Plazma zarı periferik ilişkili proteinler için bölümleme belirlenmesi

Bu yöntem, hücre sinyal yollarının çözülmesi de dahil olmak üzere hücre biyolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Dolayısıyla bu tekniğin ana avantajı, aslında herhangi bir sofistike, mikroskobik yaklaşım gerektirmemesidir. Aynı zamanda çok hızlıdır ve bu nedenle hücrelerdeki protein dağılımının gerçek zamanlı olarak gözlemlenmesi için kullanılabilir.

Periferik olarak ilişkili proteinin membran bölünmesinin değerlendirilmesi ve miktarının belirlenmesi, mikroskop altında plazma membranı ve sitoplazmik floresan karışımına neden olan ışık kırınımı nedeniyle karmaşıktır. Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı gibi biyolojik materyalin hazırlanması ile başlayın. Hazırlanan malzemeyi, çalışılan malzemeye uygun bir boyama protokolü uygulayarak FM 4-64 boya ile boyayın.

Tütün BY-2 hücreleri için, 200 mikrolitre hücre süspansiyonunu dimetil sülfoksit içinde 0.2 mikrolitre 10 milimolar FM 4-64 çözeltisi ile boyayın. Bir hücre başına bir ekvatoral konfokal bölümü yakalamak için, protein etiketi olarak kullanılan kromofor ve FM 4-64 için sıralı iki kanallı bir tarama ayarlayın. Ayrıca daha yüksek bir optik çözünürlük ayarlayın.

Örnek bir kurulum, 1.3 sayısal diyafram açıklığına ve 1.024 x 1.024 piksel görüntü boyutuna sahip 63 kez yağa daldırma hedefidir. Fiji ImageJ Dağıtımını ve gerekli makro çevre birimini yükleyin. Fiji'de eklentileri, ardından makroları seçin, ardından ana menüye yükle'yi seçin ve ImageJ makro çevre birimi ile indirilen dosyanın yolunu belirtin.

R Project yazılımını ve gerekli paketleri yükleyin. R Grafiksel Kullanıcı Arabirimi'ni çalıştırın, paketleri seçin, ardından ana menüde paketleri kurun ve kurulum için en yakın depoyu ve ggplot2 paketini belirtin. R Paketi çevre birimini indirin.

Paketleri seçerek bunları yükleyin, ardından yerel dosyalardan paketleri yükleyin. Sitoplazmik markörün konfokal görüntülerini işleyin. Bunu yapmak için, eklentileri ve ardından biyoformatları, ardından varsayılan ayarlarla Fiji menüsünden biyoformat içe aktarıcıyı kullanarak görüntüleri Fiji'ye aktarın.

Bir çözümleme kurulumu için içeri aktarma seçenekleri makrosunu çalıştırın. Menü aracı periferik protein menüsüne tıkladıktan sonra aynı öğeyi seçerek makroyu etkinleştirin. Gauss bulanıklık yarıçapı pikseli alanında uygun değeri tanımlayın.

Bu, resim yumuşatmayı ve gürültü azaltmayı etkiler. Düşük bir değer yeterlidir ve herhangi bir görüntü bilgisi kaybına neden olmaz. Şimdi alan profili çizgi genişliği pikselinde bir değer ayarlayın.

Daha kalın bir çizgi, profil eğrilerinin daha fazla düzgünleştirilmesine neden olur. Varsayılan değer olarak 10 piksel önerilir. Örnek sınırlayıcıların ve dışa aktarılan öğelerin tanımına göre ayrıştırarak bir görüntü başlığı ayarlayın.

Tamam'a tıklayın. Bir sonraki iletişim penceresinde başlık ayrıştırmasını kontrol edin ve sıfırlamak için Tamam'ı veya geri tıklayın. Ardından, işlenen görüntülerde plazma zarı bölgesi boyunca doğrusal bir seçim yapın ve floresan profillerini ölçün. Bunu yapmak için, Fiji araç çubuğundan Fiji aracının düz çizgisini seçin.

Resme tıklayın ve plazma zarı bölgesi boyunca bir çizgi sürükleyin. Çizgi, hücre dışı boşlukta başlamalı ve plazma zarına dik olmalıdır. Daha kalın ve daha homojen bir kortikal sitoplazma tabakasına sahip bölgeleri seçin.

Doğrusal seçimin en uygun uzunluğu beş ila 10 mikrondur. Fiji araç çubuğundaki profil al aracını tıklayarak profil al makrosunu çalıştırın. Her iki kanaldaki floresan profillerinin otomatik ölçümü gerçekleştirilecek ve veriler sonuç penceresinde görüntülenecektir.

Bireysel sinyal değişkenliğine göre, her hücre için profillerin temsili numaralarını alın. Ölçülen profillerin grafiksel görselleştirmesi için çizim profili veri makrosunu çalıştırın. Çağrılan makro iletişim penceresinde parametreyi ayarlayın.

Giriş verileri için filtrelemeyi kullan onay kutusunu seçili olarak bırakın. Grafiğin, sonuç penceresindeki son verilerden, tek bir CSV dosyasından mı yoksa belirtilen bir dizindeki tüm CSV dosyalarından mı oluşturulması gerektiğini uygun radyo düğmesini tıklatarak belirtin. Uygun onay kutularını işaretleyerek çizim için hangi gruplandırma faktörlerinin kullanılacağını belirtin.

Tüm profillerin benzersiz grafiklerde görüntülenmesi gerekiyorsa faktör I'i seçin. Tüm verilerin tek bir çizimde çizilmesi gerekiyorsa onay kutularını seçili bırakın. Tamam'a tıklayın. Sonraki iletişim penceresinde sonuçları kaydetmek veya nihai veri içe aktarma için yolu ve dosya adını belirtin.

Gerçekleştirilen R kodunu gösteren iletişim pencerelerinde Tamam'a tıklayarak analizi onaylayın. Çizilen bazı profillerde hücre dışı veya hücre içi boşlukta aşırı sinyaller varsa, profil filtreleme kurulum makrosunu çalıştırın. Ardından, çağrılan makro iletişim penceresindeki parametreleri ayarlayarak devam edin.

Her kanal için, dosyada uygun yoğunluk eşiğini ayarlayın, aşırı hücre dışı veya hücre içi sinyal içeren ölçümleri kaldırın. Alanda yoğunluk eşiğinin uygulanacağı bölgeyi X koordinatlarında daha düşük veya daha büyük olarak belirtin ve ardından Tamam'ı tıklatın. Çizim profili veri makrosunu, veri girişi için filtrelemeyi kullan onay kutusu seçili olarak yeniden çalıştırın. Şimdi önceden kaydedilmiş dosyadan verileri ekleyin.

Tüm anormal profillerin başarıyla kaldırıldığından emin olun, aksi takdirde filtreleme parametrelerini iyileştirin. Kalibrasyon verilerine dayalı olarak plazma zarının ve sitoplazma floresan dağılımının bir modelini oluşturmak için model oluştur makrosunu çalıştırın. Çağrılan makro iletişim penceresindeki parametreleri metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi ayarladıktan sonra Tamam'ı tıklatın. Sonraki iletişim pencerelerinde giriş dosyası yolunu ve adını belirtin ve gerçekleştirilen R kodunu gösteren iletişim penceresinde Tamam'a tıklayarak analizi onaylayın.

Daha sonra, ilgilenilen proteini ifade eden hücrelerin görüntülerini işleyin. Görüntüleri içe aktarın ve analizi daha önce olduğu gibi ayarlayın. Yumuşatma ve çizgi genişliği aynı olmalıdır.

Profilleri ölçmeye devam edin. Çizerek profillerin doğruluğunu kontrol edin ve istenirse filtrelemeyi daha önce açıklandığı gibi ayarlayın. Plazma zarı ile sitoplazma arasındaki bir protein bölünmesinin hesaplanması için dağılım hesaplama makrosunu çalıştırın.

Giriş verilerini ve model kaynaklarını belirtin ve sonunda bir veri filtrelemesi ayarlayın. Bir sonuç filtrelemesinin istendiğinden daha büyük kalan değişkenliğe sahip sonuçları kaldırmak için onay kutusunu etkin tutun. Bireysel profil ölçümünün sinyal ayrışması ile açıklanamayan izin verilen maksimum artık değişkenliğin eşiğini belirtin.

Bir kutu çizimi oluşturmak için kullanılabilecek örnek gruplandırma faktörlerini seçin. Tamam'a tıklayın, giriş veya çıkış yollarını belirtin ve gerçekleştirilen R kodunu gösteren iletişim penceresinde Tamam'a tıklayarak analizi onaylayın. Burada, N-miristoilasyon ve fosfoinositidlere elektrostatik etkileşim yoluyla plazma zarı ile ilişkili bir bitki proteinini ifade eden bir FM 4-64 lekeli hücrenin bir görüntüsü gösterilmektedir.

Bu etkileşimler deneysel olarak wortmannin tarafından bozuldu. N-miristoilasyonun önemi, N-miristoilasyon bölgesi olarak görev yapan ikinci amino asit pozisyonunda glisin mutasyonu ile test edildi. Her iki plazma zarı bağlanma yeteneğinin çıkarılmasının etkisi, proteinin N-terminal alanının kesilmesi ile test edildi.

Elde edilen kutu grafiği, N-miristoilasyon bölgesinin mutasyonundan sonra ve ilaç tedavisinden sonra bir plazma zarı afinitesinde bir azalmayı göstermektedir. Karşılıklı etkileri, N-terminal alanının kaldırılmasının etkisi ile karşılaştırılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, analizin ana adımlarının uygun bir sırayla nasıl gerçekleştirileceğini ve parametrelerinin nasıl ayarlanacağını iyi anlamalısınız.

Bu analizi takiben, elde edilen verilerin istatistiksel olarak değerlendirilmesi için ANOVA gibi istatistiksel yöntemler uygulanabilir. Bu yöntem bitki süspansiyon hücreleri için geliştirilmiş olsa da, pürüzsüz ve net bir şekilde ayırt edilebilen plazma zarlarına sahip diğer hücrelere veya dokulara da uygulanabilir.