Bir Maya 2-melez ekran Protein etkileşimleri karşılaştırmak için bir toplu iş

Bu yöntem, çeşitli moleküler ve hücresel süreçler hakkındaki temel soruları yanıtlayan protein-protein etkileşimlerini tanımlamak için her iki popülasyonda maya 2-hibrit sistem ilkesini kullanır. Bu teknik, bir proteinin diğerine karşı etkileşimlerini görmek için derin dizilemeden yararlanır. Bu yaklaşım paralel karşılaştırmalar yapmak için tasarlandığından, diferansiyel etkileşimleri ortaya çıkarmak için bir proteinle diğerine karşı etkileşime giren veya aynı proteinin farklı doğrulamalarını veya mutant versiyonuna neden olan bir hastalığı yazarken etkileşime giren protein kümelerini tanımlayabilir.

Metin protokolünde açıklandığı gibi bu prosedür için yeni bir maya 2-hibrit yem plazmidi pTEF-GBD oluşturulmuştur. Bu plazmit, Gal4 DNA bağlanma alanının hem yukarı hem de aşağı akışında yem parçalarının klonlanmasına izin veren kanamisin direnç genini taşıyan bir TRP1 sentromer bazlı düşük kopya plazmit içinde Gal4 DNA bağlama alanı füzyon proteinleri üretir. Bu yem plazmidi, MATa mayasını dönüştürmek için kullanıldı ve Gal4 yem füzyon proteinlerinin ekspresyonu, anti-MIC antikorları ile immünoblotlama ile doğrulandı.

Ek olarak, aerodinamik av plazmid vektörü PGAL4 AD'de yeni bir maya 2-hibrit kütüphanesi oluşturuldu. Genomik DNA, kesme yoluyla parçalandı, boyut seçildi, adaptörlerle değiştirildi ve saksafirtab maya 2-hibrit kütüphanesini oluşturmak için PGAL4-AD'ye yerleştirildi. Yem ve av kütüphaneleri ile maya popülasyonları oluşturma prosedürüne başlamak için, yem plazmitleri ve CSM eksi gezi ortamı içeren çeşitli gezi tanesini taşıyan MATa maya dönüştürücülerinin her birinin üç mililitre kültürünü aşılayın.

Prosedürel kontroller olarak hizmet etmek için yalnızca vektör plazmidini içeren iki ayrı kültür ekleyin. Kültürleri altı saat boyunca 30 santigrat derece ve 200 rpm'de inkübe edin. Daha sonra her kültürü steril bir Erlenmeyer şişesinde 25 mililitrelik bir kültüre seyreltin ve gece boyunca inkübe edin.

Lu2 taşıyan av kitaplığını içeren donmuş bir MAT alfa hücresi yığınını oda sıcaklığında çözün. Steril bir Erlenmeyer şişesinde 125 mililitre CSM eksi lu eksi met ortamı aşılamak için çözülmüş aşağılık hücrelerin tamamını kullanın. Kültürü gece boyunca 30 santigrat derece ve 200 rpm'de büyütün.

Ertesi gün, gece matının OD600'ünün dönüştürücü kültürlerin 1.0 ila 1.5 arasında değiştiğini doğruladıktan sonra, kültürleri 50 mililitrelik konik tüplere aktarın ve her kültürün 21 OD 600 eşdeğerini oda sıcaklığında 4.696 kez g'de beş dakika santrifüjleyin. Her bir mat a hücresi peletini 10 mililitre steril su içinde yeniden süspanse edin, süspansiyonu yeni bir 50 mililitre konik tüpe aktarın ve beş dakika boyunca oda sıcaklığında 4.696 kez g'de santrifüjleyin. Bir pipet kullanarak, peletlenmiş hücreleri bozmadan süpernatanı nazikçe çıkarın ve peleti pH 3.7'de dört mililitre tamponlu YPDA ortamında yeniden süspanse edin.

İstenen her 10 çiftleşme reaksiyonu için, 50 mililitrelik konik bir tüpte kütüphane plazmitlerini taşıyan mat alfa suşunun 39 OD 600 eşdeğeri pelet. Mat alfa hücrelerini 10 mililitre steril su içinde yeniden süspanse edin ve 50 mililitrelik yeni bir konik tüpte oda sıcaklığında 4.696 kez g'de beş dakika boyunca yeniden yayınlayın. Bir pipet kullanarak, peletlenmiş hücreleri bozmadan süpernatanı nazikçe çıkarın ve peleti pH 3.7'de 10 mililitre tamponlu YPDA ortamında yeniden süspanse edin.

Her bir çiftleşme reaksiyonunu ayarlamak için, aşağıdakileri yeni bir 50 mililitrelik konik tüpe ekleyin: Bir mililitre MAT-A dönüştürülmüş hücre, bir mililitre MAT-alfa kütüphanesi içeren hücreler ve pH 3.7'de bir mililitre tamponlu YPDA. 30 santigrat derecede 90 dakika boyunca nazik, orbital çalkalama ile inkübe edin. 90 dakika sonra, hücreleri beş dakika boyunca oda sıcaklığında 4.696 kez g sıcaklıkta santrifüjleyin.

Süpernatanı çıkarın ve peleti bire bir tamponlu YPDA-YPD'nin iki mililitresinde yeniden süspanse edin. İki mililitre hücrenin tümünü 100 mililitrelik bir YPD plakasına yerleştirin ve yaklaşık 20 saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Hücreleri hasat etmek için, her bir YPD plakasına iki ila üç mililitre CSM eksi lu eksi açma ortamı pipetleyin ve hücreleri çıkarmak için bir hücre kazıyıcı kullanın.

Yerinden çıkan hücreleri 50 mililitrelik konik bir tüpe pipetleyin. Ortamı pipetlemek için 1.000 mikrolitrelik bir pipet kullanarak ve YPD plaka yüzeyi boyunca nazikçe çıkararak plakayı iki ila üç mililitre CSM eksi lu eksi açma ortamı ile dört ila beş kez durulayın. Hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 4.696 kez g'de santrifüjleyin.

Süpernatanı her bir konik tüpten atın ve hücreleri yukarı ve aşağı pipetleyerek 40 mililitre CSM eksi lu eksi açma ortamında yeniden süspanse edin. Oluşan diploid hücrelerin sayısını tahmin etmek için, diploid karışımının dört mikrolitresini sırasıyla 200 mikrolitre ve 2.000 mikrolitre CSM eksi lu eksi açma ortamına seyreltin. Her seyreltmenin 200 mikrolitresini, hasat edilen diploid stoğunun bir ila 10.000 ve bir ila 100.000 tam seyreltmesini temsil edecek şekilde bir CSM eksi lu eksi açma plakası üzerine yerleştirin.

Plakaları 36 ila 40 saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Bir litrelik Erlenmeyer şişesinde 500 mililitre CSM eksi lu eksi açma ortamını aşılamak için hemen her 40 mililitre hücre yeniden süspansiyonunun geri kalanını kullanın. Her kültürün OD 600'ünü ölçün.

Bu şişeleri 30 santigrat derecede, 180 rpm'de çalkalayarak, tipik olarak 36 ila 40 saat süren doygunluğa ulaşana kadar inkübe edin. OD 600'ü ölçerek hücre büyümesini 24 saat ve 36 saatte izleyin. Prosedüre devam etmeden önce, iki maya suşunun çiftleşme verimliliğini onaylayın.

Bir ila 10.000 seyreltme plakası üzerinde minimum 200 koloni gereklidir. Kültürler doygunluğa ulaştığında, her kültürden 20 mililitrelik bir alloquade çıkarmak için bir pipet kullanın ve iki litrelik Erlenmeyer şişelerini aşılayın. 750 mililitre CSM eksi lu eksi açma ortamı içeren bir şişe ve 750 mililitre CSM eksi lu eksi açma eksi ortamı içeren ikinci bir şişe

En düşük seviye olan üç amino 124 triasol ile arka planı ortadan kaldırır, daha önce metin protokolünde açıklandığı gibi belirlenir. Yeni kültürleri döndürerek iyice karıştırın. İlk OD 600'ü ölçtükten sonra, kültürleri 30 santigrat derecede, 180 rpm'de çalkalarken doygunluğa kadar inkübe edin, bu tipik olarak seçilmemiş CSM eksi lu eksi gezi kültürü için 24 saat içinde gerçekleşir, ancak maya 2-hibrit etkileşimleri için seçim altındaki kültürler için 70 saatten fazla sürebilir.

Kültürler doygunluğa ulaştığında, her kültürden 11 mililitreyi pipetle çıkarın ve hücreleri oda sıcaklığında 4.696 kez g'de beş dakikalık bir dönüşle çökeltin. Süpernatanı atın ve bir sonraki bölümde gösterildiği gibi DNA ekstraksiyonuna devam edin. DNA ekstraksiyon prosedürüne başlamak için, daha önce hazırlanan her hücre peletini 500 mikrolitre güçlü TE tamponunda yeniden süspanse etmek için bir pipet kullanın.

1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve her tüpe 10 mikrolitre zimolay stoğu ekleyin. Bir davlumbazda, her tüpe üç mikrolitre beta marketol etanol ekleyin ve iyice karıştırın. 37 derece santigrat derece inkübatörde 24 ila 36 saat inkübe edin.

Daha sonra, metin protokolünde açıklandığı gibi numuneleri 500 mikrolitre fenol kloroform izolaymal alkol ile iki kez çıkarın. Yedi mikrolitre dört molar sodyum klorür ve 900 mikrolitre buz gibi,% 100 etanol ekleyin ve ters çevirerek karıştırın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 21, 130 kez g'de bir mikro santrifüjde döndürerek DNA'yı çökeltin.

Süpernatanı pipetleyerek atın ve her peleti 900 mikrolitre% 70 etanol ile üç kez yıkayın. DNA'yı iki dakika boyunca 21, 130 kez g'de santrifüjleyerek çökeltin. Kalan etanolü çıkardıktan sonra, peletleri yedi dakika boyunca 42 santigrat derecede kurutun.

Her peleti 37 derece Santigrat su banyosunda 120 mikrolitre 0.1x güçlü TE'de 90 dakika boyunca yeniden süspanse edin. Ekstrakte edilen DNA'nın 60 mikrolitresini steril 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne pipetleyin. 120 mikrolitre güçlü TE ve 3.5 mikrolitre RN ace A stoğu ekleyin, karıştırmak için hafifçe vurun ve bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Her tüpe yedi mikrolitre beş molar amonyum asitat ve 900 mikrolitre buz gibi,% 100 etanol ekleyin. Daha önce gösterildiği gibi DNA'yı ters çevirerek karıştırın ve çökeltin. RNace-A ile muamele edilmiş DNA'yı 37 santigrat derece su banyosunda 55 mikrolitre 0.1x güçlü TE'de 90 dakika boyunca yeniden süspanse edin.

DNA'yı 260 nanometrede absorbans ile ölçün. Bir sonraki adım, CDNA eklerinde PCR gerçekleştirmektir. DNA örneği başına iki adet 50 mikrolitre PCR reaksiyonu gerçekleştirin.

Her reaksiyona su, beş mikrogram DNA örneği, av kütüphanesi plazmidiyle eşleşen her ileri ve geri primerden 25 pikamole ve 25 mikrolitre yüksek kaliteli 2x PCR ana karışımı ekleyin. Bu programla reaksiyonları güçlendirin. 98 santigrat derecede 30 saniyelik bir de-natürasyon, 10 saniye boyunca 98 santigrat derecede 25 döngü D-natrine, 30 saniye boyunca 55 santigrat derecede anebe ve 72 santigrat derecede üç dakikalık uzatma süreleri, ardından 72 santigrat derecede beş dakikalık bir inkübasyon.

Her bir PCR reaksiyonunu, atidimobromin içeren bir jel ile %1 DNA agroz soğuk elektroforezi ile analiz edin ve jeli UV transillüminasyonu ile görselleştirin. Seçilim yapılmayan örnekler, genelleştirilmiş bir DNA yayması gösterir, ancak seçim üzerine bireysel bantlar ayırt edilebilir. Yinelenen PCR örneklerini birleştirin ve üreticinin talimatlarına göre bir kit kullanarak saflaştırın.

DNA'yı bir spektrofotometrede 260 nanometrede absorbans ile ölçün. Daha sonra, derin sıralama gerçekleştirin, ardından metin protokolünde açıklandığı gibi biyoinformatik işleme ve doğrulama yapın. Gösterilen prosedürde yeni rastgele parçalanmış maya 2-hibrit kütüphanesi kullanıldı ve PCR ile amplifiye edilen plazmit ekleri, DEEPN yazılımı kullanılarak DEEP dizileme ve biyoinformatik işleme ile analiz edildi ve daha önce yayınlanmış bir kütüphane ile karşılaştırıldı.

Bu grafik, kütüphanelerdeki her gen başına sazların sıralama sırasını, maya genomunun dizilenmesiyle bulunan gen başına sazlara bölünmesiyle gösterir. Bu histogram, hem protein kodlama bölgesinde hem de uygun translasyonel okuma çerçevesinde bulunan bir parçayı kodlayan gen başına benzersiz plazmitlerin sayısını gösterir. Maya genlerini kodlayan her bir kütüphanedeki farklı plazmitlerin sayılarının ve doğru translasyonel okuma çerçevesinde olan ve olmayan veya geriye doğru eklenen oranların karşılaştırılması gösterilmiştir.

Genel olarak, yeni kütüphane daha birçok farklı plazmide sahiptir. Bu yöntemler, kütüphanenin farklı yem proteinleri içeren hücrelere tekrarlanabilir bir şekilde aktarılabilmesini ve seçim prosedürünün, zenginleştirilmiş, bunları spesifik aday etkileşimli proteinler olarak ayırt eden tekrarlanabilir gen kümeleri verebilmesini sağlar. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa yaklaşık bir hafta içinde yapılabilir.

Bu çalışmanın çoğu hücre kültürlerini inkübe etmektir ve aslında uygulamalı süre sadece birkaç saattir. Bu prosedürü denerken, kütüphanenin farklı yem proteinlerini içeren hücrelere tekrarlanabilir bir şekilde aktarılabilmesi için çok sayıda bireysel diploid hücreden oluşan popülasyonlar oluşturmayı hatırlamak önemlidir. Pozitif maya 2-hibrit koşulları için seçilim geçiren popülasyonlar için hücrelerin seyreltme koşullarına ve büyüme hızına çok dikkat etmek de önemlidir.

Bu prosedürü takiben, eşlik eden çalışmada açıklanan hesaplama yöntemleri, aday etkileşimli proteinleri tanımlayacak ve bu etkileşimlerin geleneksel bir maya 2-hibrit testi veya diğer biyokimyasal yöntemler kullanılarak doğrulanması için bir yol sağlayacaktır. Bu videoyu izledikten sonra, av plazmid kitaplığını içeren diploid maya popülasyonlarının tekrarlanabilir bir şekilde nasıl oluşturulacağı ve pozitif maya 2-hibrit etkileşimlerini seçmek için bunları toplu olarak nasıl büyüteceğiniz hakkında çok iyi bir fikre sahip olmalısınız. DNA saflaştırma protokolü sırasında organik çözücülerle çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve çeker ocakta eldiven ve laboratuvar önlüğü giyilerek yapılması gerektiğini unutmayın.