Name: Co-immunoprecipitation tahlil hipoksik koşullarda kültürlü hücrelerden endojen nükleer proteinler kullanarak (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Keşfedin, hipoksik koşullarda endojen nükleer protein etkileşimlerini incelemek için co-immunoprecipitation yöntemini. Bu teknik, transkripsiyon faktörleri ve eş düzenleyiciler arasındaki etkileşimleri HEK293A hücrelerinde çalışır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. günah Tiong Ong hipoksi iş istasyonu kullanım için teşekkür ederiz. Bu eser aşağıdaki tarafından desteklenmiştir: Singapur Milli Eğitim Bakanlığı, MOE 1T1-02/04 ve MOE2015-T2-2-087 (için içeride), Lee Kong Chian Okulu tıp, Nanyang Teknoloji Üniversitesi açılış hibe M4230003 (P.O.B.), İsveçli Araştırma Konseyi Aile Erling Persson Vakfı, Novo Nordisk Vakfı, Stichting af Jochnick Vakfı, İsveç Diyabet Derneği, Scandia sigorta şirketi, diyabet araştırma ve Sağlık Vakfı, yatak von Kantzow'ın Vakfı, Diyabet, Karolinska Institutet, ERC ERC-2013-AdG 338936-Betalmage ve Knut ve Alice Wallenberg Vakfı Stratejik araştırma programı.

İnsan embriyonik böbrek 293A kullanır bu protokolü bölüm (HEK293A) hücre, s insan Araştırma Etik Komitesi Nanyang Teknoloji Üniversitesi, Singapur ve kuralları izler.
1. indüksiyon HEK293A hücrelerindeki hipoksi
<ol><li>Dört 10 cm yemekleri ve tohum 3-5 x 10 mL Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (DMEM, 4,5 g/M glikoz) % 10 fetal Sığır serum ile (FBS), 2 mM L-glutamin, takıma çanak başına 106 HEK293A hücre hazırlamak 110 mg/L sodyum pyruvate, 100 U/mL penisilin ve 100 mg / mL streptomisin. Bir 37 ° C, % 5 CO2 kuluçka hücrelerde kültür. Not: Hücre tohum bir biyolojik güvenlik kabini (BSC) yapılmalıdır. BSC yerleştirilmesi için tüm malzemeler yüzeylerin % 70 etanol ile sildi.</li>
	<li>tohum sonra 24 h hücreleri % 80-90 confluency, ulaştığında kuluçka torpidoda hipoksi subchamber içine iki tabak koymak ( Tablo malzemelerigörmek) ve O % 12 ile % 5 CO2 37 ° C ve diğer iki normoxia (% 21 O yemekleri tutun 2, 37 ° C'de % 5 CO2 ) 4 h için bir dizi normoxic ve hipoksik hücrelerin hipoksi tedavi tarafından western blot değerlendirmek ve diğer co-immunoprecipitation deneyleri için hücre kümesi kullanmak için kullanın. Not: Oksijen düzeyleri ayarlanabilir 0-%5 ve hipoksi tedavi süresi hücre türüne bağlı olarak farklı olabilir ve çalışma amacı.</li>
</ol>2. tüm cep telefonu ve nükleer çıkarma
Not: Bu protokol için kullanılan arabellekleri hakkında bilgi için bkz. Tablo 1 .
<ol><li>
Normoxia kontrol hücreleri hasat.
	<ol>
<li>Aspirasyon tarafından kültür ortamını çıkarın ve 10 mL DPBS (PH 7,0-7,2) hücrelerle durulama 10 mL pipet kullanarak. Not: pipet ile hücre monolayer dokunmaktan kaçının. Yıkama sırasında hücre kaybı önlemek için DPBS hücre kültür plaka duvar aşağı yavaşça pipette.</li>
		<li>5 mL pipet plaka içine buz gibi DPBS ve buz gibi PBS plaka yüzeyi kapalı hücre hücre sıyırıcı kazıyorum.</li>
		<li>Hücre süspansiyon 15 mL konik tüpler içine aktarmak ve buz üzerinde tutun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hipoksik koşullarda kültürlü hücre hasat.
	<ol>
<li>Hipoksik koşullarına DPBS hipoksi subchamber (%1 O2 ve %5 CO2 37 ° C'de) DPBS dolu bir ele geçen 100 mL deneme cam reaktif şişe için 24 saat önceden yerleştirerek önceden equilibrate.</li>
		<li>Tedavi hipoksi hücre hasat öncesinde yaklaşık 1 h %1 O2 ve %5 CO2equilibrated torpidoda işleme TMMOB buza içeren bir buz kutusu yerleştirin. Hipoksi subchamber üzerinden önceden dengelenmiş hipoksik DPBS işlem odasına içeren şişe aktarmak ve buza koyun.</li>
		<li>hipoksi tedavi, aşağıdaki 4 h %1 O2 ve %5 CO2önceden dengelenmiş oldu işlem odasına hipoksi subchamber hücreleri aktarın.</li>
		<li>Aspirasyon tarafından kültür ortamını çıkarın ve hücreleri ile 10 mL 10 mL ile buz gibi önceden dengelenmiş hipoksik DPBS pipet sonra durulayın.</li>
		<li>5 mL 5 mL ile buz gibi önceden dengelenmiş DPBS pipet ve hücreleri hücre sıyırıcı kazıma çıkarmak ekleyin.</li>
		<li>Hücre kültür plaka eğilme ve 10 mL pipet kullanarak müstakil hücreleri toplamak. DPBS hücre süspansiyon 15 mL konik tüpler içine aktarmak ve buz üzerinde tutun.</li>
		<li>İkisi de % 1 O2 ve %5 için CO2önceden dengelenmiş olmuştur işleme ve tampon odaları torpidoda arası kapıyı açın. 15 mL Konik Boru işleme odası tedavi hipoksi hücrelerden arabellek odasına içeren buz aktarmak. Arabellek odası kapıyı açıp hücreleri tamamen torpidoda kaldırmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Santrifüjü 1000 x g 4 ° C'de 5 min için de tarafından hem 2.1 normoxic hücrelerden ve 2.2 hipoksik hücrelerden cips</li>
	<li>
Bütün hücre özleri hazırlayın.
	<ol>
<li>Buz gibi radyo immunoprecipitation tahlil (RIPA) lizis arabelleği 50 mM Trisaminomethane hidroklorid (Tris-HCl) pH 8.0, 150 mM sodyum klorür (NaCl), % 1 tergitol tipi NP-40 (NP-40), % 0.5 sodyum deoxycholate, içeren 500 µL hücre granül resuspend ve 1 x proteaz inhibitörü kokteyl ile takıma % 0,1 Sodyum Lauryl Sülfat (SDS), ( Tablo malzemelerigörmek) hücre topakları yukarı ve aşağı birkaç kez pipetting tarafından.</li>
		<li>Hücre lysates yeni 1.5 mL microcentrifuge tüpler içine aktarmak ve ara sıra vortexing ile 30 dk için buz üzerinde tutun.</li>
		<li>Hücre lysates 13.000 x g 4 ° C'de 10 dakika için de santrifüj kapasitesi</li>
		<li>Süpernatant, aliquot 50 µL süpernatant ile 1.5 mL microcentrifuge tüpler içine toplamak ve-80 ° C'de depolayın</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Nükleer bir çıkarma kullanarak nükleer özleri hazırlayın (tablo malzemeleri görmek) kit.
	<ol>
<li>Yavaşça lizis arabellek NL 1 x proteaz inhibitörü kokteyl ve 0.1 M dithiothreitol (DTT) ile takıma 500 µL hücre granül hücre topakları yukarı ve aşağı birkaç kez pipetting tarafından resuspend.</li>
		<li>Hücre süspansiyon ve 10 için girdap deterjan solüsyonu NP 25 µL eklemek s maksimum hızda.</li>
		<li>4 ° C'de 5 min için 10.000 x g , santrifüj</li>
		<li>Süpernatant (sitoplazmik özler), aliquot 50 µL süpernatant 1.5 mL microcentrifuge tüpler, içine, toplamak ve-80 ° C'de depolayın</li>
		<li>Hücre çekirdeği içinde 500 µL lizis arabelleği için 5 vortexing 1 x proteaz inhibitörü kokteyl ve 0.1 M DTT ile desteklenmiştir NL içeren pelet resuspend s maksimum hızda.</li>
		<li>10.000 x g 4 ° C'de 5 min için de santrifüj kapasitesi ve nükleer Pelet kaydedin.</li>
		<li>Nükleer Pelet ayıklama arabellek 1 proteaz inhibitörü kokteyl x ile yukarı ve aşağı birkaç kez Pelet pipetting takıma NX1 50 µL resuspend.</li>
		<li>Kuluçkaya buz üzerinde 30 dk, vortexing 10 s maksimum hızda her 5 dak.</li>
		<li>4 ° C'de 10 dakika için 12.000 x g , santrifüj</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Nükleer özler desalt.
	<ol>
<li>Süpernatant birim başına 100 µL maksimum hacmi ile mini diyaliz cihazların içine adım 2.5.9 ve transfer toplamak.</li>
		<li>Mini Diyaliz cihazları kap ve bir can kurtarma aleti koyun.</li>
		<li>Can kurtarma aleti önceden soğutulmuş diyaliz arabelleği (20 mM Tris-HCl pH 7.4, % 20 gliserol, 100 mM potasyum klorür (KCl), 0.2 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA), 0.2 mM phenylmethylsulfonyl Flor (PMSF) ve 0,5 mM DTT) 500 mL içeren bir ölçek koymak ve nazik karıştırma ile 4 ° C'de 30 dk için kuluçkaya. Dikkat: PMSF zararlıdır. Cilt veya inhalasyon ile doğrudan temas önlemek.</li>
		<li>Mini Diyaliz cihazları köşesinden örnekleri toplamak ve yeni 1.5 mL microcentrifuge tüpler içine aktarın.</li>
		<li>12.000 x g 4 ° c, aliquot 25 µL her süpernatant 1.5 mL microcentrifuge tüp içine, 10 min için de santrifüj kapasitesi ve-80 ° C'de depolayın</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Protein ifade ve kurulan-1α hücre altı yerelleştirme hipoksi tedavisi algılama tarafından değerlendirilmesi
<ol><li>Tüm cep telefonu protein konsantrasyonu belirlemek veya nükleer/sitoplazmik Mikroplaka tahlil kitinin bir bicinchoninic asit (BCA) protein tahlil üreticisinin yönergeleri18göre kullanarak ayıklar.</li>
	<li>1 x Laemmli örnek arabelleği %5 2-Mercaptoethanol içeren hücre lysates sulandırmak ve 95 ° c 5 dakika kaynatın. Uyarı: yanıklara neden beri Isıtma blok yüzeyine dokunmayın.</li>
	<li>
Proteinler Sodyum Lauryl Sülfat polyacrylamide jel elektroforez tarafından (SDS-sayfa) ayırın.
	<ol>
<li>Protein (25 µg) eşit miktarda bir SDS-sayfa prekast degrade jelleri (4-%20), her kuyuya molekül ağırlığı işaret 3 µL ile birlikte yükleyin.</li>
		<li>Jel içeren 2.5 mM Tris, 19.2 mM glisin, % 0,01 SDS, PH8.3 200 V 30 dk için arabellek çalıştırma.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Jel üzerinden protein nitroselüloz membran için transfer.
	<ol>
<li>Transfer sandviç (filtre kağıdı-jel-membran-filtre kağıdı) jel ile anot tarafı ve kaset katot tarafındaki membran üzerinde topla.</li>
		<li>2.5 mM trisaminomethane (Tris), 19.2 mM glisin ve % 20 metanol içeren aktarım arabellek ile dolu transfer tankı kaset yerleştirin. Dikkat: Metanol yanıcı ve yanıcı sıvı depolama kabine içinde saklanmalıdır.</li>
		<li>Transfer için 1 h 100 V soğuk oda içinde yerine getirir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>50 mM Tris-Cl (pH 7,6), 150 mM NaCl, bir shaker üzerinde oda sıcaklığında 1 h için 0,1 ara 20 ve % 5 yağsız süt içeren 10 mL engelleme arabellek blot engelleyin.</li>
	<li>Gecede 4 ° C'de aynı engelleme arabellekte anti-kurulan-1α antikor (1/500 seyreltme) ile leke kuluçkaya</li>
	<li>Leke 50 mL TBS-T. ile her zaman 5 min için 3 kez yıkamak</li>
	<li>Leke horseradish peroksidaz (HRP) ile kuluçkaya-Konjüge ikincil antikor (1/1000 seyreltme) 10 mL TBS-T içeren % 5 Sigara yağlı kuru süt oda sıcaklığında 1 h için.</li>
	<li>Leke 50 mL TBS-T. ile her zaman 5 min için 3 kez yıkamak</li>
	<li>Mix 500 µL her, gelişmiş chemilumescent (ECL) Reaktif A ve B 1.5 mL microcentrifuge tüp ve girdap kısa bir süre içinde.</li>
	<li>ECL substrat leke için geçerli ve oda sıcaklığında 1 dk. için kuluçkaya.</li>
	<li>
Bir şarj kuplajlı cihaz (CCD) kamera tabanlı görüntüleme sistemi kullanarak chemiluminescent sinyalleri yakalamak.
	<ol>
<li>Kağıt mendil ile membran kenarına dokunarak aşırı ECL substrat drenaj ve bir levha koruyucu membran yerleştirin.</li>
		<li>Membran kamera tabanlı görüntüleme sistemi CCD örnek tepsiye yerleştirin.</li>
		<li>Görüntü işleme yazılımı başlatmak ( Tablo malzemelerigörmek) ve aşağıdaki ayarlarla çekim: → yeni protokol → tek kanal → protokolü Kur → jel görüntüleme dosya (uygulama: kimya; Görüntüleme alanı: Bio-Rad hazır jel; Pozlama: görüntüleme Yazılımı otomatik olarak yoğun bantları için çekim hızı optimize eder) → Çalıştır iletişim kuralı Not: Çekim hızı en iyi görüntüleri elde etmek için el ile ayarlanabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Immunoprecipitation ve algılama Immunoprecipitated proteinlerin
<ol><li>TBS arabelleği 1.5 mL microcentrifuge tüpler 500 µL protein A/G sepharose boncuk 50 µL yıkayın ve boncuk Santrifüjü 3000 x g 4 ° C'de 2 min için de tarafından cips</li>
	<li>Süpernatant atın ve boncuk TBS arabellek 100 µL içinde resuspend.</li>
	<li>Fare monoklonal anti-ARNT antikor (1,4 mg/mL) veya fare immünoglobulin G (IgG) (1,4 mg/mL) 0.7 mg fare IgG 500 µL TBS arabelleği başlamaktan tarafından hazırlanan 2 µL ekleyin.</li>
	<li>Bir tüp rotator boncuklar içeren 1.5 mL microcentrifuge tüpler yerleştirin ve soğuk odada 10 rpm'de 2 h için kuluçkaya. Not: tüpler yavaşça işlemek ve tüpün dibinde boncuk içeren süspansiyon tutun.</li>
	<li>Santrifüjü 3000 x g 4 ° C'de 2 min için de tarafından boncuk cips ve supernatants atın.</li>
	<li>Nükleer protein lysate 180 mM NaCl, % 20 gliserol, % 0,2 NP-40 ve 1 x proteaz inhibitörü kokteyl 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), oluşan IP arabellek adım 2.6.5 800 µL içinde elde edilen 200 µg sulandırmak. Adım 4.5 gecede 4 ° C'de elde antikor birleştiğinde boncuk ile lysate kuluçkaya</li>
	<li>Santrifüjü 3000 x g 4 ° C'de 2 min için de tarafından boncuk cips, supernatants atmak ve 3 kez ile 1 mL boncuk yıkama buz gibi TBS % 0,2 içeren NP-40.</li>
	<li>Boncuk 50 µL Laemmli örnek arabelleği 95 ° c 5 dakika kaynatın.</li>
	<li>10.000 x g 4 ° C'de 5 min için de boncuk santrifüj kapasitesi, süpernatant toplamak ve boncuk atmak. Not: Süpernatant 4 ° C-20 ° C veya kısa vadeli için uzun süre saklanabilir.</li>
	<li>Daha önce açıklandığı adım 3.3 itibaren Batı leke tarafından kurulan-1α olup olmadığını immunoprecipitated protein kompleksleri gelen belirlemek. Not: Protein miktar için bu adım gerekli değildir. Tam birim (50 µL) SDS-sayfa prekast degrade jelleri (4-%20) her kuyuya her örnek süpernatant yük</li>
</ol>

<ol><li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-inducible+factors+in+physiology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-inducible factors in physiology and medicine.</a> Cell. 148 (3), 399-408 (2012).</li>
<li>Bartels, K., Grenz, A., Eltzschig, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+inflammation+are+two+sides+of+the+same+coin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and inflammation are two sides of the same coin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18351-18352 (2013).</li>
<li>Jiang, B. H., Rue, E., Wang, G. L., Roe, R., Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimerization%2C+DNA+binding%2C+and+transactivation+properties+of+hypoxia-inducible+factor+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Dimerization, DNA binding, and transactivation properties of hypoxia-inducible factor 1.</a> J Biol Chem. 271 (30), 17771-17778 (1996).</li>
<li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIF-1%3A+mediator+of+physiological+and+pathophysiological+responses+to+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia.</a> J Appl Physiol. 88 (4), 1474-1480 (2000).</li>
<li>Kallio, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+in+hypoxic+cells%3A+Inducible+nuclear+translocation+and+recruitment+of+the+CBP%2Fp300+coactivator+by+the+hypoxia-inducible+factor-1alpha%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Signal transduction in hypoxic cells: Inducible nuclear translocation and recruitment of the CBP/p300 coactivator by the hypoxia-inducible factor-1alpha.</a> EMBO J. 17 (22), 6573-6586 (1998).</li>
<li>Ke, Q., Costa, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16887934">Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1).</a> Mol Pharmacol. 70 (5), 1469-1480 (2006).</li>
<li>Gustafsson, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+requires+notch+signaling+to+maintain+the+undifferentiated+cell+state%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Hypoxia requires notch signaling to maintain the undifferentiated cell state.</a> Dev Cell. 9 (5), 617-628 (2005).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+with+factor+inhibiting+HIF-1+defines+an+additional+mode+of+cross-coupling+between+the+Notch+and+hypoxia+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interaction with factor inhibiting HIF-1 defines an additional mode of cross-coupling between the Notch and hypoxia signaling pathways.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3368-3373 (2008).</li>
<li>D'Ignazio, L., Bandarra, D., Rocha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappaB+and+HIF+crosstalk+in+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">NF-kappaB and HIF crosstalk in immune responses.</a> FEBS J. 283 (3), 413-424 (2016).</li>
<li>Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A., Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-inducible+factor+1+is+a+basic-helix-loop-helix-PAS+heterodimer+regulated+by+cellular+O2+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (12), 5510-5514 (1995).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+regulation+of+degradation+of+hypoxia-inducible+factor+1+alpha%3A+Role+of+subcellular+compartmentalization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific regulation of degradation of hypoxia-inducible factor 1 alpha: Role of subcellular compartmentalization.</a> Mol Cell Biol. 26 (12), 4628-4641 (2006).</li>
<li>Depping, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+translocation+of+hypoxia-inducible+factors+%28HIFs%29%3A+involvement+of+the+classical+importin+alpha%2Fbeta+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Nuclear translocation of hypoxia-inducible factors (HIFs): involvement of the classical importin alpha/beta pathway.</a> Biochim Biophys Acta. 1783 (3), 394-404 (2008).</li>
<li>Wei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+induces+oncogene+yes-associated+protein+1+nuclear+translocation+to+promote+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+invasion+via+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Tumour+Biol%22%5BJournal%5D)">Hypoxia induces oncogene yes-associated protein 1 nuclear translocation to promote pancreatic ductal adenocarcinoma invasion via epithelial-mesenchymal transition.</a> Tumour Biol. 39 (5), (2017).</li>
<li>Chang, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+promotes+nuclear+translocation+and+transcriptional+function+in+the+oncogenic+tyrosine+kinase+RON%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Hypoxia promotes nuclear translocation and transcriptional function in the oncogenic tyrosine kinase RON.</a> Cancer Res. 74 (16), 4549-4562 (2014).</li>
<li>Moriya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+nature+of+overexpression+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Quantitative nature of overexpression experiments.</a> Mol Biol Cell. 26 (22), 3932-3939 (2015).</li>
<li>Prelich, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+overexpression%3A+Uses%2C+mechanisms%2C+and+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Gene overexpression: Uses, mechanisms, and interpretation.</a> Genetics. 190 (3), 841-854 (2012).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Notch-independent+mechanism+contributes+to+the+induction+of+Hes1+gene+expression+in+response+to+hypoxia+in+P19+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A Notch-independent mechanism contributes to the induction of Hes1 gene expression in response to hypoxia in P19 cells.</a> Exp Cell Res. 358 (2), 129-139 (2017).</li>
<li>Farris, M. H., Ford, K. A., Doyle, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+and+quantitative+assays+for+detection+and+characterization+of+protein+antimicrobials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Qualitative and quantitative assays for detection and characterization of protein antimicrobials.</a> J Vis Exp. (110), e53819(2016).</li>
<li>Chilov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+nuclear+translocation+of+hypoxia-inducible+factor-1+%28HIF-1%29%3A+heterodimerization+with+ARNT+is+not+necessary+for+nuclear+accumulation+of+HIF-1alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Induction and nuclear translocation of hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1): heterodimerization with ARNT is not necessary for nuclear accumulation of HIF-1alpha.</a> J Cell Sci. 112 (Pt 8), 1203-1212 (1999).</li>
<li>Yin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arylsulfonamide+KCN1+inhibits+in+vivo+glioma+growth+and+interferes+with+HIF+signaling+by+disrupting+HIF-1alpha+interaction+with+cofactors+p300%2FCBP%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Arylsulfonamide KCN1 inhibits in vivo glioma growth and interferes with HIF signaling by disrupting HIF-1alpha interaction with cofactors p300/CBP.</a> Clin Cancer Res. 18 (24), 6623-6633 (2012).</li>
<li>Holmquist-Mengelbier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+HIF-1alpha+and+HIF-2alpha+to+common+target+genes+is+differentially+regulated+in+neuroblastoma%3A+HIF-2alpha+promotes+an+aggressive+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Recruitment of HIF-1alpha and HIF-2alpha to common target genes is differentially regulated in neuroblastoma: HIF-2alpha promotes an aggressive phenotype.</a> Cancer Cell. 10 (5), 413-423 (2006).</li>
<li>Koh, M. Y., Powis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passing+the+baton%3A+The+HIF+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Passing the baton: The HIF switch.</a> Trends Biochem Sci. 37 (9), 364-372 (2012).</li>
<li>Dumetz, A. C., Snellinger-O'brien, A. M., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+protein+protein+interactions+in+salt+solutions+and+implications+for+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Patterns of protein protein interactions in salt solutions and implications for protein crystallization.</a> Protein Sci. 16 (9), 1867-1877 (2007).</li>
<li>Graven, K. K., Troxler, R. F., Kornfeld, H., Panchenko, M. V., Farber, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+endothelial+cell+glyceraldehyde-3-phosphate+dehydrogenase+expression+by+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of endothelial cell glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase expression by hypoxia.</a> J Biol Chem. 269 (39), 24446-24453 (1994).</li>
<li>Caradec, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desperate+house+genes%27%3A+The+dramatic+example+of+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Desperate house genes': The dramatic example of hypoxia.</a> Br J Cancer. 102 (6), 1037-1043 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.

Kurulan-1 karmaşık Hücresel oksijen homeostazı bir ana Regülatörü ve genlerin farklı hücresel adaptif yanıt-e doğru hipoksi katılan bir bolluk düzenler. Kimliği roman kurulan-1 etkileşen proteinler hipoksik sinyal iletimi anlamak için önemlidir. Co-immunoprecipitation deneyleri genellikle PPIs çalışmaları için hücresel sinyal iletim yollarının betimlemek için kullanılır. Ancak, protein overexpression hala yaygın olarak kullanılır ve bu deneysel eserler yol açabilir. Buna ek olarak, kurulan-1α oldukça kararsız bir protein...

Yetersiz oksijen hücre ve vücut dokuları sağlandığında hipoksi oluşur. Kök hücre farklılaşması, inflamasyon ve kanser1,2gibi çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçler kritik bir rol oynar. Hipoksi-indüklenebilir faktörler (HIFs) oluşan bir oksijen düzenlenir α alt birim ve yapısal ifade β alt birim olarak da bilinen ARNT3heterodimers işlev. Kurulan-α alt birimleri (kurulan-1α, kurulan-2α ve kurulan-3α) ve üç kurulan-β alt birimleri (ARNT/kurulan-1β, ARNT2 ve ARNT3) üç izoformlarının bugüne kadar tespit edilmiştir. Kurulan 2α, kurulan-3α, ARNT2 ve ARNT3 daha ifade desenleri4ile ilgili bir kısıtlama ise kurulan-1α ve ARNT ubiquitously, ifade edilir. Kurulan-1 protein kompleksi hipoksi yanıt anahtar düzenleyicisidir. Hipoksik koşullarda kurulan-1α stabilize hale gelir, o zaman için çekirdek translocates ve ARNT5ile dimerizes. Daha sonra bu karmaşık hipoksi duyarlı öğeler (Xact_s_lastresourcemanager) olarak bilinen belirli nükleotit bağlar ve anjiogenezi, arttığından ve glikoliz6dahil olmak üzere çeşitli işlemlerde ilgili hedef genlerin ifade düzenler. Bu "kanonik" Yanıt yanı sıra, hipoksi sinyal yolu da crosstalk için birden çok hücre tepkisini yolları çentik ve nükleer faktör kappa B (NF-κB) gibi sinyal ile bilinen7,8,9.
Kimliği roman kurulan-1 etkileşen proteinlerin daha iyi yolu sinyal hipoksi anlamak için önemlidir. Oksijen seviyesi duyarsız ve yapısal ifade, ARNT aksine kurulan-1α protein düzeyleri sıkıca Hücresel oksijen düzeyleri tarafından düzenlenmektedir. Normoxia (% 21 oksijen) kurulan-1α hızla bozulmuş10,11proteinlerdir. Kurulan-1α kısa yarılanma normoxia, belirli teknik sorunlar hücre özleri protein tespiti için hem de kurulan 1α etkileşim proteinlerin tanımlanması için sunar. Ayrıca, hipoksik koşulları12,13,14altında çekirdek içine kurulan-1 kompleks de dahil olmak üzere çeşitli transkripsiyon faktörleri translocate. ÜFE çalışmaları için kullanılan geçerli yöntemlerin çoğu fizyolojik olmayan overexpression proteinlerin kullanarak gerçekleştirilir. Bu tür protein overexpression kaynak aşırı yük, stokiometrik dengesizlik, önüne gelenle yatıp kalkan etkileşimleri ve yol modülasyon15,16da dahil olmak üzere birden çok mekanizmalar aracılığıyla farklı hücresel kusurları neden olduğu bildirilmiştir. ÜFE çalışmalar açısından yanlış pozitif veya bile yanlış negatif, sonuçlarına bağlı olarak protein özellikleri ve işlevleri overexpressed proteinlerin protein overexpression yol açabilir. Bu nedenle, ÜFE çalışmaları için geçerli yöntemleri fizyolojik ilgili PPIs hipoksik koşullarda ortaya çıkarmak için değiştirilmesi gerekir. Daha önce kurulan-1 ve Ets aile transkripsiyon faktörü Hes1 organizatörü yanıt hipoksi17katkı GA-bağlayıcı protein (GABP) hipoksik P19 hücrelerdeki arasındaki etkileşimi göstermiştir. Burada, bir co-immunoprecipitation protokol hipoksik koşullarda endojen nükleer proteinler arasında PPIs çalışmaya açıklar. Kurulan-1α ve ARNT arasındaki etkileşimi kavramının bir kanıtı olarak gösterilir. Bu iletişim kuralı transkripsiyon faktörleri ve hipoksik koşullarda transkripsiyon Co düzenleyiciler arasındaki etkileşimleri gösteren için uygundur dahil ama bunlarla sınırlı olmamak üzere kurulan-1 etkileşen proteinler tanımlaması.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Malzeme< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.0 M Tris-HCl Tampon, pH 7.4&nbsp;</td><td>1. BASE</td><td>1415</td><td></td></tr><tr><td>Protein A/G Sefaroz boncuk</td><td>Abcam</td><td>ab193262</td><td></td></tr><tr><td>Doğal Fare IgG proteini</td><td>Abcam</td><td>ab198772</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bio-Rad</td><td>1610729</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli Numune Tamponu</td><td>Bio-Rad</td><td>1610737</td><td></td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Bio-Rad</td><td>1610710</td><td></td></tr><tr><td>Nitroselüloz Membran &nbsp; &nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>Kurutma Dereceli Engelleyici</td><td>Bio-Rad</td><td>1706404</td><td>Western blotting uygulamaları için yağsız kuru süt</td></tr><tr><td>10x Tris Tamponlu Salin (TBS)</td><td>Bio-Rad</td><td>1706435</td><td></td></tr><tr><td>%10 Tween 20</td><td>Bio-Rad</td><td>1610781</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/Glisin/SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/Glisin Tamponu&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1610771</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Çift Renk Standartları</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374</td><td></td></tr><tr><td>Anti-tavşan IgG, HRP'ye bağlı Antikor Hücre</td><td>Sinyali</td><td>7074</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare IgG, HRP'ye bağlı Antikor&nbsp;</td><td>Hücre Sinyalizasyonu</td><td>7076</td><td></td></tr><tr><td>SignalFire ECL Reaktifi</td><td>Hücre Sinyalizasyonu</td><td>6883</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetilsülfonil florür (PMSF)</td> <td>Merck Millipore</td><td>52332</td><td></td></tr><tr><td>ARNT / HIF-1 beta Antikoru &nbsp;</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-124&nbsp;</td><td>Konsantrasyon: 1.4 mg / mL</td></tr><tr><td>HIF-1 alfa Antikoru</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-479</td><td>Konsantrasyon: 1.0 mg/mL</td></tr><tr><td>YY1 Antikor</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-46218</td><td>Konsantrasyon: 0.2 mg/mL</td></tr><tr><td>Qproteome Nükleer Protein Kiti</td><td>Qiagen</td><td>37582</td><td>Lizis tamponu NL ve Ekstraksiyon Tamponu NX1 kitte sunulmaktadır</td></tr><tr><td>GAPDH Antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-47724</td><td>Konsantrasyon: 0.2 mg/mL</td></tr><tr><td>Gliserol (&ge; %99)</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>RIPA tamponu</td><td>Sigma</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür (NaCl)</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>127087-87-0</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s değiştirilmiş Kartal' s orta (DMEM, 4.5 g / L glikoz)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0861</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>HEK293A hücre hattı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R70507</td><td></td></tr><tr><td>Metanol ve nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Proteaz İnhibitörü Tabletleri&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88660</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Test Kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>QSP jel yükleme ucu&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific QSP</td><td># 010-R204-Q-PK</td><td>1-200 uL</td></tr> <tr><td>< güçlü > Ekipman / Enstrüman< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Kalın Leke Filtre Kağıdı, Önceden Kesilmiş, 7,5 x 10 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>1703932</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN&nbsp; Mini Prekast Jeller için Tetra Dikey Elektroforez Hücresi, Mini Trans-Blot ile&nbsp; Modül ve PowerPac Temel Güç Kaynağı</td><td>Bio-Rad</td><td>1658034</td><td></td></tr><tr><td>4&ndash; %15 Mini-PROTEAN TGX Prekast Protein Jelleri</td><td>Bio-Rad</td><td>4561083</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc XRS+ Sistemi</td><td>Bio-Rad</td><td>1708265</td><td></td></tr><tr><td>I-Glove</td><td>BioSpherix</td><td>I-Glove</td><td></td></tr><tr><td>Synergy HTX Çok Modlu Mikroplaka Okuyucu&nbsp;</td><td>BioTek</td><td>BTS1LFTA</td><td></td></tr><tr><td>Costar 5 mL Stripet Serolojik Pipetler</td><td>Corning</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>Costar 10 mL Stripette Serolojik Pipetler</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Costar 25 mL Stripette Serolojik Pipetler</td><td>Corning</td><td>4251</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 Kuyulu Şeffaf Alt Siyah Polistiren</td><td>Mikroplakalar Corning</td><td>3631</td><td></td></tr><tr><td>15mL Yüksek Berraklık PP konik Santrifüj Tüpleri</td><td>Corning</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>Küçük Hücreli Kazıyıcı</td><td>Corning</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>Gilson&nbsp; Pipetman L 4'lü pipet seti&nbsp;</td><td>Gilson</td><td>F167370</td><td>P2, P20, P200, P1000 ve aksesuarları</td></tr><tr><td>1.5 mL Polipropilen Mikrosantrifüj Tüpleri</td><td>Greiner Bio-One&nbsp;</td><td></td><td></td>616201</tr><tr><td>PIPETBOY acu 2 Pipetleyici</td><td>INTEGRA Biosciences</td><td>155 000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Justrite Yanıcı Sıvı Saklama Dolapları</td><td>Justrite İmalat A.Ş.</td><td>896000</td><td></td></tr><tr><td>Vorteks karıştırıcı</td><td>Labnet</td><td>S0200</td><td></td></tr><tr><td>CO2 inkübatörü</td><td>NuAire</td><td>NU-5820</td><td></td></tr><tr><td>Orbital çalkalayıcılar</td><td>Stuart</td><td>SSL1</td><td></td></tr><tr><td>Tüp döndürücü SB3</td><td>Stuart</td><td>SB3</td><td></td></tr><tr><td>MicroCL 21R Mikrosantrifüj</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>75002470</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST 16 Santrifüj</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>75004240</td><td></td></tr><tr><td>Doku Kültürü Kapları (100 mm)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer MINI Diyaliz Cihazı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69580</td><td>10K MWCO, 0.1 mL</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer MINI Diyaliz Cihazları için 0.1 mL Şamandıralar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69588</td><td></td></tr><tr><td>LSE Dijital Kuru Banyo Isıtıcıları</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1168H25</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&nbsp; 1300 Serisi A2 Sınıf II, Tip A2 Biyo Güvenlik Kabinleri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-261-308</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Lab Yazılımı</td><td>Bio-Rad</td><td>1709691</td><td></td></tr></tbody></table>

co-immunoprecipitation tahlil hipoksik koşullarda kültürlü hücrelerden endojen nükleer proteinler kullanarak

Co-immunoprecipitation Assay Using Endogenous Nuclear Proteins from Cells Cultured Under Hypoxic Conditions

Düşük oksijen düzeyleri (hipoksi) hipoksi-indüklenebilir faktörü 1 (kurulan-1) bir ana düzenleyici hareket karmaşık adaptif yanıt çeşitli tetikler. Kurulan-1 bir heterodimeric oksijen düzenlenir α birimi (kurulan-1α) oluşur ve yapısal genler angiogenez dahil olmak üzere çeşitli işlemlerde dahil düzenleyen β alt birim (kurulan-1β) olarak da bilinen aril hidrokarbon reseptör nükleer ışınlama (ARNT), ifade , arttığından ve glikoliz. Kurulan-1 etkileşen proteinler tanımlaması yolu sinyal hipoksi anlama anahtarıdır. Kurulan-1α istikrar düzenlemenin yanı sıra, hipoksi da kurulan-1α ve ARNT dahil olmak üzere birçok transkripsiyon faktörleri nükleer translocation tetikler. Özellikle, bu tür protein-protein etkileşimleri (PPIs) eğitim için kullanılan geçerli yöntemlerin çoğu nerede protein düzeyleri Yapay protein overexpression artan sistemleri temel alır. Protein overexpression kez zamansal ve mekansal yapılardan kaynaklanan fizyolojik olmayan sonuçlara yol açar. Burada biz değiştirilmiş bir co-immunoprecipitation tarif protokol endojen nükleer proteinler hipoksi tedavi sonrasında ve kurulan-1α ve ARNT arasındaki etkileşimi göstermek için kavramının bir kanıtı olarak. Bu iletişim kuralı, hipoksik hücrelerin hipoksik koşullarda hasat edildi ve Dulbecco'nın Phosphate-Buffered serum fizyolojik (DPBS) yıkama arabellek ayrıca protein yıkımı veya protein kompleksi azaltmak için kullanımdan önce hipoksik koşulları için önceden denge ayrılma sırasında reoxygenation. Ayrıca, nükleer kesirler daha sonra konsantre ve endojen nükleer proteinler stabilize ve sık görülen bir protein overexpression sırasında olası sahte sonuçları önlemek için elde. Bu iletişim kuralı transkripsiyon faktörleri ve transkripsiyon Co düzenleyiciler hipoksik koşullarda endojen ve yerel Hofstede göstermek için kullanılabilir.

Hücresel yanıt hipoksi, ifade olarak değerlendirmek için düzeyleri ve kurulan-1 karmaşık aşağıdaki hipoksi tedavi bileşenlerinin hücre altı yerelleştirme incelenmiş. HEK293A hücreleri 4 h için hipoksik koşullarda kültürlü veya normoxia denetimler olarak devam etti. Bütün hücre içinde kurulan-1α ve ARNT protein düzeyleri incelenmiş veya nükleer/sitoplazmik tarafından western blot ayıklar. Toplam hücresel lysates ARNT düzeyleri önemli ölçüde değildi, ancak beklenen, toplam kurulan-1α düzeyl...

Burada bir co-immunoprecipitation protokol hipoksik koşullarda endojen nükleer proteinler arasındaki protein-protein etkileşimler çalışmaya açıklar. Bu yöntem gösteri transkripsiyon faktörleri ve hipoksi, transkripsiyon Co düzenleyiciler arasındaki etkileşimler için uygundur.

Co-immunoprecipitation tahlil hipoksik koşullarda kültürlü hücrelerden endojen nükleer proteinler kullanarak

Low oxygen levels (hypoxia) trigger a variety of adaptive responses with the Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complex acting as a master regulator. ...

Bu yöntem, hipoksik koşullar altında transkripsiyon faktörleri ve bunların transkripsiyonel koregülatörleri arasındaki endojen ve doğal etkileşimler gibi hipoksik alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, hipoksik hücrelerin hipoksik koşullar altında toplanması ve nükleer fraksiyonların ko-immünopresipitasyon için kullanılmasıdır. Bu protokol, dört adet 10 santimetrelik tabakta büyütülen insan embriyonik böbrek 293A hücrelerini kullanır.% 10 FBS, L-glutamin, sodyum piruvat, penisilin ve streptomisin ile desteklenmiş Dulbeco'nun modifiye edilmiş Eagle's besiyerinde 10 mililitre tabak başına üç ila beş kez altıncı hücreye tohum atın. Hücreleri 37 santigrat derece% 5 karbondioksit inkübatörde kültürleyin. Tohumlamadan yirmi dört saat sonra, hücreler% 80 ila% 90 birleşmeye ulaştığında, dört saat boyunca% 1 santigrat derecede% 1 ve% 5 karbondioksit içeren inkübatör torpido gözündeki hipoksi alt odasına iki tabak koyun.Diğer iki yemeği normoxia'da tutun. Hipoksi ile tedavi edilen hücrelerin toplanmasından bir gün önce, 24 saat boyunca hipoksi alt odasına DPBS ile doldurulmuş üstü açık 100 mililitrelik bir deney camı reaktif şişesi yerleştirerek DPBS'yi hipoksik koşullara önceden dengeleyin. Hücrelerin toplanmasından yaklaşık bir saat önce, torpido gözünün %1 oksijen ve %5 karbondioksit ile dengelenmiş, işlem odasına buz içeren bir buz kutusu yerleştirin.Önceden dengelenmiş hipoksik DPBS'yi içeren şişeyi hipoksi alt odasından işleme odasına aktarın ve buzun üzerine yerleştirin. Hipoksi tedavisinden dört saat sonra, hücreleri hipoksi alt odasından% 1 oksijen ve% 5 karbondioksit ile önceden dengelenmiş işlem odasına aktarın. Kültür ortamını aspirasyonla çıkarın ve 10 mililitrelik bir pipetle, hücreleri bir kez 10 mililitre buz gibi önceden dengelenmiş hipoksik DPBS ile durulayın.Beş mililitrelik bir pipet kullanarak, 5 mililitre buz gibi önceden dengelenmiş DPBS ekleyin ve hücreleri bir hücre kazıyıcı ile kazıyarak yerinden çıkarın. Hücre kültürü plakasını eğin, ayrılan hücreleri 10 mililitrelik bir pipet kullanarak toplayın ve hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Hücre tüpünü buz üzerinde tutun.Her ikisi de %1 oksijen ve %5 karbondioksit ile önceden dengelenmiş olan torpido gözündeki işleme ve tampon odaları arasındaki kapıyı açın. Hipoksi ile muamele edilmiş hücreler içeren buz üzerindeki 15 mililitrelik konik tüpleri işlem odasından tampon odasına aktarın. Tampon bölmesinin kapısını açın ve hücreleri torpido gözünden tamamen çıkarın.Hem hipoksik hücreleri hem de normoksik hücreleri, dört santigrat derecede beş dakika boyunca 1000 kez g'de santrifüjleme ile peletleyin. Bu prosedür için bir nükleer ekstraksiyon kiti kullanılacaktır. Her hücre peletini 500 mikrolitre lizis tamponu NL'de nazikçe yeniden süspanse ederek başlayın, birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek 0.1 molar DTT'de 1X proteaz inhibitör kokteyli ile desteklenmiştir.Hücre süspansiyonuna 25 mikrolitre deterjan çözeltisi NP ekleyin ve maksimum hızda 10 saniye boyunca girdap yapın. Beş dakika boyunca dört santigrat derecede 1000 kez 10 g santrifüjleyin. Hem süpernatanı hem de nükleer peleti kurtarın.Süpernatanı metin protokolünde tarif edildiği gibi topladıktan ve sakladıktan sonra, pelet içeren hücre çekirdeklerini 500 mikrolitre lizis tamponu NL'de yeniden süspanse edin, 1X proteaz inhibitör kokteyli ve 0.1 molar DTT ile maksimum hızda beş saniye boyunca girdaplama ile desteklenmiştir. Nükleer peleti, peleti birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek 1X proteaz inhibitör kokteyli ile desteklenmiş 50 mikrolitre ekstraksiyon tamponu NX1'de yeniden süspanse edin. 30 dakika buz üzerinde kuluçkaya yatırın.Her beş dakikada bir, maksimum hızda 10 saniye boyunca girdap. 10 dakika boyunca dört santigrat derecede 12.000 x g'de santrifüjleyin. Süpernatanı toplayın ve tuzdan arındırma için birim başına maksimum 100 mikrolitre hacimli mini diyaliz cihazlarına aktarın.Mini diyaliz cihazlarının kapağını kapatın ve bir yüzdürme cihazına yerleştirin. Yüzdürme cihazını 500 mililitre önceden soğutulmuş diyaliz tamponu içeren bir behere koyun. PMSF içerdiğinden cilt ile doğrudan temastan veya diyaliz tamponunun solunmasından kaçınmaya dikkat edin.30 dakika hafifçe karıştırarak dört santigrat derecede inkübe edin. 30 dakika sonra, mini diyaliz cihazlarının köşesinden numuneleri toplayın ve yeni 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine aktarın. 10 dakika boyunca dört santigrat derecede 12 bin kez g santrifüjleyin.Her süpernatanın 25 mikrolitresini 1.5 mikrolitrelik bir santrifüj tüpüne koyun ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. İmmünopreciptasyonda kullanılacak protein AG sefaroz boncuklarını hazırlayın. Dört adet 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpünün her birine 50 mikrolitra boncuk pipetleyin ve tüp başına 500 mikrolitre DPBS tamponu ekleyin.Boncukları santrifüjleme ile peletleyin. Süpernatanı atın ve boncukları 100 mikrolitre TBS tamponunda yeniden süspanse edin. 500 mikrolitre TBS tamponunda 0.7 miligram fare IgG'nin yeniden oluşturulmasıyla hazırlanan iki mikrolitre fare monoklonal anti-ARNT antikoru veya fare immünoglobulin G ekleyin.Boncukları içeren mikrosantrifüj tüplerini soğuk bir odaya alın. Bunları bir tüp döndürücüye yerleştirin ve iki saat boyunca 10 rpm'de inkübe edin. İki saat sonra, boncukları santrifüjleme ile pellet yapın ve süpernatanları atın.Daha önce hazırlanan 200 mikrogram nükleer protein lizatını 800 mikrolitre immünopresipitasyon tamponunda seyreltin. Lizatı, antikora bağlı boncuklarla gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, boncukları dört santigrat derecede iki dakika boyunca 3000 kez g santrifüjleme ile peletleyin.Süpernatanı atın. Her tüpe %0.2 NP-40 içeren bir mililitre buz gibi soğuk TBS ekleyin ve aşağı doğru döndürün. Bu şekilde, boncukları% 0.2 NP-40 içeren buz gibi soğuk TBS ile üç kez yıkayın.Boncukları 50 mikrolitre Laemmli numune tamponunda 95 santigrat derecede beş dakika kaynatın. Boncukları beş dakika boyunca dört santigrat derecede 10 bin kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı toplayın ve boncukları atın.Hipoksi tedavisini takiben HIF-1 kompleksinin bileşenlerinin hücre altı lokalizasyonundaki ekspresyon seviyeleri HEK293A hücrelerde incelendi. Beklendiği gibi, toplam HIF-1a seviyeleri hipoksi ile yukarı regüle edilirken, toplam hücresel lizatlardaki ARNT seviyeleri önemli ölçüde değişmedi. Ek olarak, hipoksi hem HIF-1a hem de ARNT'nin nükleer birikimine neden oldu.Ko-immünopresipitasyon deneyleri, normoksik veya hipoksik koşullara maruz kalan HEK293A hücrelerden alınan nükleer ekstraktlar kullanılarak gerçekleştirildi. Burada gösterildiği gibi, HIF-1a, hipoksik HEK293A hücrelerinin nükleer ekstraktlarından ARNT ile birlikte immünopresipite edildi, bu da HIF-1a'nın hipoksik koşullar altında ARNT ile etkileşime girdiğini gösterdi. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, hipoksi alanındaki araştırmacıların endojen nükleer protein protein etkileşimlerini ve hipoksik durumlarını keşfetmelerinin yolunu açtı.

co-immunoprecipitation-assay-using-endogenous-nuclear-proteins-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada kültürlerin hipoksik durumunu değerlendirmek için, hücre kültürleri ve basit testler hipoksi ikna etmek için basit yöntemler öneriyoruz.

Hücre Kültürü ve Hipoksi Test İndüksiyon

Bu video, protein-DNA etkileşimlerini göstermek için klasik bir teknik olan kromatin immünopresipitasyon (ChIP) testi için protokolü açıklar. Bu teknik, insan kronik lenfositik lösemi hücrelerindeki hedef genleri tanımlamak için kullanılır.

Kromatin İmmünopresipitasyon Deneyi: Hücrelerde Protein-DNA Etkileşimlerini İncelemek İçin Bir Teknik

Biz primer T hücreleri kullanarak kromatin immunoprecipitation için bir sağlam bir yöntem tarif. Metodu standart yaklaşımlar üzerine kurulmuştur, ama hücrelerin sınırlı bir miktarda için verimliliği artırmak koşulları ve reaktifler belirli bir kümesi kullanır edilir. Önemli olarak, veriler analiz aşaması bölgesinin, bir ayrıntılı bir açıklama sunulmaktadır edilir.

Biyokütle Limit Tutarlar kullanarak Verimli Kromatin Immunoprecipitation

Biz, hipokampusun CA1 bölgesinde ve dilimin tetanized alan nükleer zenginleştirilmiş kısımların daha sonraki izolasyon Uzun süreli potansiyasyon indüksiyonu için ayrıntılı bir protokol sağlar. Bu yaklaşım, önemli aktivitesini öğrenme ve hafıza ile hücresel modellerinde bağımlı nükleer protein alma belirlemek için kullanılabilir.

Hipokampal Dilimleri adlı CA1 Nükleer Zenginleştirilmiş Kesirler izolasyonu Synapto-nükleer Messenger Proteinler Etkinliği-bağımlı Nükleer İthalat Okuyacak

Bu görüntüleme kullanılarak hipoksi küresel RNA sentez analizi için bir tekniği açıklar. RNA tıklayın-kimya etiketleme önceden hipoksi altında gerçekleştirilen ve tek hücre düzeyinde küresel RNA değişikliklerin görselleştirme sağlar olmamıştır. Bu yaklaşım, küresel RNA sentezinde hücreden hücreye değişiklik doğrudan görselleştirme sağlayan, mevcut ortalama RNA tekniklerinin tamamlar.

Ününüz Aşağıdaki Tek Hücre Düzeyinde Küresel RNA Sentezi Analizi

Bu el yazması, ökaryotik hücrelerde oluşan seçilmiş akraba RNP'leri spesifik bir oligonükleotid yönelimli zenginleştirme yoluyla izole etmek için bir yaklaşımı açıklar. Bu yaklaşımın uygulanabilirliğini, DHX9/RNA helikaz A'dan oluşan retroviral 5' çevrilmemiş bölgeye bağlı bir akraba RNP'yi izole ederek gösteriyoruz.

Oligonükleotid yönelik elüsyon kullanılarak Hücreler Aynı Kökenli RNA-protein kompleksleri izolasyonu

Protein-protein etkileşimleri bir hücrenin hem çekirdeğinde hem de sitoplazmasında meydana gelebilir. Bu etkileşimleri araştırmak için geleneksel ko-immünopresipitasyon ve modern yakınlık ligasyon testi uygulanır. Bu çalışmada, NF90-RBM3 etkileşimlerinin çekirdek ve sitoplazmadaki dağılımını görselleştirmek için bu iki yöntemi karşılaştırıyoruz.

Co-immunoprecipitation tarafından Nükleer ve Sitoplazmik Kesirler Protein-protein Etkileşim görselleştirme ve<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity ligasyon Testi

Birden çok araştıran, endojen translasyonel modifikasyonlar hedef protein için son derece zor olabilir. Burada açıklanan teknikleri belirli PTM hedeflemede, benzeşim matrisler bir hedef için asetilasyon, ubiquitination, SUMOylation 2/3 ve tirozin fosforilasyon değişiklikleri algılamak için geliştirilen bir en iyi duruma getirilmiş lizis tampon ve filtre sistemi kullanmak protein tek ve akıcı bir sistem kullanarak.

Bir endojen translasyonel modifikasyon profil hedef proteinler için tanımlamak için bir kapsamlı Immunoprecipitation zenginleştirme sistemi kullanan

Açıklanan ilgi ve etiket-free kütle spektrometresi belirli bir protein in immünafinite zenginleştirme kullanarak bir nükleer hücre altı fraksiyonu protein etkileşim ortakları tanımlamak için bir proteomik iş akışıdır. İş akışı hücre altı fraksiyonu, immünoprepitasyon, filtre destekli numune hazırlama, çevrimdışı temizleme, kütle spektrometresi ve aşağı akım biyoinformatik boru hattını içerir.

Büyük Ölçekli Nükleer Etkileşimom Profilleme için Etiketsiz İmmünoprekütle Spektrometresi İş Akışı

Burada, yüksek metabolik proksimal tübüler epitel hücrelerinde hipoksi/reoksijenasyon hasarını modellemek için in vitro bir protokolü tanımlıyoruz. Bu model, proksimal tübul hasar belirteçlerinin ekspresyonu ve mitokondriyal solunum fonksiyonunun değerlendirilmesi yoluyla ölçülebilen metabolik stres kaynaklı hasarı indüklemek için tasarlanmıştır.

Proksimal tübüler epitel hücrelerinde hipoksi/reoksijenlenme yaralanmasının modellenmesi

Keşfedin, hipoksik koşullarda endojen nükleer protein etkileşimlerini incelemek için co-immunoprecipitation yöntemini. Bu teknik, transkripsiyon faktörleri ve eş düzenleyiciler arasındaki etkileşimleri HEK293A hücrelerinde çalışır.

Co-immunoprecipitation tahlil hipoksik koşullarda kültürlü hücrelerden endojen nükleer proteinler kullanarak

Daha fazla video keşfet