Bioprintable aljinat/jelatin hidrojel 3D Vitro Model sistemleri hücre küresel oluşumu teşvik

Bu yöntem, tümör oluşumu, hücre göçü takibi ve kanser ve sağlıklı hücre sinyalizasyonu gibi kanser biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, fibroblastlar gibi stromal hücrelerle birlikte düşük maliyet ve yüksek tekrarlanabilirlik ile tümör oluşumunu 3 boyutlu bir ortamda incelememize izin vermesidir. Malzemelerin hem biyolojik olarak yazdırılabilir hem de biyolojik olarak işlevsel olduğundan emin olmak önemlidir, bu da reolojik özelliklerinin ve hücre uyumluluğunun nicel olarak incelenmesini gerektirir.

Hidrojel hazırlama ve hücre hidrojel karıştırma adımlarının öğrenilmesi zor olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir, çünkü kabarcık oluşumu basılı modelin aslına uygunluğunu engeller. Bir biyogüvenlik kabininde, 250 mililitrelik bir beherde üç gram aljinat ve yedi gram jelatin tozunu karıştırın. Manyetik bir karıştırıcı ve 100 mililitre DPBS ekleyin.

Kontaminasyonu önlemek için kabı steril parafin film ve alüminyum folyo ile kapatın. Daha sonra katılımcıya elektromiyografi veya EMG modellerine karşılık gelen benzersiz ve spesifik kutupsal grafikleri gösterin. Bundan sonra, çalkalamaya iki saat boyunca oda sıcaklığında devam edin.

Jel sıvı hale bir faz geçişi geçirene kadar çözeltiyi 37 santigrat derecede ısıtın. Daha sonra çözeltiyi steril 50 mililitrelik konik santrifüj tüplerine aktarın ve kapatın. Gaz kabarcıklarını ortadan kaldırmak için tüpleri beş dakika boyunca 834 kez g'de santrifüjleyin.

Ardından, hidrojel öncüsünü 10 mililitrelik şırıngalara aspire edin. Şırıngaları kapaklar ve parafin filmi ile kapatın. Kullanıma hazır olana kadar dört santigrat derecede saklayın.

Teste başlamaya hazır olduğunuzda, hazırlanmış hidrojel öncüsünden oluşan bir şırıngayı bir saat boyunca 37 santigrat derece su banyosuna yerleştirin. Şırınga ısınırken, reometreyi açın ve başlatın. Bir saat sonra, şırıngayı su banyosundan çıkarın.

Öncünün yaklaşık 0,5 mililitresini reometre platformuna sıkın. Kontrol panelinde, aşağı doğru üçgen düğmesine tıklayın. Ölçüm aletinin kırpma konumuna inmesini bekleyin.

Bir spatula kullanarak, ölçüm aletinin kenarından kaçan fazla öncüyü kesin ve gereksiz malzemeyi atın. Ardından ölçüm aletinin kenarına mineral yağ pipetleyin. Yağın sınırı tamamen kapatmasını bekleyin.

Kontrol panelinde, Devam'ı tıklatın. Ardından Başlat düğmesine tıklayın. Test tamamlandıktan sonra ölçüm aletini bırakın ve yukarı üçgen düğmesine tıklayın.

Ölçüm aletini çıkarın. Hem ölçüm aletini hem de platformu %70 etanol ile temizleyin. İlk olarak, metin protokolünde belirtildiği gibi genlik ve sıcaklık taramalarını tamamlayın.

İzotermal zaman taramasını başlatmak için Uygulamalarım'ı tıklatın ve İzotermal zaman-sıcaklık testi şablonunu tıklatın. İş akışında Ölçüm adımını tıklatın. Ardından değişken salınım gerilimine tıklayın ve kurulum penceresini yukarı çekin.

Salınım gerilimini %0,1'e ayarlayın ve salınım frekansını bir hertz'e ayarlayın. Açılır pencerede, veri noktalarının sayısını 120 olarak ayarlayın. Veri toplama sıklığını dakikada bir noktaya ayarlayın.

Sıcaklık değişkenini eklemek için Ekle düğmesine tıklayın. Değişken sıcaklığa tıklayın ve 25 santigrat dereceye ayarlayın. İş akışında Aygıt, Ölçüm noktasına taşı adımına sağ tıklayın.

Sil'e tıklayın. Ardından Cihaz, Değeri ayarla adımına tıklayın. Değere ulaşılana kadar bekleyin kutusunun işaretini kaldırın ve değeri 25 santigrat derece olarak ayarlayın.

Alt ekrandaki Resim, Başlık, Düğmeler'e tıklayın. Devam et kutusunun işaretini kaldırın. Ardından Başlat adımına tıklayın, projeyi adlandırın ve kaydedin.

Şimdi numuneyi reometre platformuna yükleyin ve daha önce açıklanan genel test protokolünü izleyerek testi başlatın. Bundan sonra, zamana karşı G prime ve G çift asal değerlerini gözlemleyin. G prime ve G double prime kelimelerinin kesişme noktasını bulun ve kesişme noktasındaki zamanı belirleyin.

Ardından Tablo'ya tıklayın, tüm verileri kopyalayın ve bir metin dosyasına yapıştırın. Çeşitli jelleşme sürelerinde akma dayanımını ölçmek için Uygulamalarım'a tıklayın. Akma ve akış stresi, Jel benzeri şablona tıklayın.

Bu projeye bir ad verin. Ardından, iş akışındaki Başlat adımına tıklayın. Üst menüde, Ekle'yi tıklayın.

Ardından, açılır menüde Bekle'yi seçin. Kurulum penceresini yukarı çekin ve bekleme süresini 50 dakika olarak ayarlayın. Başlat'a tıklayın, ardından tekrar Ekle'ye tıklayın.

Açılır menüden Cihaz'ı seçin. Kurulum penceresini yukarı çekin, Sıcaklık'ı seçin ve 25 santigrat dereceye ayarlayın. Değere ulaşılana kadar bekleyin kutusunun işaretini kaldırın.

İş akışında Ölçüm adımını seçin. Kayma Gerilimi değişkenini seçin ve kurulum penceresini yukarı çekin. İlk ve son kesme gerilimini sırasıyla sıfır ve 10.000 pascal olarak ayarlayın.

Ardından Hesap Makinesi'ne tıklayın, Nokta yoğunluğunu paskal başına 0,2 punto olarak ayarlayın. Soldaki Veri noktaları sekmesinde saniyede bir nokta ayarlayın. Açılır pencerenin alt kısmında, Olay Kontrolü sekmesini seçin, kesme hızı saniyede 100'den büyükse ölçümü durdur kriterini ayarlayın.

Numuneyi reometre platformuna yükleyin ve daha önce açıklanan genel test protokolünü izleyerek teste başlayın. Test tamamlandıktan sonra, gerinim-gerilme eğrisini gözlemlemek için Diyagrama tıklayın. 30, 40 ve 50 dakikalık bekleme süreleri için bu testi tekrarlayın.

Aşağıdaki adımlar steril koşullarda gerçekleştirilmelidir. Başlamak için, biyoyazıcıyı %70 etanol ile iyice püskürterek ve ardından gece boyunca UV ışığına maruz bırakarak sterilize edin. Bir hidrojel öncüsü şırıngasını depodan çıkarın ve 37 santigrat derece su banyosunda bir saat ısıtın.

Önceden kültürlenmiş hücrelerden oluşan bir T-şişesini bir CO2 inkübatöründen biyogüvenlik kabinine aktarın. Kültür ortamını atın ve ardından hücreleri DPBS ile iki kez durulayın. Hücrelere ısıtılmış bir tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin.

Altı dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Bundan sonra, aynı hacimde FBS ekleyerek tripsini etkisiz hale getirin. Hidrojel öncüsü şırıngasını su banyosundan çıkarın ve temizleyin.

Şırıngayı biyogüvenlik kabinine aktarmadan önce %70 etanol ile sterilize edin. Yaklaşık üç mililitre hidrojel öncüsünü 10 mililitrelik bir baskı kartuşuna sıkın. Öncüyü MDA-MB-231-GFP hücreleri ile mililitrede bir milyon hücre konsantrasyonunda, kabarcık üretmeyi önlemek için yavaşça pipetleyerek karıştırın.

Kartuşu uç ve üst kapaklarla kapatın ve parafin film ile kapatın. Daha sonra gaz kabarcıklarını gidermek için bir dakika boyunca 834 kez g'de santrifüjleyin. Diğer öncüler için tüm bu işlemi tekrarlayın.

Bundan sonra, üç kartuşu da% 70 etanol ile sterilize edin. Sterilize edilmiş kartuşları biyoyazıcının odalarına yükleyin. Yazıcının kontrol yazılımında manual (manuel) seçeneğini tıklatın.

Ardından, yazıcının kontrol yazılımındaki Araç kafası sekmesini genişletin. Sol taraftaki grafik arayüzde bir kartuşa tıklayın, kartuş sıcaklığını 25 santigrat dereceye ayarlayın ve öncünün yazdırılabilir koşullara ulaşması için 35 dakika bekleyin. Bunu diğer iki kartuş için de tekrarlayın.

Yazıcının kontrol yazılımında, Tool head (Araç kafası) sekmesini genişletin. Grafik arayüzde bir kartuşa tıklayın, ardından nozul ucunun konumunu ölçmek için kısa ölç düğmesine tıklayın. Bunu diğer iki kartuş için de tekrarlayın.

Ardından, yazıcı aşamasına şeffaf bir polistiren mikroplaka yerleştirin. G kodu dosyasını açın ve tüm kartuşlar için basıncı 200 kilopaskal olarak değiştirin. Kontrol yazılımına geri dönün ve İskele Oluşturucu sekmesine tıklayın.

Yazdırmayı başlatmak için bir nokta seçin ve ardından Çalıştır düğmesini tıklatın. Üç kopya elde etmek için bu işlemi tekrarlayın. Bundan sonra, modelleri çapraz bağlamak için bir dakika boyunca 100 milimolar bir kalsiyum klorür çözeltisi ekleyin.

DPBS ile iki kez durulayın. Ardından, modelleri agaroz kaplı, altı oyuklu bir plakaya dikkatlice aktarmak için bir spatula kullanın. Her oyuğa beş mililitre DMEM ekleyin ve her üç günde bir hücre kültürü ortamını değiştirerek 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.

Bu çalışmada, in vivo tümör mikro çevrelerini özetlemek ve çok hücreli tümör sferoidlerinin oluşumunu kolaylaştırmak için üç boyutlu hidrojel sistemleri üretilmiştir. A3G7 öncüsünün bir sıcaklık taraması, G çift asalının 37 santigrat derecede G asaldan daha büyük olduğunu gösterir ve bu da öncünün bilinen özelliklerini doğrular. Sıcaklık düştükçe, öncü, jelatin moleküllerinin kendiliğinden fiziksel olarak üç sarmal bir oluşuma girmesi nedeniyle fiziksel jelleşmeye uğrar.

Hem G prime hem de G çift prime artar, sıcaklık azalır ve 30.6 santigrat derecede birleşir, bu da bir sol-jel geçişini gösterir. Baskılı pervane modelinin konfokal mikroskobu, MDA-MB-231-GFP hücrelerinin kültür periyodundan 15 gün sonra sferoidler geliştirmeye başladığını ve sferoidlerin 30. güne kadar boyut ve sayı olarak artmaya devam ettiğini göstermektedir. IMR-90-mCherry hücrelerinin bir kısmının da topaklanma oluşturduğu görülmektedir.

30 günlük kültürden sonra, başlangıçta MDA-MB-231-GFP hücrelerinin işgal ettiği bölgede IMR-90-mCherry hücreleri gözlenebilirken, IMR-90-mCherry'nin baskın olduğu bölgede MDA-MB-231-GFP hücreleri görülebilir. Bu, modeldeki olası geçiş olaylarını ifade eder. Disk modelinin konfokal mikroskobu, MDA-MB-231-GFP hücrelerinin, pervane modelindekine benzer şekilde davrandığını ve 21 günlük kültürden sonra küresel yüklü bir hidrojel ile sonuçlandığını ortaya koymaktadır.

Bir kez ustalaştıktan sonra, modelleri basmak için bu teknik, düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse iki saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, yanıltıcı sonuçlardan kaçınmak için hidrojeli ve hücreleri mümkün olduğunca taze tutmayı, eski hidrojel partilerini yenileriyle karıştırmamayı ve steril bir koşulda çalışmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, malzeme gözenekliliği, hücre göç hızı ve matrisin yeniden şekillenmesi gibi ek soruları yanıtlamak için taramalı elektron ve hızlandırılmış mikroskopi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.

Bu tekniğin anlamı kanser tedavisine kadar uzanır, çünkü bu in vitro model, ko-kültür sistemlerinde tümör oluşumu ve davranışının sistematik olarak kontrol edilen çalışmalarına izin verir. Meme kanseri hücrelerinin yanı sıra, model aynı zamanda çeşitli başlangıç konumlarında diğer hücre türlerini kullanan sistemlere de kolayca uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, hidrojelleri uygun şekilde hazırlayarak, hücreleri içine gömerek ve malzemeyi en uygun baskı penceresinde yazdırarak 3D heterojen hastalık modellerinin nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız.

Biyolojik numunelerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken eldiven, laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlük gibi kişisel koruyucu ekipman giymek gibi önlemleri unutmayın.