Yalıtım, genişleme ve Adipojenik indüksiyon CD34 + CD31 + insan Omental ve deri altı yağ dokusu endotel hücrelerden

Bu yöntem, yağ dokusunun yeniden şekillenmesi sırasında sağlam bir adipojenik yanıtı önleyen temel faktörlerin ve mekanizmaların belirlenmesi gibi obezite alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, küçük miktarlarda doku ile başlayarak insan yağ dokusundan CD34+CD31+endotel hücrelerinin izolasyonuna olanak sağlamasıdır. Bu yöntem için ilk olarak, insan yağ damar sistemindeki adipojenik stimülasyona yanıt veren hücreleri tanımlamak istediğimizde aklımıza geldi.

Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü çoğu zaman taze insan yağ dokusuna sınırlı erişim nedeniyle hücre izolasyon adımlarının uygulanması zordur. Bariatrik cerrahi geçiren insan deneklerden insan omental ve deri altı yağ dokusu toplayın. Doku ekstraksiyonundan hemen sonra, insan omental ve deri altı yağ dokusunu, oda sıcaklığında mililitre başına 50 mikrogram penisilin streptomisin ile Hank'in tamponlu tuz çözeltisini içeren ayrı şişelerde tutun.

Doku ekstraksiyonundan sonra numune laboratuvara ulaştığında, %70 etanol çubuklu makas ve cımbız kullanarak dokunun fibrotik ve koterize bölümlerini dikkatlice temizleyin ve çıkarın. Yağ dokusunu tartın ve kollajenaz sindirimi için beş gramlık alikotlara bölün. Oda sıcaklığında bir sintilasyon şişesinde beş mililitre kollajenaz çözeltisinde beş gram yağ dokusunu ince bir şekilde doğramak için iki makas kullanın.

Kıyılmış dokuya toplam 15 mililitre olmak üzere 10 mililitre daha kollajenaz çözeltisi ekleyin. Numuneleri sürekli çalkalayarak bir su banyosunda 37 santigrat derecede bir saat sindirin. Sindirimi takiben, numuneleri 20 mililitrelik künt uçlu şırıngaya dökün.

Adipositleri ve stromal vasküler hücreleri sindirilmemiş dokudan ayırmak için numuneyi 250 mikron naylon ağdan 50 mililitrelik konik tüpe süzün. Sintilasyon şişesini 10 mililitre KRBBS ile yıkayın ve filtrelenmiş numuneleri oda sıcaklığında beş dakika inkübe etmeden önce artık hücreleri toplamak için yıkamayı filtreden dökün. Ardından, stromal vasküler fraksiyon tabakasını çıkarmak için 20 mililitrelik bir şırınga ve 20 gauge altı inçlik bir pipetleme iğnesi kullanın ve temiz bir 50 mililitrelik konik tüpe aktarın.

10 mililitre KRBBS ekleyin ve numunelerin oda sıcaklığında beş dakika tezgahta oturmasına izin verin. Daha sonraki işlemler için her iki depodaki stromal vasküler fraksiyonları buz üzerinde tutun. Stromal vasküler fraksiyonları 4 santigrat derecede beş dakika boyunca 500 kez G'de döndürün.

Numuneleri santrifüjden çıkarın ve süpernatanı dikkatlice dökün, peleti stromal vasküler fraksiyon hücrelerini içeren halde tutun. Hücre peletlerini beş mililitre PBS'de yavaşça yeniden süspanse edin. Numuneleri tekrar döndürdükten sonra, süpernatanı çıkarın, hücreleri bir mililitre PBS'de yeniden askıya alın ve hücreleri sayın.

Numuneleri üçüncü kez peletleyin ve peleti 100 mikrolitre CD34 izolasyon tamponunda yeniden süspanse edin. 10 mikrolitre CD34 kokteyli ekleyin ve numuneyi oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Daha sonra beş mikrolitre manyetik boncuk ekleyin ve numuneyi oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

Daha sonra, her numuneye 2,5 mililitre CD34 izolasyon tamponu ekleyin ve numuneleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca mıknatısın içine yerleştirin. İzolasyon tamponunu dökmek için mıknatısı beş saniye ters çevirin. Bu işlemi dört kez tekrarladıktan sonra, tüpü mıknatıstan çıkarın ve iki mililitre CD34 izolasyon tamponu ekleyin.

Başka bir santrifüjlemenin ardından, CD34 + hücre peletlerini bir mililitre CD34 izolasyon tamponunda yeniden süspanse edin ve hücreleri sayın. Hücreleri tekrar pelet haline getirin ve peleti 250 mikrolitre Tampon B ve 250 mikrolitre yıkama tamponunda tekrar süspanse edin. Daha sonra, tüpü girdaplayarak CD31 boncuklarını iyice yeniden askıya alın, ardından yeniden süspanse edilmiş hücre peletine 20 mikrolitre CD31 boncuk ekleyin ve numuneyi oda sıcaklığında 30 dakika sallanarak inkübe edin.

Hücre ayrılmasından önce, süzgeci dengelemek için bir mililitre yıkama tamponu ekleyin. Daha sonra, CD31 boncuklarında yeniden süspanse edilmiş hücrelerin hazırlanmış karışımını süzgecin üzerine uygulayın. Süzgeci beş mililitre yıkama tamponu ile toplam 20 mililitre hacim için dairesel hareketlerle yıkayın.

Konektörü steril 50 mililitrelik konik bir tüpe takın ve leur kilidini kapatın. Süzgeci konektöre taktıktan sonra, süzgecin duvarı boyunca bir mililitre yıkama tamponu ekleyin, ardından süzgecin duvarı boyunca bir mililitre aktif Tampon D ekleyin. Numuneyi nazikçe döndürün ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

Ardından, bir mililitre yıkama tamponu ekleyin ve 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri boncuklardan ayırın. Leur kilidini açın ve ayrılan hücrelerin 50 mililitrelik konik tüpe akmasına izin verin. Süzgeci her seferinde bir mililitre yıkama tamponu ile 10 kez yıkayın.

Konektörü ve süzgeci atın ve numuneleri 300 santigrat derecede 10 dakika boyunca 4 kez G'de santrifüjleyin. Son olarak, hücre peletini kültür için iki mililitre tam EGM2 ortamında yeniden süspanse edin. Hücreleri, 37 santigrat derece,% 5 karbondioksit inkübatörde tam EGM2 ortamı ile altı oyuklu doku kültürü ile muamele edilmiş plakalarda büyütün.

Hücreler %80 ila 90 birleşmeye ulaşana kadar ortamı her üç ila dört günde bir değiştirin. Daha sonra, yaklaşık 100 ila 200 bin hücreyi altı oyuklu plakalara tohumlayın, her depo için çift kuyucuklar sağlayın ve bunları iki gün boyunca tam EGM2 ortamında kültürleyin. İki gün sonra, herhangi bir büyüme ortamını aspire edin.

Ortamı, kontrol hücreleri için% 5 FBS ve mililitre başına 50 mikrogram penisilin streptomisin içeren iki mililitre DMEM / F-12 ortamı ile değiştirin. Tedavi hücreleri için, ortamı iki mililitre adipogenez ortamı ile değiştirin. Hücreleri 37 santigrat derecede nemlendirilmiş% 5 karbondioksit inkübatörde 13 gün boyunca inkübe edin ve ilgili ortamı her üç ila dört günde bir değiştirin.

Kültürde iki geçişten sonra CD34 + CD31 + hücrelerinin tipik endotelyal parke taşı benzeri morfolojisini gösteren temsili sonuçlar gösterilmiştir. Ayrıca, hücrelerin beklendiği gibi Matrigel'de kültürlendiğinde tübüller oluşturma yeteneği de gösterilmiştir. Floresan etiketli asetillenmiş LDL'nin tek tip alımı, endotel kimliğine sahip homojen bir hücre popülasyonunun varlığını gösterir.

Burada, 13 günlük adipojenik indüksiyonu takiben CD34 + CD31 + hücrelerindeki nötr lipid damlacıklarının Yağ Kırmızısı O boyaması gösterilmektedir. Üç farklı insan deneğin omental ve subkutan depolarından alınan hücrelerin temsili tepkilerinin, aynı donörün yağ depoları arasındaki ve donörler arasındaki adipojenik indüksiyona yanıt olarak büyük değişkenliği gösterdiği gösterilmiştir. Bu görüntü, 13 gün boyunca adipojenik indüksiyondan sonra CD34 + C31 + hücrelerinde floresan hücre içi lipid boyamasını göstermektedir.

Görüntü, tek gözlü lipitleri, multiloküler lipitleri olan ve lipid birikimi olmayan hücreleri göstermektedir. Gerçek zamanlı PCR, pan adiposit belirteci adiponektin ve kahverengi bej belirteçler CIDEA ve UCP-1'in ekspresyonunu gösterir. Bu sonuçlar, adipojenik indüksiyonu takip eden hücrelerin, karışık beyaz bej adiposit fenotipi ile tutarlı moleküler belirteçleri eksprese ettiğini doğrulamaktadır.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa beş saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, toplanan ve iki saatten daha uzun süre saklanmayan taze insan yağ dokusunu kullanmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, yanıt veren hücrelerin spesifik alt kümelerini tanımlamak ve bej kahverengi adiposit fenotipini tanımlamak için kullanılabilecek olgun adiposit belirteçlerinin ekspresyonu için akış sitometrisi, immünohistokimya ve RT-PCR gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.

Geliştirildikten sonra, bu teknik, obezite alanındaki araştırmacıların insanlarda yağ dokusu, vasküler hücreler ve adipogenezin rollerini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, CD34 + 31 + hücrelerinin nasıl izole edileceğini, kültürleneceğini ve genişletileceğini iyi anlamış olmalısınız. İnsan dokularıyla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman biyo-güvenlik düzenlemeleri gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.

Bu tekniğin etkileri, insülin direnci gibi obezite ile ilişkili komorbiditelerin tedavisine kadar uzanır, çünkü hücrelerin potansiyel bir terapötik müdahaleye adipojenik tepkisini tanımlar.