Bir moleküler karakterize etmek için Kombinatorik tek hücreli yaklaşım ve insan kök ve yaratıcı nüfus Immunophenotypic heterojen
25 Ekim 2018
Toplu gen ifade ölçümleri bulut tek hücre farkları türdeş olmayan hücre popülasyonlarının. Burada, bir protokol açıklamak nasıl tek hücreli gen ifade analizi ve dizin için Variety aktif hücre sıralama (FACS tarafından) sıralama heterojenite betimlemek için birleştirilebilir ve immunophenotypically karakterize tatlı ayrı hücre popülasyonlarının.
Bu yöntem kök hücre ve kanser alanlarında kök hücre heterojenitesi nasıl göründüğü ve hassas kanser hücrelerinde tedavinin nasıl izole edilebildiği gibi temel soruları yanıtlayabilir. Bu çalışmanın en büyük avantajı, hedef alt popülasyonların daha aşağı karakterizasyonu için teknik olarak sağlam tek hücreli gen ekspresyonu analizini vackinozis ile biraraya getirerek birleştirilmesidir. Bu yöntem kanser ve kök hücre heterojenliğini araştırmak için kullanılabilse de, gen astarı ve soy potansiyeli hakkında bilgi verebilir.
Protokolü başlatmak için, RNA/DNA içermeyen bir tezgahta, 390 mikrolitre çekirdeği serbest su, 17 mikrolitre 10%NP-40, 2.8 mikrolitre 10 milimolar dNTP, 10 mikrolitre 0.1 molar DTT ve 5.3 mikrolitre RAsinhibitor'u karıştırarak 96 kuyu için %10 ekstra lysis tamponu hazırlayın. Girdap ve tüp aşağı spin. Daha sonra, 96 kuyulu bir PCR plakanın her kuyuya dört mikrolitre lysis tampon dağıtın ve plakaları yapışkan filmle kapatın.
Alttaki sıvıyı toplamak için plakaları aşağı çevirin. En fazla 24 saat hücre sıralama kadar buz plakaları tutun. FACS makinesi düzgün bir şekilde kurulduktan sonra, 100 mikrolitre leke tamponu yla en az 100 hedef hücreyi yeni bir mikrosantrifüj tüpüne ayırarak hedef popülasyonun yeniden analizini yapın.
FACS sıralanmış örnekleri kaydederek sıralanmış hücreleri analiz eder ve sıralama kapısına son verdiklerinden emin olur. Daha sonra 96 kuyuplakasında ki iyi A1'deki düşüşü ortalayarak tek hücreli plaka sıralamasını ayarlayın. Ortalandığında, boş bir 96 kuyuplakasının kenarındaki tüm kuyularda 50 ila 106 mikrometrelik parçacıkları sıralayın ve tüm kuyuların her kuyunun merkezinde bir hücre olmasını sağlayın.
Yapışkan filmi plakalardan çıkarın. Lin-CD34 artı CD38 eksi hücrelerinden oluşan tek bir hücreyi 96 kuyudan 92'sine ayırın. HER bir hücre için CD45RA, CD49F ve CD90 için immünopopopnotipic profili kaydetmek için FACS sıralama yazılımında indeks sıralamayı etkinleştirin.
PCR amplifikasyonundaki doğrusallık kontrolleri için sırasıyla 10 ve 20 hücreli iki kuyu sıralayın. Wells H1 ve H2 genellikle kullanılır. Hiçbir şablon kontrolleri olarak herhangi bir hücre olmadan iki kuyu tutun, genellikle wells H3 ve H4. Plakaları net yapışkan filmle kapatın ve plakaları bir dakika boyunca 300 kat yerçekiminde döndürün.
Snap kuru buz üzerinde plakaları dondurmak. Sonra eksi 80 santigrat derecede saklayın. İki kat reaksiyon karışımının 632,5 mikrolitresi, 101,2 mikrolitre Taq/SuperscriptIII, 151,8 mikrolitre astar karışımı ve kontrol RNA'sında 0,7 mikrolitre ekleyerek ters transkripsiyon ve spesifik hedef amplifikasyon karışımı yapın.
Çözeltiyi girdap ve tüpün altındaki sıvıyı toplamak için aşağı doğru döndürün. Numuneye eklenmeye hazır olana kadar karışımı buzüzerinde tutun. Sonra, buz üzerinde lysate plakaları eritin.
Doğrusallık ve şablon denetimleri dahil olmak üzere 92 kuyuya daha önce hazırlanmış ters transkripsiyon ve özel hedef amplifikasyon karışımının 8,75 mikrolitresini ekleyin. Kalan dört kuyuya 8,75 mikrolitre ters transkripsiyon kontrol karışımı ekleyin. Daha sonra plakaları açık yapışkan filmle kapatın ve alttaki sıvıyı toplamak için plakaları döndürün.
Preamp programına göre plakayı bir PCR makinesinde çalıştırarak ters transkripsiyon ve belirli hedef amplifikasyonu gerçekleştirin. 96 kuyulu bir plakanın her kuyusuna üç mikrolitre adet azar lama reaktifi boru sulayarak, azar lama yükleme plakasını hazırlayın. Her astarın üç mikrolitresini, tek tek kuyulara, astar yükleme plakasında ekleyin.
Plakayı yapışkan filmle kapatın ve aşağı çevirin. Plakayı döndürdükten sonra, seyreltme plakasını, 8 mikrolitre nükleaz içermeyen suyu 96 kuyunun tüm kuyularına boşaltarak hazırlayın. Seyreltme plakasına iki mikrolitre güçlendirilmiş numune ekleyin.
Plakayı yapışkan filmle kapatın. 10 saniye boyunca plaka girdap tarafından karıştırın. O zaman tabağı aşağı çevir.
Daha sonra, 352 mikrolitre ana karışımı 35,2 mikrolitre numune yükleme reaktifi ile dikkatlice karıştırarak numune yükleme karışımını hazırlayın. Numune yükleme plakasını, 96 kuyulu bir plakanın her kuyusu için 3,3 mikrolitre yükleme karışımı nı karıştırarak hazırlayın. Seyreltilmiş numuneden 2,7 mikrolitreyi numune yükleme plakasının her kuyuya ekleyin.
Plakayı yapışkan filmle kapatın ve aşağı çevirin. Yeni bir 96'ya 96 mikroakışkan çip çıkar. Hareket ettirilebildiklerinden emin olmak için, girişleri kapağı olan bir şırıngayla dürterek hazırlayın.
Talaşı 45 dereceye yatırıp valfaşağı yaslarken şırıngaların tüm hacmini her vanaya ekleyin. Çipi IFC kumandasıyla başedin. Her bir titre girişi, tsay yükleme plakasındaki kuyuların her birinden 4,25 mikrolitre ile yükleyin ve kabarcıklardan kaçının.
Kabarcıklar kuyuda görünürse, bir pipet ucu ile kaldırın. Her numune girişine numune yükleme plakasındaki kuyuların her birinden 4,25 mikrolitre yüklemeye devam edin, kabarcıklardan kaçının ve kabarcıklar bunları pipet ucuyla çıkarırken görünürse. Çipi Entegre Fluidics Devre denetleyicisi veya IFC denetleyicisi ile yükleyin.
Çipin eşit göründüğünü ve tüm odaların dolu olup olmadığını kontrol edin. Bantla dokunarak talaşın yüzeyindeki tozu çıkarın. Son olarak, çokkatlı mikroakışkan gen ekspresyonu platformunda çip çalıştırın.
Başarılı bir çalıştırmanın ısı haritası, yaklaşık yedi ila 25 TT'lik güçlü bir sinyalle örnekler arasında eşit olarak yayılan ifadeyi görüntüler. Kontrol RNA çivili bu amplifikasyon eğrisi tüm kuyular yaklaşık 10 CT çok az hiçbir varyasyon ile net bir ifade olduğunu doğrular, ön amplifikasyon ve qPCR reaksiyonları tüm hücreler için başarılı olduğunu doğrulayan. Boyut küçültme kullanarak hücre grupları arasındaki benzerlikleri görselleştiren İlke Bileşen Analizi veya PCA, moleküler olarak farklı hücre kümelerini birbirinden ayırmak için yararlı olabilir.
Farklı moleküler kümelerden gelen hücrelerin immünopfenotipini belirlemek için, index FCS dosyasını FlowJo'ya yükleyin. Komut dosyası düzenleyicisini açın ve dizin komut dosyasını yapıştırın, Çalıştır'a basın. Her hücre ayrı bir geçitte olacak.
Her hücreyi düzen düzenleyicisine ekleyin ve dosya sample_complete_data.xls bulunan SCXV'nin moleküler olarak tanımlanmış grubuna göre renklendirin. FACS çizimleri, kümeler arasında ayrım yapmak ve işlevsel analiz için onları izole etmek için kullanılabilecek hematopoetik kök hücre belirteçleri CD90 ve CD45RA için hücre yüzeyi işaretleyici ifadesini gösterir. Bu prosedürü takiben, yeni keşfedilen alt popülasyonların RNA dizilimi veya in vitro ve in vivo deneyleri gibi diğer teknikler, moleküler mekanizmanın bu heterojenliğe neden olduğu ve alt popülasyonun işlevsel olarak nasıl farklılık gösterdiği gibi ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir.
Bu strateji, araştırmacıların sadece normal ve malign hematopoyoniste heterojenliği araştırmakla kalmadı, aynı zamanda keşfedilen alt popülasyonları daha fazla incelemek için prospektif olarak izole etmek için de kullanılabileceğini ortaya çıkar.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, hücre popülasyonlarındaki heterojenliği araştırmak için tek hücre gen ekspresyon analizini floresanla aktive edilen hücre ayırma (FACS) ile birleştiren bir protokol sunmaktadır. Çalışma, özellikle kök hücreler ve kanser bağlamında moleküler olarak farklı hücre tiplerini karakterize etmeyi amaçlamaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre Biyolojisi
- Nörobilim
- Kanser Araştırmaları
Arka Plan
- Toplu gen ekspresyon ölçümleri, bireysel hücre farklılıklarını gizleyebilir.
- Kök hücre heterojenliğini anlamak, terapötik ilerlemeler için kritik öneme sahiptir.
- FACS, ayrıntılı analizler için spesifik hücre popülasyonlarının izole edilmesine olanak tanır.
- Bu yöntem, gen priminglemesi ve soy potansiyeli hakkında içgörüler sağlar.
Çalışmanın Amacı
- Hücre popülasyonlarındaki heterojenliği belirlemek için.
- Farklı hücre tiplerini immünofenotipik olarak karakterize etmek için.
- Terapilerin hassas kanser hücreleri üzerindeki etkilerini incelemek için.
Kullanılan Yöntemler
- Tek hücre analizleri için lizis tamponunun hazırlanması.
- Floresanla aktive edilmiş hücre ayıklama (FACS) kullanımı.
- Tek hücre gen ekspresyon analizi.
- Hedef alt popülasyonların alt akış karakterizasyonu.
Temel Sonuçlar
- Yöntem, kök hücre heterojenliğini etkili bir şekilde ortaya koymaktadır.
- Belirli kanser hücresi popülasyonlarının izole edilmesine olanak tanır.
- Gen hazırlama (priming) ve soy potansiyeline ilişkin bilgiler elde edilmiştir.
- Protokol teknik olarak sağlam ve tekrarlanabilirdir.
Sonuçlar
- Bu yaklaşım, hücresel çeşitliliğin anlaşılmasını geliştirmektedir.
- Hem kök hücre hem de kanser araştırmalarında potansiyel uygulama alanlarına sahiptir.
- Tekniklerin kombinasyonu, hücre popülasyonlarının kapsamlı bir analizini sağlar.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Bu kombinatoryal tek hücreli yaklaşım, moleküler profilleme sırasında tek hücre çözünürlüğünü koruyarak kök hücre ve kanser araştırmalarındaki kritik bir darboğazı giderir ve terapötik dirence veya soy farklılaşmasına neden olan nadir alt popülasyonların kesin şekilde tanımlanmasını sağlar. İmmünofenotipik belirteçleri tek hücre çözünürlüğünde gen ekspresyon profilleriyle ilişkilendiren bu yöntem, hedef doğrulama güvenini artırır ve erken keşif aşamalarındaki mekanistik risk azaltma süreçlerini destekler. Bu yaklaşım, hedef önceliklendirme ve öncü bileşik tanımlama çalışmalarındaki karar alma süreçlerini bilgilendiren kantitatif, multimodal veriler üretmek için ölçeklenebilir ve tekrarlanabilir bir iş akışı sunar.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Kök ve progenitör popülasyonlardaki moleküler ve immunofenotipik heterojenliği çözümleyerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Yüzey belirteci ekspresyonu ile önceden seçilmiş gen panellerinin korelasyonu aracılığıyla fonksiyonel hedef doğrulamayı destekler ve hedef seçimindeki yanlış pozitifleri azaltır.
- Öngörücü Değer: İzole edilecek moleküler olarak farklı alt popülasyonların tanımlanmasını kolaylaştırarak, soy potansiyeli ve gen primingleme değerlendirmelerindeki güvenilirliği artırır.
Tarama ve Deney Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: FACS indeksleme ayıklama ile bağlantılı, standartlaştırılmış ve kantitatif gen ekspresyon verileri üreterek hücre popülasyonları genelinde moleküler durumların tekrarlanabilir şekilde taranmasını sağlar.
- Ölçeklenebilirlik: 96 kuyucuklu formatlar ve mikroakışkan platformlarla uyumludur; primer insan örneklerinde önceden tanımlanmış gen panellerinin orta ölçekli taramasını destekler.
- Tekrarlanabilirlik: Tampon çözelti içinde tek hücre lizi ve ön amplifikasyon adımları aracılığıyla teknik değişkenliği en aza indirerek, düşük bolluktaki transkriptlerin tutarlı bir şekilde tespit edilmesini sağlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Keşif sürecini preklinik geliştirmeye bağlayarak, in vitro ve in vivo fonksiyonel doğrulama için moleküler olarak tanımlanmış alt popülasyonların prospektif izolasyonuna olanak tanır.
- Biyobelirteç Uyumu: Moleküler kümelerle ilişkili yüzey belirteci imzalarının tanımlanmasını destekleyerek, hasta stratifikasyonu için translasyonel biyobelirteçlerin geliştirilmesine yardımcı olur.
- Riskten Arındırılmış İlerleme: Heterojenliğe dair mekanistik içgörüler sağlayarak preklinik model seçimini yönlendirir ve terapötik geliştirme sürecindeki geç aşama biyolojik risklerini azaltır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, özellikle kök hücre kaynaklı kanserler ve rejeneratif tıp programlarında, öncü bileşik tanımlaması öncesinde heterojen popülasyonların yüksek çözünürlüklü profillemesini sağlayarak erken keşif iş akışlarına entegre olur. Moleküler ve fenotipik karakterizasyonu, tek seferlik bir analizden ziyade sürekli ve yeniden kullanılabilir bir yetkinlik olarak konumlandırarak iteratif hedef iyileştirmesini destekler.
- Keşif Biyolojisi: Tek hücreli gen ekspresyonunu immünofenotipik profillerle ilişkilendirerek hipotez testlerini ve yolak açıklığa kavuşturma süreçlerini destekler; böylece hematopoetik ve onkojenik bağlamlardaki hedeflerin biyolojik risklerinin azaltılmasını sağlar.
- Tarama: Ön amplifiye edilmiş cDNA'dan analiz hazır, kantitatif çıktılar sağlayarak, sıralanmış tek hücreler arasındaki moleküler durumların güvenilir karşılaştırmasını kolaylaştırır.
- Analitik: Moleküler kümeleri tanımlamak ve alt popülasyon ayrımı için bunları yüzey belirteç ekspresyonu ile ilişkilendirmek amacıyla temel bileşen analizi (PCA) ve ısı haritası görselleştirmesine olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: Alt popülasyonların sonraki RNA dizileme veya in vivo analizler için prospektif izolasyonu yoluyla, moleküler kümelemeyi fonksiyonel doğrulama ile birbirine bağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Farklı model sistemlerine ve terapötik alanlara uyarlanabilen, çoklu tek hücre analizi için standartlaştırılmış bir protokol oluşturarak tekrarlanan yöntem geliştirme süreçlerini azaltır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Toplu analizlerde maskelenen moleküler heterojenliği çözerek hedef doğrulamadaki öngörü güvenilirliğini artırır.
- Operasyonel Değer: Mevcut FACS ve mikroakışkan altyapısıyla uyumlu standartlaştırılmış lizis, ön amplifikasyon ve qPCR iş akışları aracılığıyla tekrarlanabilirliği sağlar.
- Stratejik Değer: Fonksiyonel açıdan ilgili alt popülasyonların erken tanımlanmasını sağlayarak, uygulanabilir olmayan hedeflere yapılan yatırımı azaltır ve sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Moleküler olarak tanımlanmış popülasyonların preklinik doğrulamaya taşınması için mekanistik gerekçeler sunarak risk ayarlı önceliklendirmeyi destekler.
Uygulama Hususları
- FACS indeksleme sıralaması, tek hücre manipülasyonu ve mikroakışkan qPCR platformları konusunda uzmanlık gerektirir.
- İndeksleme sıralama yeteneğine sahip floresanla aktive edilen hücre ayıklayıcılara ve mikroakışkan gen ekspresyon sistemlerine erişime bağlıdır.
- Lizis tamponu hazırlama, sıralama kapılama stratejileri ve veri analiz hatları için ekipler arasında standartlaştırma gereklidir.
- Hematopoetik olmayan sistemlere adaptasyon, yüzey belirteç panellerinin ve lizis koşullarının optimizasyonunu gerektirebilir.
- Pratik kısıtlamalar arasında, sıralama hızı ve mikroakışkan çip yüklemesine bağlı işlem kapasitesi sınırları yer alır; bu yöntem tüm transkriptom taramasından ziyade odaklanmış paneller için daha uygundur.
