Deniz bir Model - olarak Barnacle Balanus improvisus kültür ve gen ekspresyonu

Kültür tesisi, larva ekolojisi, biyolojik kirlenme ve evrimsel biyoloji ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Daha spesifik olarak, larva yerleşimi sırasında reseptör-ligand etkileşimleri, yeni zehirli boya teknolojilerinin geliştirilmesi ve osmoregülasyonda yer alan genlerin evrimi ve işlevi üzerine yapılan çalışmalarda kullanılabilir. Bu model organizmanın temel avantajı, midye Balanus doğaçlamasının sağlam olması, tüm yıl boyunca çoğalması ve nispeten kısa bir üretim süresine sahip olmasıdır.

Bu yöntem, midyelerin kültürlenmesi hakkında fikir verebilse de, diğer deniz organizmalarının kültürlenmesine de uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, iyi deniz suyu temini, yüksek kaliteli yemlerin sağlam üretimi ve kültürlerin temizlenmesi ve beslenmesine sürekli katılım gibi başarı için önemli olan çok sayıda ayrıntı nedeniyle mücadele edeceklerdir. Prosedürü gösteren, midyelerle çalışan teknisyen ve araştırmacı Martin Ogemark ve Anna-Lisa Wrange olacak.

Başlamak için, birkaç şeffaf termoplastik paneli tutabilen çerçeveler ayarlayın. Her panelin üst köşelerine iki delik açın ve panelleri çerçevelere bağlamak için kablo bağları kullanın. Yetişkin midyeleri toplamak için, panelleri sakin sularda bir ila üç metre derinlikte dikey olarak yerleştirin.

Midyelerin yerleşmesine ve beş milimetre çapa kadar büyümesine izin verdikten sonra, panelleri laboratuvara getirin. Ardından panelleri bir polietilen tepside frezelenmiş olukları olan bir standa dikey olarak yerleştirin. İlk olarak, toksik olmayan, suya dayanıklı bant kullanarak, üstte açık bir küp oluşturmak için beş paneli birbirine bantlayın.

Küpü küçük bir tepsiye koyun ve deniz suyu ile doldurun. Ardından, küpün üstüne yaklaşık 200 cyprid ekleyin. Her gün, yavru midyeleri 100 mililitre Skeletonema marinoi ile besleyin.

İki ila üç hafta sonra, küpün panelleri en az beş milimetre çapında yerleşik yavrular içermelidir. Küpü ayırın ve panelleri akan deniz suyu ile tepsilere taşıyın. Artemia nauplii'yi hasat etmek için önce havalandırma pompasını kapatın ve şişeyi karartın, ardından şişenin alt kısmını 10 dakika aydınlatın.

Yumurtadan çıkan Artemia nauplii ışığa doğru yüzecek. Yumurtadan çıkmamış kistler dibe çökerken, kist kabukları üste doğru yüzer. Alttaki kelepçeyi açın ve ara fraksiyonu yüzme Artemia nauplii'nin yoğun bir popülasyonu olarak toplayın.

Panelleri yetişkin midyelerle temizlemek için, üzerlerine hafifçe tatlı su püskürtün ve yumuşak bir diş fırçasıyla kirlenmeyi giderin. Tepsileri midyesiz ve tüpleri sıcak tatlı su ile temizleyin. Ardından, taşma portu olan polietilen tepsiye bir elek yerleştirin.

Gece boyunca elek içine yerleşen midye larvalarını toplayın. Daha sonra, mililitre başına 50.000 diatomluk bir yoğunluk oluşturmak için bir kovayı 20 litre filtrelenmiş deniz suyu ve bir litre diatom mikroalg karışımı ile doldurun. Önceden toplanan midye nauplii'yi kristalize bir kaba aktarın ve tabağı yandan aydınlatın.

Daha sonra ışığa doğru yüzen nauplii'leri toplamak için bir pipet kullanın ve onları başka bir tabağa aktarın. Nauplii'yi saymak için bir litre filtrelenmiş deniz suyu içeren bir behere aktarın. Daha sonra, önceden hazırlanmış kovaya bir litre nauplii ekleyin.

Üç gün sonra, midye nauplii'yi toplamak için 90 mikrometrelik bir elek kullanın, ardından kovayı temizleyin, filtrelenmiş deniz suyuyla doldurun ve yeni diatom beslemesi ve midye nauplii ekleyin. İki ila üç gün daha kuluçka döneminden sonra, erimemiş midye nauplii'yi Kıbrıslılardan ayırmak için 160 mikrometrelik bir eleğin üzerine 320 mikrometrelik bir elek kullanın. Mikroalg kültürü için dört adet dört litrelik şişe kurduktan sonra, şişeleri metrekare başına 50 ila 100 mikromol yoğunlukta ışığa yerleştirin.

Kültürleri, beslenmek için kullanılacak kadar yoğun olduklarında hasat edin. İlk olarak, büyük bireyleri seçin ve diseksiyondan iki gün önce yiyecekleri durdurun. Ardından, midye kabuğunu bir diş fırçasıyla temizleyin ve çevrede bulunan diğer türlerden kaynaklanan kontaminasyonu en aza indirmek için suyla durulayın.

Diseksiyon için düz bir yüzeye tek bir midye yerleştirin, ardından bir çift forsepsin ucunu tergal ve scutal plakalar arasına yerleştirin. Bir plakayı tutun ve çıkarmak için hafifçe çekin. Ardından, cirri'yi tutmak için forseps kullanın ve midyeyi düz bir şekilde dışarı çekin.

Son olarak, disseke edilmiş midyeleri fiksasyon için doğrudan% 96 etanol veya RNA stabilize edici çözeltiye yerleştirin. Burada açıklanan protokolle, bir haftada dört partiye kadar midye nauplius larvası üretilebilir. Azami olarak, kültür sisteminden gelen her parti yaklaşık 12.000 nauplii'den oluşur, bu da haftada 50.000 nauplii'ye kadar kültürlenebileceği anlamına gelir.

Bir hafta içinde, toplanan naupliilerin %70 ila 90'ı Kıbrıslılara dönüşecek ve haftada yaklaşık 30.000 Kıbrıs üretecektir. Ortalama 500 nanogram yüksek kaliteli RNA, yerleşim aşamasından bağımsız olarak en az 20 ayrı cyprid'den elde edildi. Midyelerde 28S rRNA ısıtıldığında parçalanır.

Seramik boncuklarla homojenizasyon, RNA'ya en yüksek bütünlüğü sağlar, böylece midye ve eklembacaklı dokusunu işlemek için tercih edilen yöntem haline getirir. qPCR analizi kullanılarak, NAK1 mRNA'nın uzun varyantları için iki kat artış ve kısa NAK'a kıyasla düşük tuzluluk gözlendi. Bu, düşük tuzluluk koşulları altında uzun formun baskın olduğunu gösterdi.

Midye kültüründe yer alan farklı adımlarda ustalaşmak için birkaç haftalık eğitim gereklidir. Bu prosedürü denerken, kültür iş akışının tüm adımlarında kontaminasyonu en aza indirmek özellikle önemlidir. Geliştirildikten sonra, bu kültür tekniği bize midye ekolojisi, fizyolojisi ve moleküler biyolojisi hakkında daha iyi bir anlayış kazandırmak için etkili olmuştur.

Aynı zamanda, midye Balanus doğaçlamasını güçlü bir deniz modeli sistemine dönüştürmede önemli bir mihenk taşıdır.