Name: Bir roman doygunluk Mutagenesis yaklaşım: Tek adım karakterizasyonu düzenleyici protein RNA Phosphorothioates kullanarak siteleri bağlama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: Öğrenin RNA'daki protein bağlama bölgelerinde tek adımda doygunluk mutagenezisi yapmayı. Bu fosforotioat yöntemi, gen regülasyonu mekanizmalarını anlamak için verimli bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazar Ulusal son finansmanı için Sağlık Enstitüleri ve teşekkür Michael R. Green oligonucleotides sentezleme için.

Not: Resim 1 phosphorothioate mutagenesis genel bir bakış sağlar ve işleminin temel adımları özetlemektedir.
1. nesil bir kütüphane mutantların — DNA şablon vahşi türü nükleotit ile Doping
<ol><li>T7 astar sentez (5'-GTAATACGACTCACTATAG-3') bir DNA synthesizer üzerinde kimyasal sentez tarafından.</li>
	<li>Katkılı oligonükleotid (iplikçik) protein bağlayıcı siteye karşılık gelen bir DNA synthesizer üzerinde kimyasal sentez tarafından sentez. Phosphoramidites uygun bir karışımı olarak vahşi türü nükleotit (bkz: Bu oran daha fazla ayrıntı için temsilcisi sonuçları) doping (X aşağıdaki) her site vahşi tipi nükleotid olarak % 90'a ve T % 10 oranında için kimyasal sentez sırasında kullanın. Not: Katkılı oligonükleotid dizisi 5'-GTTCACTACACTXGAXAXAXAXCAXCXAXAXGXTGCCCTATAGTGAGTCGTATTAC-3 burada '. Altı çizili sıra SXL protein bağlayıcı sitesi, artı faydalı kontroller RNA her değişiklik için yükleme kontrolleri olmasının yanı sıra bağlayıcı etkiler onaylayan sağlamak ek nükleotit bağlama sitesi dışında ters tamamlayıcıdır Karşılaştırma ve normalleştirme nükleotit bağlama site içinde. SXL-bağlama sitesi sıra trafo pre-mRNA14,15,16,17' mevcut olan UUUUUGUUGUUUUUUUU, önerilen metodoloji hazırlamak için kullanıldı. İtalik sırayla T7 astar dizisine tamamlayıcı ve vitro transkripsiyon T7 organizatörü.</li>
</ol>2. RNA sentezi
<ol><li>
Yukarıda açıklanan18olarak 20 µL transkripsiyon tepki RNA sentez.
	<ol>
<li>Mix T7 transkripsiyon tampon ve 1 µM T7 oligonükleotid, 1 µM katkılı oligonükleotid, 10 mM dithiothreitol (DTT), 2 mM GTP, 1 mM ATP, CTP ve UTP (guanozin, adenozin, sitidin ve üridin trifosfat) ve 2 U/µL T7 RNA polimeraz.</li>
		<li>Ekleme, iki ayrı microcentrifuge tüplerde 0,167 mM α-thio ATP veya 0.05 mM α-thio UTP (bkz: Şekil 2' deki şemaları) phosphorothioates RNA'ların dahil etmek. Not: alternatif iletişim kuralları için 0.2 mM α-thio CTP veya 0.2 mM α-thio GTP nükleotit oyuncu değişikliği kalan iki test etmek için bir katkılı oligonükleotid içeren uygun transkripsiyon reaksiyon ekleyin.</li>
		<li>RNA sentezi tepki karışımı 37 ° C'de 2 h için kuluçkaya</li>
	</ol>
</li>
	<li>2.5 µL ısı değişken alkalen fosfataz ve 2.5 µL 10xphosphatase tampon RNA örnek ekleyin. Bu 25 µL reaksiyon 10 – 30 dk 37 ° C'de 5' fosfatlar kaldırmak için kuluçkaya.</li>
	<li>Alkalen fosfataz enzim Isıtma için 2-5 dk 80 ° C'de tarafından devre dışı bırakabilirsiniz.</li>
	<li>5' ucuna dephosphorylated RNA'ın radiolabel (5 pmole) 1 µL T4 polinükleotit kinaz ve 1 µL γ -32P ATP 10 µL tepki birimindeki kullanarak. Reaksiyon karıştırmak için 30-60 dk 37 ° C'de kuluçkaya</li>
	<li>T4 polinükleotit kinaz enzim Isıtma için 20-30 dk 65 ° C'de tarafından devre dışı bırakabilirsiniz.</li>
	<li>Jel Elektroforez % 10 polyacrylamide jel denaturing tarafından RNA arındırmak. RNA üzerinde jel autoradiography tarafından bulun. Radiolabeled RNA içeren jel dilim tüketim, pipet ucu ile duvarlara basarak microcentrifuge tüpte ezmek ve İndinavir K (PK) arabellek (100 mM Tris, pH 7.5, 12,5 mM EDTA, 150 mM NaCl, % 1 Sodyum Lauryl Sülfat) emmek. Gece için 2 h oda sıcaklığında tüp döndürün.</li>
	<li>Jel Bulamaç santrifüj kapasitesi, jel atmak ve arabellek çözüm toplamak.</li>
	<li>Fenol kloroform eşit hacmi ile iki kez ve bir kez kloroform ile çözüm ayıklamak ve sulu faz toplamak.</li>
	<li>Sodyum asetat, pH 5.2, taşıyıcı 3 M sulu faz 0.1 birim eklemek tRNA veya glikojen ve etanol 2.5 hacmi. Örnek 1 h için-80 ° C'de tutun.</li>
	<li>Örnek için bir yüksek hızlı microcentrifuge 16,873 x g, 5-10 dk santrifüj kapasitesi. Arabellek/etanol çözüm RNA Pelet bozmadan dikkatli bir şekilde çıkarın.</li>
	<li>Pelet % 70 etanol ile yıkama ve 2-5 dk. Kaldır etanol için dikkatle santrifüj kapasitesi. Pelet hava kuru.</li>
	<li>Pelet 20 – 50 µL dietil pyrocarbonate (DEPC) resuspend-tedavi su. -20 ° C'de kullanmak kadar saklamak. Not: radyoaktivite korumak için uygun önlemleri ve Pleksiglas kalkan kullanarak radiolabeled RNA ile tüm adımları gerçekleştirin. Halen, spin sütunları jel arıtma RNA'ın alternatif olarak adi radyoaktivite, daha yaygın olarak kullanılan ve kaldırmak daha kolay olur.</li>
</ol>3. protein bağlayıcı tepki ve bağımlı RNA ayrılması
<ol><li>Rekombinant protein hızlı ve E. coliarındırmak.</li>
	<li>Rekombinant protein konsantrasyonu spectrophotometry veya bir SDS-polyacrylamide jel bir bilinen protein standart, Sığır serum albumin (BSA) yanındaki ayıran tahmin ediyoruz. Faiz ve standart BSA proteini jel Coomassie parlak mavi R-250 ile boyama tarafından görselleştirin. İle karşılaştırıldığında BSA dilutions aynı jel üzerinde bilinen miktarda protein quantitate. Not: 0.2 mM Ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA), % 0.05, - 80 ° C kadar kullanım ve 20 mm 4-(2-Hydroxyethyl) seyreltik piperazin-1-ethanesulfonic asit (HEPES), pH 8.0, 1 mM dithiothreitol (DTT), Rekombinant protein depolamak NP-40, % 20 gliserol. Kullanım 0.5-1.0 mM proteaz inhibitörü phenylmethane Sülfanil florür (PMSF) isteğe bağlı.</li>
	<li>RNA-bağlama tepki (20-100 µL) 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 olarak gerçekleştirmek, 1 mM DTT, 50 mM KCl, 0.5 birim/µL RNase inhibitörü, 0.09 µg/µL acetylated Sığır serum albümin, 1 mM EDTA, 0.15 µg/µL tRNA, 5'-son radiolabeled RNA ve uygun konsantrasyon (bir 6 µL konsantrasyon RNA'ın % ~ 50 protein bağlar) protein. Not: Bu bağlayıcı arabelleğe üç RNA – proteinler için çalışır (SXL, U2AF65ve PTB), faiz bir protein için standart olacak ama. Protein konsantrasyonu ampirik olarak, yaklaşık 50 %'si almak için gereken bir verilen protein hazırlık için çeşitli dilutions kullanarak tahmin RNA bağlama. Bu koşul veya Kd RNA-bağlama eğrisi en hassas bölümünü temsil eder.</li>
	<li>20-30 dk 25 ° c (veya buz) protein bağlayıcı tepki kuluçkaya.</li>
	<li>
Protein bağımlı RNA kesir iki yaklaşımdan birini kullanarak ilişkisiz kesir ayırmak:
	<ol>
<li>Nitroselüloz filtre bağlama<ol>
<li>Bağlama reaksiyon (20-100 µL) Oda sıcaklığında bir vakum manifold bağlı nitroselüloz filtre uygula. Not: Sadece RNA-protein kompleksi üzerinde filtre korunur ve RNA akar filtreden ilişkisiz. Filtre bağlama yaklaşım bağımlı RNA'ın yüksek kurtarma sağlar ve jel hareketlilik üst karakter tahlil için daha hızlı ve daha basit, karşılaştırılır. DEAE membran altında nitroselüloz filtre yerleştirerek ilişkisiz RNA kesir toplamak veya ilişkili kesir ile karşılaştırma için RNA ücretsiz mümkündür.</li>
			<li>Tutulan içeren nitroselüloz filtre bölümünü kesip radyoaktif RNA küçük parçalara microcentrifuge tüp içine sığacak şekilde filtre parçaları sokmak için yeterli PK arabellekte (300-500 µL içeren 10-20 µg PK) emmek ve RNA filtresinden elute 2-3 saat veya gece boyunca için.</li>
			<li>Fenol-kloroform ile kloroform, hulâsa ve sulu faz toplamak. Sodyum asetat ve etanol ekleyin ve, dondurucu kuluçka sonra santrifüj kapasitesi, yıkama, Kuru ve RNA DEPC tedavi suda resuspend. Adımda 2.10-2,14 yukarıda ayrıntılı olarak aşağıdaki adımları izleyin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Jel hareketlilik üst karakter<ol>
<li>Hazırlamak ve % 5 yerli polyacrylamide jel polimerize (60:1 Acrylamide:bis-akrilamid) 0.5 içinde filtre bağlama yöntemi alternatif olarak bağlama tepki başlamadan önce x TBE (Standart Tris-bor-EDTA arabellek).</li>
			<li>15dk için jel 250 V (4 ° C) soğuk bir odada önceden çalıştırın.</li>
			<li>Her bağlama reaksiyon (üstte) Yukarıdaki ön çalışma jel ayrı kuyu yükleyin. Not: Örnek yükleme kuyu içine için yeterli gliserol protein depolama arabellek sağlar.</li>
			<li>Jel Elektroforez belirli protein ve RNA boyutu bağlı olarak 1-2 h için 250 V soğuk bir odada tarafından protein bağımlı RNA ayırın.</li>
			<li>Autoradiography tarafından RNA-protein kompleksi jel üzerinde konumunu bulun. RNA-protein kompleksi içeren jel dilim tüketim. Jel dilim kırma ve PK arabellekte nemlendirici jel dilim üzerinden RNA elute.</li>
			<li>Fenol-kloroform ile kloroform, hulâsa ve sulu faz toplamak. Sodyum asetat ve etanol ekleyin ve, dondurucu kuluçka sonra santrifüj kapasitesi, hava kuru, yıkama ve RNA DEPC tedavi suda resuspend. Adımda 2.10-2,14 yukarıda ayrıntılı olarak aşağıdaki adımları izleyin.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. analiz Mutant nükleotit pozisyonlar algılanması için iyot i ciddi Phosphorothioate ürünlerin
<ol><li>1 mM iyot bir 20 µL DEPC tedavi su ilâ 10 µg taşıyıcı içeren eklemek tRNA phosphorothioate birleşme yerlerinde (ilişkili ve toplam RNA'ların) RNA'ların ayırmak için. 5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya. Not: Daha fazla iyot bölünme biraz farklı koşulları ile ilgili ayrıntılar — %7 (v/v) iodoethanol, 95 ° c 3 dk Isıtma — Gish & Eckstein 198819' bulunabilir.</li>
	<li>İ ciddi RNA sodyum asetat/etanol, ekleyerek yukarıda açıklandığı gibi çökelti. Jelleri denaturing için bir yükleme boya resuspend. Isı ve örnek tarafından % 15-20 denaturing polyacrylamide jel elektroforez RNA parçaları ayırmak için yük.</li>
	<li>Polyacrylamide jel bir röntgen filmi için maruz.</li>
	<li>Grup autoradiography kullanma toplam havuz ile ilişkili kesir tespit edebilir. Not: bir yormak kukuleta iyot ile tüm adımları gerçekleştirin. Burada gösterilen RNA ayrılması için bir kama şeklindeki jel, istihdam hangi tarafından iki katına her iki çubukları alt jel plakaların kalınlığı jel alt kısmında bir ekstra inç uzunluğundaki spacer ekleyerek elde edilir. Bu şekli daha kısa RNA parçaları arasında daha fazla tek tip veya daha yakın aralığını sağlar. Alternatif olarak, bir phosphorimager algılama ve radyoaktivite Nefelometri için röntgen filmleri yerine kullanılabilir.</li>
</ol>

<ol><li>Schutt, C., Nothiger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+function+and+evolution+of+sex-determining+systems+in+Dipteran+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Structure, function and evolution of sex-determining systems in Dipteran insects.</a> Development. 127 (4), 667-677 (2000).</li>
<li>Mahowald, A. P., Wei, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+determination+of+germ+cells+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Ciba+Found.+Symp%22%5BJournal%5D)">Sex determination of germ cells in Drosophila.</a> Ciba Found. Symp. 182, 193-202 (1994).</li>
<li>Steinmann-Zwicky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+germ+cells+choose+their+sex%3F+Drosophila+as+a+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">How do germ cells choose their sex? Drosophila as a paradigm.</a> Bioessays. 14 (8), 513-518 (1992).</li>
<li>Salz, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex%2C+stem+cells+and+tumors+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Fly+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">Sex, stem cells and tumors in the Drosophila ovary.</a> Fly (Austin). 7 (1), 3-7 (2013).</li>
<li>Gawande, B., Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Sex-lethal+protein+mediates+polyadenylation+switching+in+the+female+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Drosophila Sex-lethal protein mediates polyadenylation switching in the female germline.</a> Embo J. 25 (6), 1263-1272 (2006).</li>
<li>Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+alternatively+spliced+mRNA+targets+of+specific+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of alternatively spliced mRNA targets of specific RNA-binding proteins.</a> PLoS One. 2 (6), e520(2007).</li>
<li>Samuels, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+binding+by+Sxl+proteins+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA binding by Sxl proteins in vitro and in vivo.</a> Mol. Cell. Biol. 14 (7), 4975-4990 (1994).</li>
<li>Fujii, S., Amrein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+expressed+in+the+Drosophila+head+reveal+a+role+for+fat+cells+in+sex-specific+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Genes expressed in the Drosophila head reveal a role for fat cells in sex-specific physiology.</a> EMBO J. 21 (20), 5353-5363 (2002).</li>
<li>Kelley, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+msl-2+causes+assembly+of+dosage+compensation+regulators+on+the+X+chromosomes+and+female+lethality+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression of msl-2 causes assembly of dosage compensation regulators on the X chromosomes and female lethality in Drosophila.</a> Cell. 81 (6), 867-877 (1995).</li>
<li>Hager, J., Cline, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+female+Sex-lethal+RNA+splicing+in+male+germ+cells%3A+implications+for+Drosophila+germline+sex+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Induction of female Sex-lethal RNA splicing in male germ cells: implications for Drosophila germline sex determination.</a> Development. 124 (24), 5033-5048 (1997).</li>
<li>Vied, C., Halachmi, N., Salzberg, A., Horabin, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antizyme+is+a+target+of+sex-lethal+in+the+Drosophila+germline+and+appears+to+act+downstream+of+hedgehog+to+regulate+sex-lethal+and+cyclin+B%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Antizyme is a target of sex-lethal in the Drosophila germline and appears to act downstream of hedgehog to regulate sex-lethal and cyclin B.</a> Dev Biol. 253 (2), 214-229 (2003).</li>
<li>Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-lethal+facilitates+the+transition+from+germline+stem+cell+to+committed+daughter+cell+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Sex-lethal facilitates the transition from germline stem cell to committed daughter cell in the Drosophila ovary.</a> Genetics. 182 (1), 121-132 (2009).</li>
<li>Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-lethal+enables+germline+stem+cell+differentiation+by+down-regulating+Nanos+protein+levels+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Sex-lethal enables germline stem cell differentiation by down-regulating Nanos protein levels during Drosophila oogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (24), 9465-9470 (2012).</li>
<li>Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+binding+specificities+and+functions+of+higher+eukaryotic+polypyrimidine+tract-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins.</a> Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).</li>
<li>Singh, R., Banerjee, H., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+recognition+of+the+polypyrimidine-tract+by+the+general+splicing+factor+U2AF65+and+the+splicing+repressor+sex-lethal%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Differential recognition of the polypyrimidine-tract by the general splicing factor U2AF65 and the splicing repressor sex-lethal.</a> RNA. 6 (6), 901-911 (2000).</li>
<li>Sakashita, E., Sakamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+RNA+binding+specificity+of+the+Drosophila+sex-+lethal+protein+by+in+vitro+ligand+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of RNA binding specificity of the Drosophila sex- lethal protein by in vitro ligand selection.</a> Nucleic Acids Res. 22 (20), 4082-4086 (1994).</li>
<li>Kanaar, R., Lee, A. L., Rudner, D. Z., Wemmer, D. E., Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+the+sex-lethal+RNA+binding+domains+with+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Interaction of the sex-lethal RNA binding domains with RNA.</a> EMBO J. 14 (18), 4530-4539 (1995).</li>
<li>Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+small+RNAs+using+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase.</a> Methods Enzymol. 180, 51-62 (1989).</li>
<li>Gish, G., Eckstein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+and+RNA+sequence+determination+based+on+phosphorothioate+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">DNA and RNA sequence determination based on phosphorothioate chemistry.</a> Science. 240 (4858), 1520-1522 (1988).</li>
</ol>

Yazar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirir.

Mutagenesis uzun protein bağlayıcı siteleri niteleyen kullanılmaya başlanmıştır. İlk olarak, mutantlar bir dizi inşa ve deneyleri benzeşme bağlama üzerinde onların etkilerini incelemek için bağlama içinde tek tek test. Ise standart mutagenesis yaklaşım çeşitli serileri analiz etmek için bir yol sağlar, birden çok adımı mutantlar oluşturmak ve tepkiler her mutant için bağlayıcı bir dizi performans gibi standart yaklaşım, dahil, zahmetli ve zaman alıcı ve olmayabilir özellikle uzun serileri için Doygunluk mutagenesis izin ...

Gen düzenlemesi, biyolojide önemli bir rol oynar. Genlerin transkripsiyon, pre-mRNA'ın porno versiyonunu, 3' uç oluşumu, RNA verme, çeviri, mRNA yerelleştirme, çürüme, translasyonel modifikasyon/istikrar, vb her iki DNA ve RNA bağlayıcı proteinler gen anahtar rol oynarlar düzeyinde düzenlenmiş olması Yönetmelik. Moleküler Genetik analizlerle çok sayıda düzenleyici proteinler belirledik iken, yalnızca küçük bir alt kümesini ile karakterize tamamen hücresel işlevlerinin veya bağlama siteleri içinde vivoiçin. Filogenetik dizi analizi ve mutagenesis DNA veya RNA protein etkileşimleri niteleyen tamamlayıcı yaklaşımlar sunuyor.
RNA bağlanıcı proteinler cinsel farklılaşma da dahil olmak üzere gelişim süreçlerinde önemli. Drosophila protein seks-öldürücü (SXL) veya ana seks-anahtar protein yoktur erkek, ama şimdiki içinde dişi. Uridine zengini diziler veya pirimidin-yolları aşağı akım pre-mRNA hedefler (trafo, seks öldürücüve erkek özgü lethal2) somatik hücreler1,2'deki belirli splice sitelere bitişik tanır ,3,4. Buna ek olarak, uridine zengini Poliadenilasyon artırıcı dizileri artırıcı, ilkel (e(r)) transkript5,6bağlama yaparak geçiş Poliadenilasyon sitesi düzenler. SXL büyük olasılıkla olmak üzere kalan kadın germline ek hedefleri düzenleyen1,7,8,9,10,11, tespit 12 , 13.
Genellikle, bir bağlama sitesini karakterizasyonu mutagenesis, örneğin, silme veya değiştirme tek veya birden çok nükleotit tarafından içerir. Her mutant bağlama siteye göre yaban tipi RNA dizisinin sonra onun bağlama benzeşme belirlemek için bir dizi protein konsantrasyonları kullanılarak analiz (Kd veya denge ayrılma Sabit) protein ilgi; Kd protein konsantrasyonu % 50 RNA bağlama almak için gerekli olduğunu. Detaylı mutagenesis Bu emek yoğun işlem üretimi ve çok sayıda mutantlar analizini içerir — üç vahşi türü nükleotit bağlama sitedeki her pozisyon için. Böylece, daha basit ve ucuz doygunluk mutagenesis protein bağlayıcı sitelerin RNA için alternatif bir yaklaşım için bir ihtiyaç vardır.
Burada, doygunluk mutagenesis RNA bir protein bağlayıcı sitesinin sağlar bir tek adımlı yaklaşım tarif. Bu DNA şablon bağlama site, her phosphorothioate nükleotit ile ayrı RNA'ların sentezi ve yalıtım kuluçka protein ile takip ilişkili fraksiyonunun içinde vahşi tipi nükleotit ile doping içerir. Vahşi tipi nükleotit müdahalelerden protein bağlı kesir Tercihli onların hariç sonuçlanır. Bu jel elektroforez ile iyot fosfodiester tahvil phosphorothioates (phosphorothioate mutagenesis veya PTM) içeren seçmeli kimyasal bölünme takip tarafından izlenir. Bu tek adım doygunluk mutagenesis yaklaşım herhangi bir protein bağlayıcı sitedeki RNA karakterizasyonu için geçerlidir.

<table><tbody><tr><td>Üridin 5' a-tiyotrifosfat</td><td>NEN (Boston, Massachusetts)</td><td>NLP-017</td><td></td></tr><tr><td>Adenozin 5' a-tiyotrifosfat</td><td>NEN (Boston, Massachusetts)</td><td>NLP-016</td><td></td></tr><tr><td>Vakum manifoldu</td><td>Fisher Scientific</td><td>XX1002500</td><td>Millipore&nbsp; 25&nbşk; mm Cam Mikroanaliz Vakum Filtresi</td></tr><tr><td>Vakum manifoldu</td><td>Millipore</td><td>XX2702552</td><td>1225 Örnekleme Vakum Manifoldu</td></tr><tr><td>Nitroselüloz</td><td>Millipore</td><td>HAWP</td><td></td></tr><tr><td>Nitroselüloz</td><td>Schleicher & Schuell</td><td>PROTRAN</td><td></td></tr><tr><td>Fosforliyasyon Kiti</td><td>NEB</td><td>M0508</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polinükleotid Kinaz</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>NEB</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA polimeraz</td><td>NEB</td><td>M0251S</td><td></td></tr><tr><td>RNasin</td><td>Promega</td><td></td><td>RNaz inhibitörü</td></tr><tr><td>Cam Plakalar</td><td>Standart</td><td>Standart</td><td></td></tr><tr><td>Jel Elektroforez ekipmanı</td><td>Standart</td><td>Standart X-ışını</td><td></td></tr><tr><td>filmleri</td><td>Standart</td><td>Standart Poliakrilamid</td><td></td></tr><tr><td>jel çözümleri</td><td>Standart</td><td>Standart</td><td></td></tr></tbody></table>

bir roman doygunluk mutagenesis yaklaşım: tek adım karakterizasyonu düzenleyici protein rna phosphorothioates kullanarak siteleri bağlama

A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates

Gen düzenlemesi gelişiminde önemli bir rol oynar. Çok sayıda DNA ve RNA bağlayıcı proteinler onların hedef sıraları gen ekspresyonu denetlemek için yüksek özgüllük ile bağlayın. Bu düzenleyici proteinler gen ekspresyonu ya DNA (transkripsiyon) düzeyinde veya RNA (pre-mRNA'ın porno versiyonunu, Poliadenilasyon, mRNA taşıma, çürüme ve çeviri) düzeyini kontrol eder. Düzenleyici diziler tanımlaması sadece açık veya kapalı bir gen nasıl açık, ama hangi aşağı akım genler tarafından belirli bir düzenleyici protein Ayrıca düzenlenir anlamanıza yardımcı olur. Burada, doygunluk mutagenesis RNA bir protein bağlayıcı sitesinin sağlar bir tek adımlı yaklaşım tarif. Bu DNA şablon bağlama site, her phosphorothioate nükleotit ile ayrı RNA'ların sentezi ve yalıtım kuluçka protein ile takip ilişkili fraksiyonunun içinde vahşi tipi nükleotit ile doping içerir. Vahşi tipi nükleotit müdahalelerden protein bağlı kesir Tercihli onların hariç sonuçlanır. Bu jel elektroforez ile iyot fosfodiester tahvil phosphorothioates (phosphorothioate mutagenesis veya PTM) içeren seçmeli kimyasal bölünme takip tarafından izlenir. Bu tek adım doygunluk mutagenesis yaklaşım herhangi bir protein bağlayıcı sitedeki RNA karakterizasyonu için geçerlidir.

Doping kullanarak doygunluk mutagenesis prensibi:
Eğer sadece analiz edilecek bir konumdur bir uygun molar oranı vahşi-türü ve diğer nükleotit için tüm dört nükleotit eşit bir karışımı kullanın. Ancak, aynı anda birden fazla pozisyonları incelenir, oranı, non-vahşi türü yaban tipi nükleotit için ayarlanması gerekir, azaltılmış yani . Aksi takdirde, hangi isteniyorsa, tek oyuncu değişikliği ek olarak, ayrıca olacak şablonla...

Belirli RNA dizilere protein gen ekspresyonu önemli rol oynarlar. Bu bağlama sitelerin detaylı karakterizasyonu gen düzenlemesi bizim anlamak için önemlidir. Burada, bir tek adım yaklaşım doygunluk mutagenesis RNA protein bağlayıcı sitelerin için kullanılmıştır. Bu yaklaşım RNA içinde tüm protein bağlayıcı siteleri için geçerlidir.

Bir roman doygunluk Mutagenesis yaklaşım: Tek adım karakterizasyonu düzenleyici protein RNA Phosphorothioates kullanarak siteleri bağlama

Gene regulation plays an important role in development. Numerous DNA- and RNA-binding proteins bind their target sequences with high specificity to ...

RNA'daki bu fosforotiyoat yaklaşımının genel amacı, doygunluk mutajenezini tek bir adımda gerçekleştirmektir. Bu yöntem, gen regülasyonu gibi moleküler biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel yararı, tek bir adımda, RNA'daki bir protein bağlanma bölgesinin doygunluk mutajenezinin gerçekleştirilebilmesidir.Bu tek aşamalı doygunluk mutajenez protokolündeki önemli bir adım, DNA şablonunu protein bağlama bölgesi içinde vahşi olmayan tip nükleotidlerle doping etmektir. İlk olarak, bir DNA sentezleyici üzerinde kimyasal sentez yoluyla bir T7 primerini sentezleyin. Daha sonra, protein bağlanma bölgesine karşılık gelen katkılı bir oligonükleotid sentezleyin.Bu örnekte, altı çizili dizi, drosophilas cinsiyet-öldürücü protein bağlanma bölgesinin ters tamamlayıcısını içerir ve her doping bölgesi bir X ile temsil edilir. Her doping bölgesi için %90 vahşi tip nükleotid ile %10 vahşi olmayan tip nükleotid oranını kullanın. Yeşil renkli dizi, T7 primer dizisini tamamlayıcı niteliktedir ve in vitro transkripsiyon için T7 promotörüdür. Bu protokoldeki bir sonraki adım, her fosforotiyoat nükleotidi ile ayrı RNA'ların sentezi ve ardından RNA'nın 5 asal

a-novel-saturation-mutagenesis-approach-single-step-characterization

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Pre-mRNA geçici doğası nedeniyle, izole etmek ve incelemek için zor...

İnsan pre-mRNA üzerinde Haritalama Ribonucleoproteins Hızlı Yüksek verim için Yöntemi (RNPs)

RNA transkript trans etkili RNA bağlayıcı proteinler (RBPs) çok sayıda aracılığı ile geniş posttranskripsiyonel düzenlemeye tabidir. Burada hassas ve transcriptome geniş bir ölçekte RBPs, RNA bağlayıcı siteleri tanımlamak için genellenememektedir bir yöntem mevcut.

PAR-Klip - RNA Cilt Proteinler Transcriptome geniş Cilt Siteleri Belirlemek Amacıyla Bir Yöntem

Biz yüksek verimli sıralama kullanan proteinlerin kapsamlı tek site doyma mutagenezi kütüphanelerinin fonksiyonel değerlendirme için bir protokol mevcut. Daha da önemlisi, bu yaklaşım kütüphane inşaatı ve sıralama multipleks dik primer çiftleri kullanır. ampisilin klinik olarak anlamlı bir doz için seçilen TEM-1 β-laktamaz kullanılarak Örnek sonuçlar verilmiştir.

Yüksek verimlilik sıralaması kullanılması Tüm-Protein Doygunluk Mutagenez Kütüphaneleri Fonksiyonel Değerlendirme Protokolü

RNA-protein etkileşimleri birçok hücresel sürecin merkezinde yer alır. Burada, spesifik RNA'yı izole etmek ve onunla ilişkili yeni proteinleri tanımlamak için in vivo bir yöntemi açıklıyoruz. Bu, RNA'ların hücrede nasıl düzenlendiğine yeni bir ışık tutabilir.

Rapid Metodoloji tarafından Roman RNA Bağlayıcı Proteinler İzolasyon

Peptid rekabet testleri, çeşitli moleküler ve immünolojik deneylerde yaygın olarak kullanılır. Bu makale , in vitro oligopeptitle rekabet eden kinaz testi için ayrıntılı bir yöntem ve ilgili fosforilasyon sitelerini bulmak için yararlı olabilen ilişkili validasyon prosedürlerini açıklamaktadır.

Fosforilasyon Saha Tespiti İçin Oligopeptide Rekabet Testi

Ribonucleotides genom ökaryotik nükleer DNA ikileşmesi sırasında dahil en bol kanonik olmayan nükleotit arasındadır. Düzgün kaldırdıysanız, ribonucleotides DNA hasarı ve mutagenesis neden olabilir. Burada, ribonucleotide birleşme DNA ve mutajenik etkileri içine bolluk değerlendirmek için kullanılan iki deneysel yaklaşımlar mevcut.

Eğitim Ribonucleotide ortaklık: Strand-özel hafiye-in Ribonucleotides Maya genom ve Ribonucleotide kaynaklı Mutagenesis ölçme

Mutagenesis site yönettiği belirli mutasyonların Deoksiribonükleik asit (DNA) tanıtmak için kullanılan bir tekniktir. Bu iletişim kuralı site yönettiği mutagenesis ile 2 adım nasıl açıklar ve ilgi herhangi bir DNA parçası geçerlidir yaklaşım 3 adımlı polimeraz zincir tepkimesi (PCR) dayalı.

Site yönettiği Mutagenesis in Vitro ve Escherichia Coli etkileşimlerde RNA ile örneği Vivo deneyler için

Bu yöntemle, RNA bağlayıcı proteinlerin (RBPs) bağlayıcı benzeşimini, bakteriyel hücrelerde basit, canlı ve muhabir bir tahlil kullanarak bilat ve bileksiz bağlayıcı sitelere göre ölçeceğiz. Tahlil bir muhabir geni baskının dayanmaktadır.

Bakterilerde protein RNA bağlayıcı ölçümü için bir tahlil

Dizi özgüllüğü gen regülasyonu için çok önemlidir. Belirli dizileri tanıyan düzenleyici proteinler gen regülasyonu için önemlidir. Bu tür proteinler için fonksiyonel bağlama alanlarının tanımlanması zorlu bir biyolojik sorundur. RNA bağlayıcı protein için bağlayıcı bir alanın tanımlanması için yinelemeli bir yaklaşım burada açıklanmıştır ve tüm RNA bağlayıcı proteinler için geçerlidir.

Düzenleyici RNA Bağlayıcı Proteinler için Bağlayıcı Siteleri Belirlemek için Sıra Alanını Keşfetmek

Bu protokol, küçük DNA ve RNA yüzeyleri üzerinde polinükleotid kinazların (PNKs) kinaz aktivitesini ölçmek için radyoaktif olmayan bir testi tanımlar.

Küçük Nükleotit Substratlarının Polinükleotid Fosforilasyonunun Ölçülmesini Radyoaktif Olmayan Tsay

Protokol, mutasyonel profilleme deneyleri için RNA'nın dimetil sülfat ile modifiye edilmesi için talimat sağlar. İki alternatif kütüphane hazırlama yöntemi ile in vitro ve in vivo problama içerir.

RNA Yapısının Dimetil Sülfat Mutasyonel Profillemesi ile İn Vitro ve İn Hücre Dizilimi ile İncelenmesi

Öğrenin RNA'daki protein bağlama bölgelerinde tek adımda doygunluk mutagenezisi yapmayı. Bu fosforotioat yöntemi, gen regülasyonu mekanizmalarını anlamak için verimli bir araç sunar.

Bir roman doygunluk Mutagenesis yaklaşım: Tek adım karakterizasyonu düzenleyici protein RNA Phosphorothioates kullanarak siteleri bağlama (Video) | JoVE Journal

Bir roman doygunluk Mutagenesis yaklaşım: Tek adım karakterizasyonu düzenleyici protein RNA Phosphorothioates kullanarak siteleri bağlama

Daha fazla video keşfet