Bakteriyel konjugasyon frekans yüksek çözünürlüklü karşılaştırma

Bu yöntem, plazmid DNA'sının farklı bakteriler arasında ne sıklıkta yayıldığı nasıI mikrobiyoloji alanındaki anahtar soruların cevaplanılmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, arka planı azaltarak, yüksek çözünürlükte çekim sıklığındaki küçük farklılıkları tespit edebiliyor olmamızdır. Prosedürü gösteren Kosuke Yanagiya, benim laboratuvar bir yüksek lisans öğrencisi olacaktır.

En olası sayıya göre çekim sıklığını hesaplamak için, sadece gösterildiği gibi, 30 santigrat derece 45 dakika boyunca bir gecede alıcı kültüründen bir mililitre ile bir gecede donör kültüründen bir mililitre filtre mate. Co-kültür kuluçka iken, seri donör Luria suyu üzerine kaplama için orijinal donör ve alıcı kültürleri seyreltmek, veya LB, artı kanamisin, ya da alıcı LB artı gentamisin plakaları 30 santigrat derece iki günlük bir kültür için. Kuluçka sonunda, dört kat 96-iyi hücre kültür plakaseri seyreltme için kanamisin ve gentamisin içeren steril LB filtre üzerinde kültür resuspend.

30 santigrat derece iki gün sonra, el ile donör ve alıcı agar plakaları ve transkonjugantlar ışık mikroskobu ile büyümek kuyuların sayısı üzerinde koloni oluşturan birimleri, ya da CPU'lar saymak. En olası sayıyı ve sapmasını hesaplamak için MPN hesaplama programını açın. Denemenin adını ve tarihini, test serisinin sayısını ve elektronik tablo dosyasının program sayfasının yedinci satırındaki maksimum seyreltme sayısını girin.

Otomatik olarak üretilen giriş veri tablolarına, formülü seyreltme faktörü D sütununa, mililitre veya GW sütununda hacimde 0,01 ve N sütunundaki tüp sayısında dört formülü girin. Her numune seyreltmede transkonjugantlerin büyüdüğü kuyu sayısını girin ve sonuçları mililitre başına en olası sayı olarak elde etmek için sonuçları hesapla'ya tıklayın ve üst ve alt %95 güven limitlerini girin. Daha sonra, plazmidlerin çekim sıklığını hesaplamak için transkonjugant sayısını mililitre başına donör ve alıcı koloni oluşturan birimlerin sayısına bölün.

Bu temsili deneyde, pBP136:gfp plazmidine tanıtılan kültürler için sıfır ile 400 RPM arasında gözlenen konjugasyon sıklığı maksimum fark ile her iki plazmidin çekim sıklığı daha yüksek karıştırma oranlarında ve pCAR1:gfp plazmidine tanıtılan kültürler için sıfır ile 200 RPM arasında artmıştır. Çekim olasılığını karşılaştırmak için gerekli alıcı hücrelerin yoğunluğunu belirlemek için, farklı donör ve alıcı yoğunlukları ile miyonlama tahlilleri yapıldı. Bu temsili deneyde, pBP136:gfp transkonjuganları, donörün üçüncü CFU'su için 10 kere, alıcının yedinci CFU'su için 10 kere, alıcının ikinci CFU'su için bir kez 10 ve alıcının yedinci CFU'su için bir kere 10-10'u içeren kuyuların %100'ünde tespit edildi. , hücre yoğunluğunun çok yüksek olduğunu gösterir.

10 CFU donör ve 10 altıncı veya alıcının beşinci CFU 10 ile miatlama tahlilleri, ancak transkonjugant pozitif kuyuların azalmış sayıda sonuçlandı. Böylece, 10 alıcının beşinci CFU tek bir donör hücre ile çiftleme için gerekli olduğu tahmin edildi. Genel olarak transkonjugant pozitif kuyuların yüzdeleri pBP136:gfp'den çok daha düşük olmasına rağmen, donör ve alıcı suşlarının farklı yoğunluklarında pCAR1:gfp ile miyp1:gfp ile miyp130.

Donör ve alıcı hücrelerin birbirine benzer şekilde bağlanabildiği varsayarak, pCAR1 donörünün konjugasyon başlatma olasılığı pBP136 donöründen daha düşüktü. Bu sonuçlara dayanarak, FACS tarafından sıralanmış tek bir donör hücre için alıcının yedinci CFU'su için 10 ila 10'un gerekli olduğu tahmin edilmiştir. Transkonjugant pozitif kuyuların sayıları sayıldıktan sonra, pBP136:gfp için transkonjugant pozitif kuyuların yüzdesi pCAR1:gfp için olduğundan daha büyük olarak belirlendi ve bu iki plazmid arasında donörün konjugasyonu nun 36 kattan fazla bir fark ını gösterdi.

Prosedürü denerken, her zaman dikkatle bakteri karışımları seyreltmek için hatırlamak önemlidir.