Bir roman doygunluk Mutagenesis yaklaşım: Tek adım karakterizasyonu düzenleyici protein RNA Phosphorothioates kullanarak siteleri bağlama

RNA'daki bu fosforotiyoat yaklaşımının genel amacı, doygunluk mutajenezini tek bir adımda gerçekleştirmektir. Bu yöntem, gen regülasyonu gibi moleküler biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel yararı, tek bir adımda, RNA'daki bir protein bağlanma bölgesinin doygunluk mutajenezinin gerçekleştirilebilmesidir.

Bu tek aşamalı doygunluk mutajenez protokolündeki önemli bir adım, DNA şablonunu protein bağlama bölgesi içinde vahşi olmayan tip nükleotidlerle doping etmektir. İlk olarak, bir DNA sentezleyici üzerinde kimyasal sentez yoluyla bir T7 primerini sentezleyin. Daha sonra, protein bağlanma bölgesine karşılık gelen katkılı bir oligonükleotid sentezleyin.

Bu örnekte, altı çizili dizi, drosophilas cinsiyet-öldürücü protein bağlanma bölgesinin ters tamamlayıcısını içerir ve her doping bölgesi bir X ile temsil edilir. Her doping bölgesi için %90 vahşi tip nükleotid ile %10 vahşi olmayan tip nükleotid oranını kullanın. Yeşil renkli dizi, T7 primer dizisini tamamlayıcı niteliktedir ve in vitro transkripsiyon için T7 promotörüdür. Bu protokoldeki bir sonraki adım, her fosforotiyoat nükleotidi ile ayrı RNA'ların sentezi ve ardından RNA'nın 5 asal uçlu radyo-etiketlemesidir.

20 mikrolitrelik bir transkripsiyon reaksiyonunda her fosforotiyoat için RNA'ları sentezleyin. Her mikrosantrifüj tüpüne aşağıdakileri ekleyin: T7 transkripsiyon tamponu, bir mikromolar T7 oligonükleotid, bir mikromolar katkılı oligonükleotid, 10 milimolar DTT, iki milimolar GTP, ATP, CTP ve UTP'nin her biri bir milimolar ve mikrolitre başına iki birim T7 RNA polimeraz. Bir tüpe 0.167 milimolar alfa-tiyo ATP ve diğer tüpe 0.05 milimolar alfa-tiyo UTP ekleyin.

RNA sentezi reaksiyon karışımlarını 37 santigrat derecede iki saat inkübe edin. İki saat sonra, her RNA örneğine 2,5 mikrolitre ısıya dayanıksız alfa fosfataz ve 2,5 mikrolitre 10X fosfataz tamponu ekleyin. 5 asal fosfatları çıkarmak için 37 santigrat derecede 10 ila 30 dakika inkübe edin.

Alkalin fosfataz enzimini 80 santigrat derecede iki ila beş dakika ısıtarak etkisiz hale getirin. Kalan adımlar radyoaktivite kullanımını içerir ve radyoaktiviteden korunmak için uygun önlemler ve bir Pleksiglas kalkan kullanılarak gerçekleştirilmelidir. Fosforile edilmiş RNA'nın 5 asal ucunu radyo-etiketlemek için, 10 mikrolitrelik bir reaksiyon hacminde bir mikrolitre T4 polinükleotid kinaz ve bir mikrolitre Gamma P32 ATP kullanın.

Reaksiyon karışımlarını 37 santigrat derecede 30 ila 60 dakika inkübe edin. T4 polinükleotid kinaz enzimini 65 santigrat derecede 20 ila 30 dakika ısıtarak etkisiz hale getirin. Reaksiyonları %10 denatüre edici bir poliakrilamid jel içinde çalıştırın.

Otoradyografi ile jel üzerindeki RNA'yı bulun ve radyoaktif işaretli RNA içeren jel dilimini çıkarın. Jel dilimini bir mikrosantrifüj tüpünde bir pipet ucu ile yana doğru bastırarak ezin ve ardından proteinaz K tamponu ekleyin. Tüpleri oda sıcaklığında iki saatten gece boyunca döndürün.

Daha sonra jel bulamacını santrifüjleyin, tampon çözeltisini toplayın ve jeli atın. Her çözeltiyi eşit hacimde fenol kloroform ile iki kez ekstrakte edin. Bundan sonra, çözeltiyi kloroform ile bir kez çıkarın.

Sulu fazı toplayın ve buna 0.1 hacim üç molar sodyum asetat pH 5.2, taşıyıcı tRNA veya glikojen ve 2.5 hacim etanol ekleyin. Numuneleri bir saat boyunca eksi 80 santigrat derecede tutun. Numuneleri yüksek hızlı bir mikrosantrifüjde 16.873 kez g'de beş ila 10 dakika santrifüjleyin.

RNA peletini bozmadan tampon etanol çözeltisini dikkatlice çıkarın. Peletleri% 70 etanol ile yıkayın ve iki ila beş dakika santrifüjleyin. Etanolü dikkatlice çıkarın ve peletleri havayla kurutun.

Her peleti 20 ila 50 mikrolitre DEPC ile arıtılmış suda yeniden süspanse edin. Kullanana kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın. Girişim nedeniyle bölümleme kavramı burada gösterilmektedir.

Protein bağlanma işlemi sırasında, RNA molekülleri, proteine bağlı fraksiyon ile bağlanmamış fraksiyon arasında bölünür. Belirli bir pozisyondaki spesifik bir nükleotid, protein bağlanmasına müdahale ederse, tercihen proteine bağlı fraksiyondan çıkarılacaktır. Daha sonra, fosforotiyoat dahil etme bölgelerinde RNA'ları parçalamak için iyot kullanılır.

Bu prosedürlere başlamak için, 10 milimolar Tris-HCl, bir milimolar DTT, 50 milimolar potasyum klorür, mikrolitre başına 0.5 birim RNaz inhibitörü, mikrolitre başına 0.09 mikrogram asetillenmiş sığır serum albümini, bir milimolar EDTA, mikrolitre başına 0.15 mikrogram tRNA, 5-prime-end radyo-işaretli RNA ve altı mikrolitre uygun bir protein konsantrasyonu. Protein bağlama reaksiyonlarını 25 santigrat derecede 20 ila 30 dakika inkübe edin. Proteine bağlı RNA fraksiyonunu, nitroselüloz filtre bağlanması ile bağlanmamış fraksiyondan ayırın.

Bağlanma reaksiyonunu oda sıcaklığında bir vakum manifolduna bağlı bir nitroselüloz filtreye uygulayın. Bağlanmamış RNA filtreden akarken filtre üzerinde sadece RNA protein kompleksi tutulacaktır. Nitroselüloz filtrenin, tutulan radyoaktif RNA'yı içeren kısmını, bir mikrosantrifüj tüpüne sığacak şekilde daha küçük parçalara kesin ve filtre parçalarını daldırmak için yeterli proteinaz K tamponu ekleyin.

Filtre parçalarından RNA'yı iki ila üç saat veya gece boyunca elute edin. Daha sonra, çözeltiyi her tüpten yeni bir tüpe aktarın ve daha önce gösterildiği gibi fenol kloroform ve kloroform ile ekstrakte edin. Sulu fazı toplayın ve buna 0.1 hacim üç molar sodyum asetat pH, 5.2 ve 2.5 hacim etanol ekleyin ve dondurucuda inkübe edin.

RNA'yı daha önce gösterildiği gibi santrifüjledikten, yıkadıktan ve kuruttuktan sonra, RNA'yı DEPC ile muamele edilmiş suda yeniden süspanse edin. İyot içeren tüm adımlar bir davlumbazda gerçekleştirilmelidir. Fosforotiyoat dahil etme bölgelerinde RNA'ları parçalamak için, her RNA örneğine 10 mikrograma kadar taşıyıcı tRNA içeren 20 mikrolitre DEPC ile muamele edilmiş suya bir milimolar iyot ekleyin.

Oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Daha önce gösterildiği gibi sodyum asetat ve etanol ekleyerek bölünmüş RNA'yı çökeltin. Bölünmüş RNA'yı denatüre edici jeller için bir yükleme boyası içinde yeniden süspanse edin.

Isıtıldıktan sonra, numuneleri %15-20 oranında denatüre eden bir poliakrilamid jel içine yükleyin ve RNA parçalarını elektroforez ile ayırın. Poliakrilamid jeli bir X-ışını filmine maruz bırakın ve otoradyografi kullanarak toplam havuza karşı bağlı fraksiyondaki bantları tespit edin. Bu şematik, girişim nedeniyle bölümleme kavramını göstermektedir.

T şeridinde, toplam RNA fraksiyonu, bant yoğunluğu tüm katkılı pozisyonlar için yaklaşık olarak eşittir. Proteine bağlı RNA fraksiyonunda, 1, 4 ve 7 konumlarında, nükleotidin bağlanma üzerinde hiçbir etkisi yoktur. Bununla birlikte, 3 ve 6 konumlarında, bağlanmaya müdahale eder ve bağlı fraksiyondan çıkarılır.

5 konumunda, girişim kısmidir. Her nükleotid için eşleştirilmiş şeritlerin karşılaştırılması, dört nükleotidin tümünün analizine izin verir. Bu otoradyograf, denatüre edici bir jelden iki çift şeridi gösterir.

Şerit T toplam RNA'dır ve şerit B proteine bağlı RNA'dır. Dikey çizgi, cinsel ölümcül bağlanma bölgesini işaretler. Alfa-tiyo alin çifti için, 1, 2, 3 ve 5 bantları toplam RNA fraksiyonunda bulunur, ancak bağlı RNA fraksiyonunda yoktur veya önemli ölçüde azalır.

Alfa-tiyo ülin çifti için, 7 ve 8 bantları, bağlı fraksiyonda nispeten daha az yoğundur. Tercihen bağlı fraksiyondan çıkarılan kalıntılar, protein bağlanması için önemlidir. RNA'lar sentezlendikten ve 5 asal uç etiketlendikten sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa 12 saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, uygun düzeyde fosforotiyoat dahil edilmesinin ve bağlanma için uygun protein konsantrasyonunun belirlenmesinin önemli hususlar olduğunu hatırlamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, mutajenez yaklaşımının sonucunu doğrulamak ve biyolojik uygunluğu anlamak için uygun fonksiyonel testler veya in vivo testler gibi diğer yöntemler yapılabilir. Bu teknik, daha pahalı veya daha zahmetli veya her ikisi de olan diğer yöntemlere bir alternatif sunar.

Bu videoyu izledikten sonra, mutant kitaplığın nasıl tasarlanacağı ve sentezleneceği, bağlanma reaksiyonlarının nasıl gerçekleştirileceği, her havuzdaki mutant nükleotidlerin nasıl tanımlanacağı ve test edilen her pozisyonda vahşi tip nükleotidlerin etkisinin nicel olarak nasıl analiz edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Poliakrilamid ve radyoaktivite ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken eldiven, uygun egzoz ve radyoaktif kalkan kullanmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.