Co-immunoprecipitation tahlil hipoksik koşullarda kültürlü hücrelerden endojen nükleer proteinler kullanarak

Bu yöntem, hipoksik koşullar altında transkripsiyon faktörleri ve bunların transkripsiyonel koregülatörleri arasındaki endojen ve doğal etkileşimler gibi hipoksik alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, hipoksik hücrelerin hipoksik koşullar altında toplanması ve nükleer fraksiyonların ko-immünopresipitasyon için kullanılmasıdır. Bu protokol, dört adet 10 santimetrelik tabakta büyütülen insan embriyonik böbrek 293A hücrelerini kullanır.

% 10 FBS, L-glutamin, sodyum piruvat, penisilin ve streptomisin ile desteklenmiş Dulbeco'nun modifiye edilmiş Eagle's besiyerinde 10 mililitre tabak başına üç ila beş kez altıncı hücreye tohum atın. Hücreleri 37 santigrat derece% 5 karbondioksit inkübatörde kültürleyin. Tohumlamadan yirmi dört saat sonra, hücreler% 80 ila% 90 birleşmeye ulaştığında, dört saat boyunca% 1 santigrat derecede% 1 ve% 5 karbondioksit içeren inkübatör torpido gözündeki hipoksi alt odasına iki tabak koyun.

Diğer iki yemeği normoxia'da tutun. Hipoksi ile tedavi edilen hücrelerin toplanmasından bir gün önce, 24 saat boyunca hipoksi alt odasına DPBS ile doldurulmuş üstü açık 100 mililitrelik bir deney camı reaktif şişesi yerleştirerek DPBS'yi hipoksik koşullara önceden dengeleyin. Hücrelerin toplanmasından yaklaşık bir saat önce, torpido gözünün %1 oksijen ve %5 karbondioksit ile dengelenmiş, işlem odasına buz içeren bir buz kutusu yerleştirin.

Önceden dengelenmiş hipoksik DPBS'yi içeren şişeyi hipoksi alt odasından işleme odasına aktarın ve buzun üzerine yerleştirin. Hipoksi tedavisinden dört saat sonra, hücreleri hipoksi alt odasından% 1 oksijen ve% 5 karbondioksit ile önceden dengelenmiş işlem odasına aktarın. Kültür ortamını aspirasyonla çıkarın ve 10 mililitrelik bir pipetle, hücreleri bir kez 10 mililitre buz gibi önceden dengelenmiş hipoksik DPBS ile durulayın.

Beş mililitrelik bir pipet kullanarak, 5 mililitre buz gibi önceden dengelenmiş DPBS ekleyin ve hücreleri bir hücre kazıyıcı ile kazıyarak yerinden çıkarın. Hücre kültürü plakasını eğin, ayrılan hücreleri 10 mililitrelik bir pipet kullanarak toplayın ve hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Hücre tüpünü buz üzerinde tutun.

Her ikisi de %1 oksijen ve %5 karbondioksit ile önceden dengelenmiş olan torpido gözündeki işleme ve tampon odaları arasındaki kapıyı açın. Hipoksi ile muamele edilmiş hücreler içeren buz üzerindeki 15 mililitrelik konik tüpleri işlem odasından tampon odasına aktarın. Tampon bölmesinin kapısını açın ve hücreleri torpido gözünden tamamen çıkarın.

Hem hipoksik hücreleri hem de normoksik hücreleri, dört santigrat derecede beş dakika boyunca 1000 kez g'de santrifüjleme ile peletleyin. Bu prosedür için bir nükleer ekstraksiyon kiti kullanılacaktır. Her hücre peletini 500 mikrolitre lizis tamponu NL'de nazikçe yeniden süspanse ederek başlayın, birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek 0.1 molar DTT'de 1X proteaz inhibitör kokteyli ile desteklenmiştir.

Hücre süspansiyonuna 25 mikrolitre deterjan çözeltisi NP ekleyin ve maksimum hızda 10 saniye boyunca girdap yapın. Beş dakika boyunca dört santigrat derecede 1000 kez 10 g santrifüjleyin. Hem süpernatanı hem de nükleer peleti kurtarın.

Süpernatanı metin protokolünde tarif edildiği gibi topladıktan ve sakladıktan sonra, pelet içeren hücre çekirdeklerini 500 mikrolitre lizis tamponu NL'de yeniden süspanse edin, 1X proteaz inhibitör kokteyli ve 0.1 molar DTT ile maksimum hızda beş saniye boyunca girdaplama ile desteklenmiştir. Nükleer peleti, peleti birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek 1X proteaz inhibitör kokteyli ile desteklenmiş 50 mikrolitre ekstraksiyon tamponu NX1'de yeniden süspanse edin. 30 dakika buz üzerinde kuluçkaya yatırın.

Her beş dakikada bir, maksimum hızda 10 saniye boyunca girdap. 10 dakika boyunca dört santigrat derecede 12.000 x g'de santrifüjleyin. Süpernatanı toplayın ve tuzdan arındırma için birim başına maksimum 100 mikrolitre hacimli mini diyaliz cihazlarına aktarın.

Mini diyaliz cihazlarının kapağını kapatın ve bir yüzdürme cihazına yerleştirin. Yüzdürme cihazını 500 mililitre önceden soğutulmuş diyaliz tamponu içeren bir behere koyun. PMSF içerdiğinden cilt ile doğrudan temastan veya diyaliz tamponunun solunmasından kaçınmaya dikkat edin.

30 dakika hafifçe karıştırarak dört santigrat derecede inkübe edin. 30 dakika sonra, mini diyaliz cihazlarının köşesinden numuneleri toplayın ve yeni 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine aktarın. 10 dakika boyunca dört santigrat derecede 12 bin kez g santrifüjleyin.

Her süpernatanın 25 mikrolitresini 1.5 mikrolitrelik bir santrifüj tüpüne koyun ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. İmmünopreciptasyonda kullanılacak protein AG sefaroz boncuklarını hazırlayın. Dört adet 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpünün her birine 50 mikrolitra boncuk pipetleyin ve tüp başına 500 mikrolitre DPBS tamponu ekleyin.

Boncukları santrifüjleme ile peletleyin. Süpernatanı atın ve boncukları 100 mikrolitre TBS tamponunda yeniden süspanse edin. 500 mikrolitre TBS tamponunda 0.7 miligram fare IgG'nin yeniden oluşturulmasıyla hazırlanan iki mikrolitre fare monoklonal anti-ARNT antikoru veya fare immünoglobulin G ekleyin.

Boncukları içeren mikrosantrifüj tüplerini soğuk bir odaya alın. Bunları bir tüp döndürücüye yerleştirin ve iki saat boyunca 10 rpm'de inkübe edin. İki saat sonra, boncukları santrifüjleme ile pellet yapın ve süpernatanları atın.

Daha önce hazırlanan 200 mikrogram nükleer protein lizatını 800 mikrolitre immünopresipitasyon tamponunda seyreltin. Lizatı, antikora bağlı boncuklarla gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, boncukları dört santigrat derecede iki dakika boyunca 3000 kez g santrifüjleme ile peletleyin.

Süpernatanı atın. Her tüpe %0.2 NP-40 içeren bir mililitre buz gibi soğuk TBS ekleyin ve aşağı doğru döndürün. Bu şekilde, boncukları% 0.2 NP-40 içeren buz gibi soğuk TBS ile üç kez yıkayın.

Boncukları 50 mikrolitre Laemmli numune tamponunda 95 santigrat derecede beş dakika kaynatın. Boncukları beş dakika boyunca dört santigrat derecede 10 bin kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı toplayın ve boncukları atın.

Hipoksi tedavisini takiben HIF-1 kompleksinin bileşenlerinin hücre altı lokalizasyonundaki ekspresyon seviyeleri HEK293A hücrelerde incelendi. Beklendiği gibi, toplam HIF-1a seviyeleri hipoksi ile yukarı regüle edilirken, toplam hücresel lizatlardaki ARNT seviyeleri önemli ölçüde değişmedi. Ek olarak, hipoksi hem HIF-1a hem de ARNT'nin nükleer birikimine neden oldu.

Ko-immünopresipitasyon deneyleri, normoksik veya hipoksik koşullara maruz kalan HEK293A hücrelerden alınan nükleer ekstraktlar kullanılarak gerçekleştirildi. Burada gösterildiği gibi, HIF-1a, hipoksik HEK293A hücrelerinin nükleer ekstraktlarından ARNT ile birlikte immünopresipite edildi, bu da HIF-1a'nın hipoksik koşullar altında ARNT ile etkileşime girdiğini gösterdi. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, hipoksi alanındaki araştırmacıların endojen nükleer protein protein etkileşimlerini ve hipoksik durumlarını keşfetmelerinin yolunu açtı.