Yineleme kümesi yöntemi: Bir yüksek-den geçerek yaklaşım kantitatif ölçü Caenorhabditis elegans ömrü

İşlevi bir organizmanın yaşlanmasını etkileyen yüzlerce gen tanımlanmıştır. Ancak ilişkilerinin çoğu tam olarak anlaşılmamıştır. Bu yöntem, yaşlanma alanındaki önemli bir soruyu yanıtlamaya yardımcı olabilir.

Yani, gerA genleri arasındaki genetik ilişkiler nelerdir? Bu tekniğin temel avantajı, verimde bir artıştır, aynı anda kantitatif olarak ölçülebilen genetik predebasyonların sayısı en azından bir büyüklük sırasına göre artar. Bu prosedürle toplanan kullanım ömrü verileri, bu yayınla birlikte sağladığımız yazılım kullanılarak çizilebilir ve analiz edilebilir.

Bu yöntem, yaşam süresi hakkında bilgi vermenin yanı sıra, stres direnci ve sağlık planındaki değişiklikler gibi yaşa bağlı diğer fenotiplere de uygulanabilir. Bu prosedür için, RNAi alt kitaplığının yeni bir damgasını oluşturun. İlk olarak, 12 kanallı bir pipetleyici kullanarak, ampisilinli 200 mikrolitre LB ile 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğundan alikot edin.

96 pimli bir plaka çoğaltıcıyı, pimleri sırayla %50 ağartıcıya ve ardından ultra saf suya batırarak sterilize edin. Sonra uçları etanole batırın ve uçları dikkatlice alevlendirin. Daha sonra, dondurulmuş, 96 oyuklu bir gliserol stok kütüphane plakasının yapışkan folyo kapağını dikkatlice çıkarın ve sterilize edilmiş plaka çoğaltıcısının uçlarını hala donmuş gliserol stoklarının kuyularına nazikçe ama sıkıca öğütün.

Daha sonra kültürleri aşılayın ve aşılanmış plakayı geçirgen zar ile kapatın. Kültürlerin tezgah üstünde bir gecede büyümesine izin verin. Ertesi gün, plaka çoğaltıcıyı sterilize edin ve contayı gece boyunca kültürden dikkatlice çıkarın ve çoğaltıcı pimlerin uçlarını daldırın.

Daha sonra, dikdörtgen bir LB ampisilin ve tetrasiklin agar plakasını pimlerle aşılayın. Eşit basınç uygulayın ve lekelerin çok kalabalıklaşmasına izin vermeden bakterileri aktarmak için küçük, dairesel bir hareket kullanın. Ardından, plakaları gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Ertesi gün, ihtiyaç duyulan her 10 kopya plaka için, derin kuyulu 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna ampisilin içeren 1,5 mililitre LB yükleyin. Daha sonra, kuyucukları kültürlenmiş bakterilerle aşılayın. Ardından, plakayı nefes alabilen bir zarla kapatın, çalkalayarak 20 saat boyunca kültürleyin.

Kontrol kuyuları 96 kuyuya dağıtılmalıdır, öyle ki 96 kuyulu alt kütüphane plakası 24'lü gruplara ayrıldığında, 24 kuyunun her biri kontrollerin her birinden bir tane içerir. Ertesi gün, kültürün 120 mikrolitrelik alikotunu, ayarlanabilir uç aralığına sahip altı oyuklu çok kanallı bir pipet kullanarak 24 oyuklu plakalara yükleyin. Ardından, tüm sıvı emilene kadar laminer bir akış başlığında üstü açık plakaları kurutun.

Fazla kurumasına izin vermeyin. Uygun bakteri kültürünün 24 oyuklu plakadaki uygun kuyucuğa konduğundan emin olmak için sıvı kültürleri ayırırken odağınızı koruduğunuzdan emin olun. Replika seti deneyleri, her biri aynı bakteri RNAi klonları ile tohumlanmış bağımsız, 24 oyuklu replikasyon plakaları seti ile başlar.

Yaşam boyu deneyler için, her bir plaka kuyusuna 15 ila 20 L1 hayvanı eklenir ve L4 aşamasına kadar büyümesine izin verilir. L4'te, FUdR, kopyalar arasındaki tüm kuyucuklara eklenir. Aynı günün ilerleyen saatlerinde, setten bir replika plaka alınabilir ve ilk zaman noktası olarak puanlanabilir.

Kullanım ömrünü uzatmak için, hayvan hareketini indüklemek için plakanın kuyucuklarına sıvı eklenir. Hareket etmeye başlamayan hayvanlar bir solucan penası ile nazikçe dürtülür. Toplam hayvan sayısı ve ölü hayvan sayısı daha sonra kaydedilir.

İlk gözlemden elde edilen plaka daha sonra atılır. Bir sonraki gözlem zaman noktasında, setten başka bir replika plaka alınır ve benzer şekilde puanlanır. Bu, belirlenen puanlama aralığında tekrarlanır.

Her seferinde replika setinden yeni bir plaka ile. Hiçbir hayvan hayatta kalmayana kadar bir dizi plaka puanlamaya devam edin. İlk olarak, bir hayvan popülasyonunu, geleneksel yaşam süresi tahlili için kullanılan aynı ağartıcı bazlı hazırlama yöntemiyle senkronize edin.

Daha sonra, altı oyuklu ayarlanabilir aralıklı bir pipet ve reaktif rezervuarı kullanarak, hazırlanan 24 oyuklu plakaların her bir oyuğuna 15 ila 20 L1 hayvanı tohumlayın. Plakaları tohumlarken, eşit dağılımı korumak için L1 hayvanlarını periyodik olarak çözelti içine karıştırın. Şimdi, hayvanların L4'e gelişmesine izin verin. Bu protokol için L4 geliştirmenin zamanlaması bilinmelidir.

Solucanların gelişimini periyodik olarak izleyin. Hayvanlar L4'e ulaştığında, her oyuğa 24 mikrolitre 50x FUdR ekleyin ve plakaları kuluçka makinesine geri koyun. L4 hayvanlarının kullanılması çok önemlidir.

Hermafroditler FUdR eklemeden önce üreme olgunluğuna ulaşırsa, dölleri hayatta kalacak ve yiyeceği yiyecektir. Tersine, FUdR'yi çok erken eklemek, hayvanların yırtılmasına neden olur. İstenilen zaman noktalarında, canlılığı elde etmek için bir çoğaltma plakası kullanın.

Bunu yapmak için, kuyuyu M9 çözeltisi ile doldurun. Her gün canlılığı puanlamadan önce, yiyecek içermeyen, kontamine görünen veya morfolojik veya gelişimsel kusurları olan hayvanların bulunduğu kuyuları kontrol edin. Her kuyu için, kuyu başına toplam hayvanları kaydedin ve hareket etmeyen solucanların durumunu, her birine bir solucan kazması ile hafifçe dokunarak kontrol edin.

Bir plakadaki tüm hareket etmeyen ölüleri saydıktan sonra plakayı atın. Bu prosedür için, dönüşmüş e. Ampisilin ile LB'de bir gecede koli.

Ertesi gün, bakterileri 15 ila 20 dakika boyunca 3.000 G'de santrifüjleme ile konsantre edin. Bakterileri başlangıç hacminin 1 / 10'unda yeniden süspanse edin. Daha sonra, 10x bakterinin 200 mikrolitresini altı santimetrelik plakalara ayırın.

Test koşulu başına üç veya dört plaka hazırlayın ve kontaminasyon durumunda iki ekstra plaka ekleyin. Plakaları, tüm sıvı emilene veya buharlaşana kadar laminer akışlı bir partide kurutun. Kuruduktan sonra, çift sarmallı RNA üretimini indüklemek için plakaları gece boyunca oda sıcaklığında plastik bir kutuda saklayın.

Ardından, plakaları dört santigrat derecede iki haftaya kadar saklayın. Hayvanlar için, M9'da ağır, yetişkin hayvanları toplayın. M9 ile iki kez yıkayın. Aspirasyonda dönüşü tekrarlamak. Daha sonra, C.elegans'ı dört mililitre M9 içinde yeniden süspanse edin ve iki mililitre hipoklorit çözeltisi ekleyin.

Şimdi, solucanları periyodik, kuvvetli bir şekilde çalkalayarak hemen üç dakika boyunca girdaplayın. Ardından, diseksiyon mikroskobu altında bir yumurta bulutu arayın. Bulut görünmüyorsa, solucanları 10 ila 20 saniye daha girdap haline getirin.

Daha sonra, yumurtaları daha önce olduğu gibi iki kez M9 ile hızlıca yıkayın. Ve yıkanmış yumurtaları üç mililitre M9'da tekrar askıya alın. Daha sonra, yumurtaları 15 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve tüpü hafif bir rotasyonla 20 santigrat derecede inkübe edin ve embriyoların gece boyunca çatlamasına izin verin. Ertesi gün, hazırlanan L1 çözeltisinin yoğunluğunu, mikrolitre başına ortalama L1 sayısını üç, 10 mikrolitrelik damlalar halinde hesaplayarak belirleyin.

Hazırlanan bakteri tohumlu plakaları her biri 50 L1 hayvanla doldurun. Embriyolar L4 aşamasına gelene kadar plakaları 20 derecelik bir Celsuis inkübatöre yerleştirin. L1'den L4'e normal gelişim yaklaşık 40 saat sürer.

Ardından, döl üretimini önlemek için her plakaya 160 mikrolitre 50x FUdR ekleyin. Daha sonra erkekleri çıkarın, çünkü yaşam süresi tipik olarak sadece hermafroditlerle ölçülür. Tamamlandığında, plakaları 20 derecelik Celsuis inkübatöre yeniden paketleyin.

Tüm solucanlar ölene kadar, yaşayabilirliklerini günlük olarak puanlayın. Bunu yapmak için, kafadaki hareket etmeyen her nematod'a bir platin tel veya kirpik ile hafifçe dokunun. Reaktif olmayan hayvanlar ölüdür ve plakadan çıkarılmalıdır.

Bu rutin sırasında herhangi bir anormallik olup olmadığını not edin. C.elegans ömrünü test etmek için replika seti ve geleneksel yöntemler, vahşi tip N2 hayvanlarıyla benzer sonuçlar verir. Örneğin, mml-1 veya mxl-2'nin beslenmeye dayalı RNAi yıkımı, normal yaşam sürelerini önemli ölçüde azalttı.

Bu, hem geleneksel bir yaşam süresi testi hem de replika set testi ile ölçüldü. Uzun ömür de tespit edilebilir. Burada görüldüğü gibi, mdl-1 veya mxl-1 için RNAi, her iki metodoloji ile ölçüldüğünde C.Elegans'ın ömrünü önemli ölçüde artırdı.

Çoğaltma kümesi yöntemini kullanarak, daha geleneksel bir yaklaşımla makul olmayacak olan 100'den fazla koşulda yaşam sürelerindeki değişiklikleri aynı anda ölçmek mümkündür. Örneğin, genom çapında beslenmeye dayalı bir RNAi taraması, daf-2 insülin benzeri sinyallemenin azalmasıyla sağlanan artan yaşam süresi için gerekli olan 159 geni tanımladı. İnsülin benzeri sinyalleme ile bu genler arasındaki ilişki, hayvanların sağlık süresinin ölçülmesiyle daha da açıklandı.

Sağlık, c. Elegans'ın çözelti içinde süspanse edildiğinde dövülmesi ile belirtildi. Bu videoyu izledikten sonra, C.Elegans'ın ömrünü ölçmek için beslenme tabanlı RNAi'nin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.

Ancak RNAi çok yönlüdür ve birçok farklı fenotip için uygulanabilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, replika seti yöntemi, uygun şekilde gerçekleştirilirse, her gün 100'den fazla RNAi klonu için ömrün değerlendirilmesine izin verir. Erken ve geç zaman puanları hızlı bir şekilde puanlanabilir.

Bir kuyudaki tüm hayvanlar ya canlı ve hareket ediyor ya da ölü olacak. Hayvanlar ölmeye başladığında puanlama en uzun sürer. Bunu göz önünde bulundurarak bağımsız denemelerin kurulumunu kademelendirin.