görmek için derin dizilemeden yararlanır. Bu yaklaşım paralel karşılaştırmalar yapmak için tasarlandığından, diferansiyel etkileşimleri ortaya çıkarmak için bir proteinle diğerine karşı etkileşime giren veya aynı proteinin farklı doğrulamalarını veya mutant versiyonuna neden olan bir hastalığı yazarken etkileşime giren protein kümelerini tanımlayabilir.Metin protokolünde açıklandığı gibi bu prosedür için yeni bir maya 2-hibrit yem plazmidi pTEF-GBD oluşturulmuştur. Bu plazmit, Gal4 DNA bağlanma alanının hem yukarı hem de aşağı akışında yem parçalarının klonlanmasına izin veren kanamisin direnç genini taşıyan bir TRP1 sentromer bazlı düşük kopya plazmit içinde Gal4 DNA bağlama alanı füzyon proteinleri üretir. Bu yem plazmidi, MATa mayasını dönüştürmek için kullanıldı ve Gal4 yem füzyon proteinlerinin ekspresyonu, anti-MIC antikorları ile immünoblotlama ile doğrulandı.Ek olarak, aerodinamik av plazmid vektörü PGAL4 AD'de yeni bir maya 2

a-yeast-2-hybrid-screen-in-batch-to-compare-protein-interactions

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

MİT, geçici ve istikrarlı model organizma Saccharomyces cerevisiae ifade proteinler arasındaki etkileşimleri hassas algılama sağlar. Bu, yüksek kapasiteli bir şekilde etkileşim ortakları belirlemek amacıyla eksojen ve maya integral membran proteinleri çalışma başarıyla tatbik edilmiştir.

Split-Ubiquitin Dayalı Membran Maya İki Hybrid (MİT) Sistemi: protein-protein etkileşimleri belirlenmesi için güçlü bir araç

Biz gen-ilaç ve gen-çevre etkileşimleri anlamak için kapsamlı, tarafsız genom ekranlar geliştirdik. Bu mutant koleksiyonlarını tarama yöntemleri sunulmaktadır.

Barkodlu Maya Kütüphaneler Rekabet Genomik Ekranlar

Bu video, belirli protein öz etkileşimlerini tespit etmek için maya iki hibrit testini göstermektedir. Bu tahlilde, ilgilenilen protein, β-galaktosidaz enzimini kodlayan bir transkripsiyon faktörünün iki alanına etiketlenir. İki protein etkileşime girdiğinde, bu, daha sonra bir biyokimyasal tahlil kullanılarak tespit edilen enzimi oluşturmak için transkripsiyon ve translasyona neden olur.

Maya Hücrelerinde Protein Kendi Kendine İlişkilendirmeyi Belirlemek için Maya İki Hibrit Testi

Bu videoda, hedef DNA ile etkileşime giren birden fazla proteini tespit eden modifiye maya tek hibrit testini gösteriyoruz. Dönüştürülmüş maya hücreleri, raportör genin yukarı akışındaki hedef DNA dizisini içerir. Ek olarak, transkripsiyon faktörü proteinlerini eksprese ederler. Proteinler kompleksler oluşturduğunda ve hedef DNA'ya bağlandığında, raportör gen eksprese edilir ve enzimatik olarak tespit edilebilir.

Heteromerik Protein Kompleksi-DNA Etkileşimlerini Tespit Etmek için Modifiye Maya-Bir Hibrit Testi

Bu makalede, ev sahibi ve iki dik yöntemleri bir arada kullanarak patojen proteinler arasında yüksek güvenen etkileşim veri setlerinin belirlenmesi üzerinde duruluyor: maya iki hibrit HT-GPCA adı verilen memeli hücrelerinde yüksek verimli bir etkileşim yöntemi ile izledi.

Ana-Patojen protein-protein etkileşimleri ve Peyzaj karakterize etmek Karşılaştırmalı Bir Yaklaşım

Neredeyse tüm S. içeren protein mikrodiziler kullanarak cerevisiae proteom paralel protein-protein etkileşimleri, binlerce hızlı tarafsız sorgulama için incelenir. Bu yöntem, protein-küçük molekül, translasyon sonrası modifikasyon ve yüksek verimlilik Diğer tahliller için kullanılabilecektir.

Yüksek yoğunluklu Fonksiyonel Protein mikrodizileri Probing Protein-protein Etkileşimleri Algılama

Proteinler birbirleri ile etkileşim halindedir ve bu etkileşimler fonksiyonlarını büyük ölçüde belirler. Protein etkileşim ortakları, dihidrofolat redüktaz protein fragmanı tamamlama testine (DHFR-PCA) dayalı bir maya uygunluk testi kullanılarak in vivo olarak yüksek verimli olarak tanımlanabilir.

Yaşayan Hücrelerde Protein-fragmanı tamamlama Assay (PCA) ile genom Protein-protein etkileşimi Eleme

Bakteriyel efektör proteinleri başarılı enfeksiyonları kurulması için önemlidir. Bu protokol, doğal bitki konukçuda bir bakteriyel efektör proteininin proteinli bağlanma partnerleri ile deneysel tanımlanmasını açıklar. Maya iki hibrit ekranlarından yoluyla bu efektör etkileşimleri belirlenmesi moleküler patojenite stratejilerinin çözülüyor önemli bir araç haline gelmiştir.

Bir Maya İki hibrid Ekran kullanarak Olmayan ekilebilir Bitki Patojen bir Bakteriyel Efektör Fonksiyonu aydınlatmak

Burada açıklanan tadil edilmiş maya tek hibrid tahlil, herhangi bir işlevsel genomik çalışma için heterolog bir sistemde heteromerik protein kompleksi-DNA etkileşimini incelemek ve doğrulamak için klasik maya tek hibrid (Y1H) analizinin bir uzantısıdır.

Heteromerik Protein Kompleksi-DNA Etkileşim Çalışmaları İçin Modifiye Maya-Bir Hibrid Sistem

Pozitif Maya 2-hibrid etkileşimleri için potansiyel olarak seçilen Maya nüfusun derin sıralama etkileşen ortak proteinler hakkında bilgi hazinesi verir. Burada, biz böyle ekranlar sıra verileri çözümlemek için özelleştirilmiş güncelleştirmek bilgisayar yazılımı ve belirli Biyoinformatik araçlarını işlemini açıklar.

Sıralı veri--dan toplu Maya 2-hibrid perde Bilişim Analizi

Protein-protein etkileşimleri gibi biyomoleküllerin etkileşimleri, biyolojik fonksiyonların moleküler temelidir. Özellikle ilgili etkileşimden yoksun olan etkileşim-sıfır/bozulmuş mutantlar izole edilebilirse, bu etkileşimin işlev(ler)ini anlamaya büyük ölçüde yardımcı olacaklardır. Bu makale, etkileşimi boş/bozulmuş mutantları izole etmenin etkili bir yolunu sunmaktadır.

Maya iki-hibrit testi kullanılarak etkileşim-boş/bozulmuş mutantların izole edilmesi

Öğrenin, maya 2-melez sisteminde toplu işlemeyle çoklu yem proteinlerinin etkileşim profillerini derin dizileme kullanarak karşılaştırın. Bu yöntem, protein-protein etkileşimlerini ve farklı etkileşim ağlarını kapsamlı şekilde analiz etmenizi sağlar.

Bir Maya 2-melez ekran Protein etkileşimleri karşılaştırmak için bir toplu iş

Daha fazla video keşfet