Name: Plazma zarı periferik ilişkili proteinler için bölümleme belirlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-15T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Keşfedin plazma zarı periferik ilişkili proteinler için bölümleme belirlenmesi yöntemini. FM 4-64 boyama ve hesaplamalı floresan ayrıştırma ile gerçek zamanlı protein dağılımı gözlemi yapın. Hücre biyolojisi ve sinyal yolu araştırmaları için hızlı, erişilebilir bir protokoldür.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu proje NPU tarafından desteklenen ben LO1417 (Milli Eğitim Bakanlığı, gençlik ve spor Çek Cumhuriyeti).

1. biyolojik materyal hazırlanması
<ol><li>Biyolojik malzeme fluorescently tagged protein sitoplazmik bir işaretleyici yanı sıra ilgi ifade hazırlamak. Giriş bölümünde bahsedilen yordamları izleyin.</li>
</ol>2. confocal lazer mikroskobu tarama
<ol><li>4-64 boya7Bölüm 1 FM ile hazırlanan malzeme leke.<ol>
<li>Okudu malzeme için uygun olan bir boyama protokole uygulanır. Tütün BY-2 hücreleri için hücre süspansiyon 200 μL 0.2 μL 10 mm FM ile dimethylsulfoxide 4-64 çözümde leke. Not: FM tipik boyama konsantrasyonu 10 mikron dimethylsulfoxide içinde 10 mM hisse senedi çözüm kullanarak hakkında 4-64 boya olduğunu. FM 4-64 olası en düşük konsantrasyon uygun boyama için kullanın ve hücreler buz (FM 4-64 ve plazma zarı özellikleri etkiler düşük sıcaklık olabilir) üzerinde kuluçkaya değil. Hemen confocal mikroskobu kullanarak gözlem ile devam edin. Boyama ve resim alma arasındaki aralığı 10 dakika uzun olmamalıdır; Aksi takdirde, boya endositoz 4-64 boyama FM etkiler.</li>
		<li>Arka arkaya birden fazla örnekleri işlemek ve deney başında tüm örneklerini leke değil.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir hücre başına tek bir Ekvator confocal bölüm yakalamak.<ol>
<li>Tarama protein etiketi (ilk kanal olmalıdır) ve FM 4-64 (İkinci kanalda olması gerekir) olarak kullanılan chromophore için sıralı iki kanallı ayarlayın. Daha yüksek bir optik çözünürlük (10-20 px/mikron) ayarlayın. Bir örnek koymak-yukarıya: 63 X Petrol daldırma amaç, NA 1.3, görüntü boyutu 1024 x 1024 piksel. Plazma zarı uçak alınan görüntüleri confocal bölüm düzlemde dik olduğundan emin olun.</li>
		<li>Yakalama istatistiği değerlendirme için yeterli veriye sahip örnek başına en az 20 hücreleri (işlenmiş malzeme sinyal değişkenlik bağlıdır).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. gerekli yazılımı yükleme
<ol><li>Fiji ImageJ dağıtım8ve gerekli makro çevre yükleyin.<ol>
<li>Download bilgisayar yazılımı--dan site https://fiji.sc/#download ve açma tarafından yükle.</li>
		<li>Fiji açmak "Fiji.app" dizinindeki "ImageJ(.exe)" dosyasını çift tıklatarak başlatın.</li>
		<li>Bir makro "çevresel" aşağıdaki sitesinden yükleyin: http://kfrserver.Natur.cuni.cz/LiDE/vosolsob/Peripheral/Source/Peripheral_.ijm.</li>
		<li>Fiji'de, eklentileri seçin | Makrolar | Yüklemek için... Ana menüde ve belgili tanımlık downloaded eğe "Peripheral_.ijm." yolunu belirtin Not: İki yeni araç yüklü makro "çevresel" Fiji alet-ecek gözükmek: "Al profili aracı" ve "Periferik Protein menü."</li>
	</ol>
</li>
	<li>R-project yazılım9ve gerekli paketleri yükleyin.<ol>
<li>Site https://cloud.r-project.org/ R-project kurulum için yönergeleri izleyin. Not: Genel analiz Fiji'de gerçekleştirilecek. R yazılım yalnızca dahili olarak çağrılır Fiji makro "hesaplaması sırasında periferik" tarafından.</li>
		<li>R GUI çalıştırın, paketleri seçin | Paketler... yüklemek Ana menüde ve en yakın depo ve yükleme paketi "ggplot2" belirtin. Not: Alternatif olarak, R komut satırı yazın: install.packages("ggplot2").</li>
		<li>Hedeften periferik bir R paketini karşıdan yükleyin: http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/peripheral_latest.tar.gz. Onları paketleri seçerek yüklemek | Yerel dosyalarından paketleri yüklemek. Not: Alternatif olarak, bu komut yalnızca R komut satırı yazın: install.Packages ("http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/peripheral_latest.tar.gz", repo = NULL, türü = "kaynak").</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. görüntü analizi Fiji
<ol><li>Sitoplazmik işaretin confocal görüntüleri işlemek.<ol>
<li>Eklentileri kullanarak Fiji'ye görüntüleri içe | Biyo-biçimleri | Biyo-biçimleri ithalatçı varsayılan ayarlarla Fiji menüsünden.</li>
		<li>Bio-biçimleri ithalatçı düzgün görüntü kalibrasyon tanınan kontrol edin. Üst sol bilgi alan görüntü penceresinde gösterilen resim boyut özgün resim boyutlarına eşit olmalıdır.</li>
		<li>Tedavi hatalı ve yanlış görüntülerle kalibre tek tek, Örneğin, iletişim penceresinde analiz doğru parametreleri ayarlayarak Boyutlar | Ölçek küme Fiji menüsünden: resim genişliğini piksel uzaklığını piksel alanını ve mesafe bilinen alana uygun uzunluk birimindeki gerçek genişliği içine doldurun). Not: Leica LCS LEI dosyaları düzgün kalibre, adım 4.2.1 izleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Bir analiz set-up için içe aktarma seçenekleri makro çalıştırın. Makro üç farklı yoldan birini etkinleştirmek: eklentileri seçin | Makrolar | İçe aktarma seçenekleri [f1] Fiji öğesini, aynı madde menü aracı Periferik Protein menütıkladıktan sonra veya klavye tuşuna basın seçin kısa kesilmiş F1. Parametre çağrılan makro iletişim penceresinde ayarlayın.<ol>
<li>Leica LCS LEI biçimi durumunda yanlış kalibrasyon Leica.lei görüntüleri onay kutusunu etkinleştirerek çözmek. Bu seçenek düzgün görüntü boyutları "lei" uzantılı dosyadan içe aktarır.</li>
		<li>Uygun değeri Gaussian blur RADIUS (px)alanında tanımlayın. Bu resim yumuşatma ve gürültü azaltma etkiler. Düşük bir değer (1 px) yeterli ve herhangi bir resmi bilgi kaybına neden olmaz.</li>
		<li>Profil çizgi genişliği (piksel)alanında bir değer ayarlayın. Daha kalın bir çizgi daha yüksek profil eğrileri düzgünleştirme neden olur. Varsayılan değer 10 px önerilir.</li>
		<li>"Örnek sınırlayıcıları" ve "Exported öğeler." tanımına göre ayrıştırma bir görüntü başlık ayarla Not: Bir görüntü başlığı (dosya adı uzantısı, Örneğinolmadan: "Deney-1_line-02_cell-11") "Örnek sınırlayıcıları" alanında listelenen tüm karakterler etrafında bölünmüş olacaktır (Örneğin: "-_") öğelerinin bir kümesini içine ("Deney", "1"," çizgi","02","hücre"ve"11") faktörler gruplandırma (örnek, hücre, satır ya da tedavi kimlik) aşağıdaki analizi olarak kullanılabilir. Dosyalanmış "öğeleri dışa." içine onların sıra numarası (ilk öğe için "0") yazarak kullanılacak hangi maddeleri tanımlamak Örneğin, "3 5." alanı ayrılmış biçimde kullanın Örneğin, öğeleri "02" ve "11" için "Fac_0" ve "Fac_1." adlı faktörler gruplandırma olarak başvurulabilir. Ayrıca, "Ben" faktör gibi kimlik her ölçüm için anılacaktır.</li>
		<li>Alternatif olarak, örnek sınırlayıcıları boş tutmak ve tam görüntü başlık tutulabilir, 0 Exported öğeleri girin.</li>
		<li>Windows işletim sistemi üzerinde doğru otomatik tespit R yazılımı için yol alan R.exe yolunuolacak eğer kontrol edin. Aksi durumda, R.exe dosyasının tam yolunu (Örneğin, "C:\Program Files\R\bin\R.exe") içinde belgili tanımlık sistem belirtin.</li>
		<li>Tamam' ı tıklatın. Sonraki iletişim penceresinde ayrıştırma başlığı denetleyin ve Tamam'ı veya geri sıfırlamak için tıklatın. Not: Tüm resimler otomatik olarak düzeltti ve sonunda yeniden. A liste-in tüm verilen gruplandırma faktörler sonuçları penceresinde görüntülenir.</li>
	</ol></li>
	<li>Plazma zarı bölge işlenmiş görüntüler arasında doğrusal bir seçim yapmak ve floresan profilleri ölçün.<ol>
<li>Fiji aracı düz çizgi Fiji araç çubuğundan seçin. Resmi tıklayın ve plazma zarı bölgede bir çizgiyi sürükleyin. Yolun ekstrasellüler alanda başlamalı ve plazma zarı dik olmalıdır. Kortikal sitoplazma daha kalın ve daha homojen tabakası ile bölgeleri seçin. En uygun doğrusal seçimi 5-10 mikron uzunluğudur.</li>
		<li>Profil makro almak adım 4.2 (kısayol "x") olduğu gibi analog yöntemi veya profil aracı almak Fiji araç çubuğu tıklatarak çalıştırın. Her iki kanal floresans profilleri otomatik ölçüm gerçekleştirilecek ve veri sonuçları penceresinde görüntülenir.</li>
		<li>"X" tuşunu kullanarak user-unfriendly olduğu düşünülürse, makro kaynak dosyasını Peripheral_.ijm metin editöründe açın, satırında "x" simgesini değiştirme ' makro "Take profili [x]" {' daha olumlu bir sembol ile (değil Fiji ortamında kullanılan bir etkin klavye kısa) ve dosyayı kaydedin. Makro (adım 3.1.4) eski mevkiini geri vermek ve analiz görüntü alma başlatın.</li>
		<li>Bireysel sinyal değişkenliğine göre her hücre için profilleri temsilcisi sayılar mesela.</li>
		<li>Dosya üzerinden veri kaydetmek | Farklı Kaydet.... Her zaman "csv" uzantısı kullanın; uygun veri biçimi için gereklidir.</li>
	</ol></li>
	<li>Profil veri makrosu Arsa (kısa F5) ölçülen profilleri grafik görüntüleme için çalıştırın. Parametre çağrılan makro iletişim penceresinde ayarlayın.<ol>
<li>Onay kutusunun devam kullanım için filtre uygulama veri giriş? seçilmemiş.</li>
		<li>Arsa son veri sonuç penceresinde, bir tek CSV dosyası veya belirtilen bir dizinde uygun radyo düğmesini tıklatarak Tüm CSV dosyaları oluşturulacağını belirtin. Not: Arsa son sonuçlarından oluşturduysanız, veri önce otomatik olarak kaydedilir (Farklı Kaydet... iletişim-ecek otomatik olarak harekete geçirmek).</li>
		<li>Hangi Gruplandırma faktörler uygun onay kutularını işaretleyerek çizmek için kullanılan belirtin. Tüm profilleri içinde benzersiz araziler görüntülenmesi gereken faktör "Ben" seçin. Eğer tüm verileri tarafından seçilmemiş, onay kutularını tek bir arsa çizilen tutun. Dikkat: işlenmiş sonuçları nedenler hata komplo oluşturma sırasında yok bir gruplandırma faktör seçme.</li>
		<li>Bir çizim alanına Çıkış dosya öneki kaydederken dosya adı belirtin ve eğe içinde Arsa yüksek ve Arsa genişliğiArsa görüntü boyutlarını tanımlayın. Not: Elde edilen arsa bir kaynak veri dizininde bir PNG dosyası olarak kaydedilir.</li>
		<li>Seçin Pdf çıktı onay kutusunu üretilen bir ek PDF çıktısını alırsanız.</li>
		<li>Tamam' ı tıklatın. Sonuçları kaydetmek için yol belirtin veya sonunda veri için sonraki iletişim penceresinde. Analiz Tamam gerçekleştirilen R kod gösterilen iletişim windows'tıklayarak onaylayın. Not: Arsa yeni bir görüntü penceresinde açılır ve R analiz çıktı metin penceresinde listelenir.</li>
	</ol></li>
	<li>Çizilen bazı profiller (tagged protein için) ekstrasellüler alanda veya (için FM 4-64 sinyal) hücre içi uzayda aşırı sinyalleri varsa Kurulum makro profili süzme (kısa F2) çalıştırın. Çağrılan makro iletişim penceresinde parametreleri ayarlayarak izleyin. Not: Filtre uygulama en fazla izin verilen yoğunluğu eşik belirtilen x-koordinatları göre yoksul profilleri kaldırılmasını sağlar.<ol>
<li>Her kanal için uygun yoğunluk eşik ölçümler bir aşırı ekstraselüler (hücre içi) sinyali ile kaldırmakayarlanmaya. Nerede yoğunluğu eşik uygulanacak bölge alanını x-koordinatlarda (büyüktür) daha düşükolarak belirtin.</li>
		<li>Profil veri makrosu Arsa (adım 4.4) yeniden onay kutusunun çalıştırın kullanım için filtre uygulama veri giriş? seçilmiş; tüm anormal profilleri başarılı bir şekilde kaldırıldı emin olun. Aksi takdirde, filtre parametreleri (adım 4.5.1) geliştirmek.</li>
	</ol></li>
	<li>Plazma zarı ve sitoplazma floresans dağıtım kalibrasyon verileri temel alan bir model oluşturmak için Create modeli makro (kısa F3) çalıştırın. Çağrılan makro iletişim penceresinde parametreleri ayarlayarak izleyin.<ol>
<li>Seçerek verilerin filtre uygulanmış (adım 4.5) olmalıdır eğer belirtmek kullanım için filtre uygulama veri giriş? onay kutusu.</li>
		<li>Pratiği olduğu gibi adım 4.4.2 kaynak verileri belirtin.</li>
		<li>Hangi modeli "Başlat"son"," tanımına göre öngörülen ve "adım" değerleri bir aralığı mikron belirtin. Not: Tüm profil ölçüleri belirtilen aralığından daha uzun olmalıdır.</li>
		<li>Kullanılmış, uygun alanlara kromofor floresans dalgaboyu uyarma ve emisyon maxima belirtin. 4-64 birleşimi GFP ve FM için Varsayılanları belirler. Not: "GFP" etiketleme (GFP, CFP, YFP, vb) protein için kullanılan chromophore ve "FM4" bir plazma zarı (genellikle FM 4-64) boyama için kullanılan chromophore gösterir.</li>
		<li>Çıkış dosya öneki alanı belirtin. Önek elde edilen modeli kaynak veri dizinine RData dosya olarak kaydetmek için kullanılır.</li>
		<li>Onay kutusunu işaretleyin Arsa modeli? Grafik çıkış gerekiyorsa. Arsa PNG ve ayrıca PDF dosyası olarak kaydedilir Pdf çıktı? onay kutusu seçilidir.</li>
		<li>Tamam' ı tıklatın. Girdi belirtin veya bir sonraki iletişim Windows'daki çıkış ve Analizi gerçekleştirilen R kod gösterilen iletişim penceresinde OK tıklayarak onaylayın. Not: Arsa modellenmiş sitoplazmik ve periferik ilişkili protein floresans membran bileşik yeni görüntü penceresinde gösterilecek ve R analiz çıktı metin penceresinde listelenir.</li>
	</ol></li>
	<li>Protein ilgi ifade hücreleri görüntülerini işlemek.<ol>
<li>Adım 4.1 olduğu gibi pratiği görüntüleri içe.</li>
		<li>Pratiği olduğu gibi adım 4.2 çözümleme ayarlayın. Yumuşatma ve çizgi genişliği aynı olması gerekir.</li>
		<li>Profilleri pratiği olduğu gibi adım 4.3 ölçmek.</li>
		<li>(Adım 4.4) komplo tarafından profilleri doğruluğunu kontrol ve (adım 4.5) isterseniz filtre ayarlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Calculate dağıtım makro (kısa F4) bir protein plazma zarı arasında ve sitoplazmada bölümleme hesaplaması için çalıştırın. Parametre ayarı çağrılan makro iletişim penceresinde izleyin.<ol>
<li>Pratiği önceki adıma (adım 4.4), veri kaynağı, filtreleme ve dosya adı önekini belirtin.</li>
		<li>Protein dağıtım hesaplaması için modeli "Çevresel" makro Fiji (Seç onay kutusunu son sonuç) üzerinde son örneğini son model hesaplama veya RData dosyası (dolu olmadığını belirtin onay kutusunu "dosya"işaretleyin).</li>
		<li>Kutuyu bir sonuç filtreleme isteniyorsa aktif kalan değişkenliği daha büyük sonuçlar çıkarmak tutun. Bireysel profil ölçüm sinyal ayrıştırma tarafından açıklanamayan maksimum izin verilen kalan değişkenlik eşiği belirtin. Örneğin: floresan yoğunluğu profil toplam değişkenliği açıklanamayan değişkenlik 20 daha yüksek ile tüm ölçüm atılacak 0.200 değeri gösterir.</li>
		<li>Kutu-arsa oluşturma (adım için 4.4) kullanılabilir örnek gruplandırma faktörler, seçin.</li>
		<li>Onay kutusunu etkinleştirmek Pdf çıktı? kutu arsa PDF dosyası olarak kaydetmek için.</li>
		<li>Tamam' ı tıklatın, giriş belirtin veya çıkış yolları ve Analizi gerçekleştirilen R kod gösterilen iletişim penceresinde OK tıklayarak onaylayın. Not: Plazma zarı ve sitoplazma arasında periferik ilişkili protein bölümleme kutu arsa yeni bir görüntü penceresinde gösterilecek ve R analiz çıktı metin penceresinde listelenir.</li>
		<li>Dış işlem için dosya üzerinden sonuçları penceresinde görüntülenen sonuçları kaydetmek | Farklı Kaydet... Pencere menüsünde.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Barbosa, I. C. R., Shikata, H., Zourelidou, M., Heilmann, M., Heilmann, I., Schwechheimer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+composition+and+a+polybasic+motif+determine+D6+PROTEIN+KINASE+polar+association+with+the+plasma+membrane+and+tropic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Phospholipid composition and a polybasic motif determine D6 PROTEIN KINASE polar association with the plasma membrane and tropic responses.</a> Development. 143 (24), 4687-4700 (2016).</li>
<li>Kato, M., Aoyama, T., Maeshima, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23445487">The Ca2+-binding protein PCaP2 located on the plasma membrane is involved in root hair development as a possible signal transducer.</a> Plant J. 74 (4), 690-700 (2013).</li>
<li>Kubitscheck, U. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKubitscheck%2C+U+%22Fluorescence+Microscopy%3A+From+Principles+to+Biological+Applications%22">Fluorescence Microscopy: From Principles to Biological Applications</a>. , John Wiley & Sons. (2013).</li>
<li>Janecki, A. J., Janecki, M., Akhter, S., Donowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+plasma+membrane+expression+of+a+fusion+protein+of+Na%2FH+exchanger+NHE3+and+green+fluorescence+protein+%28GFP%29+in+living+PS120+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Quantitation of plasma membrane expression of a fusion protein of Na/H exchanger NHE3 and green fluorescence protein (GFP) in living PS120 fibroblasts.</a> J Histochem Cytochem. 48 (11), 1479-1492 (2000).</li>
<li>Peitzsch, R. M., McLaughlin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+acylated+peptides+and+fatty+acids+to+phospholipid+vesicles%3A+pertinence+to+myristoylated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Binding of acylated peptides and fatty acids to phospholipid vesicles: pertinence to myristoylated proteins.</a> Biochemistry. 32 (39), 10436-10443 (1993).</li>
<li>Vosolsobě, S., Petrášek, J., Schwarzerová, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+plasticity+of+plasma+membrane+interaction+in+DREPP+family+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+-+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Evolutionary plasticity of plasma membrane interaction in DREPP family proteins.</a> Biochim Biophys Acta - Biomembr. 1859 (5), 686-697 (2017).</li>
<li>Bolte, S., Talbot, C., Boutte, Y., Catrice, O., Read, N. D., Satiat-Jeunemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FM-dyes+as+experimental+probes+for+dissecting+vesicle+trafficking+in+living+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">FM-dyes as experimental probes for dissecting vesicle trafficking in living plant cells.</a> J Microsc. 214 (2), 159-173 (2004).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>R Development Core Team. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22R%3A+A+language+and+environment+for+statistical+computing%22">R: A language and environment for statistical computing</a>. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2008).</li>
<li>Logan, D. C., Domergue, O., Teyssendier de la Serve, B., Rossignol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+family+of+plasma+membrane+polypeptides+differentially+regulated+during+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Int%22%5BJournal%5D)">A new family of plasma membrane polypeptides differentially regulated during plant development.</a> Biochem Mol Biol Int. 43 (5), 1051-1062 (1997).</li>
<li>Ide, Y., Nagasaki, N., Tomioka, R., Suito, M., Kamiya, T., Maeshima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+properties+of+a+novel%2C+hydrophilic+cation-binding+protein+associated+with+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Molecular properties of a novel, hydrophilic cation-binding protein associated with the plasma membrane.</a> J Exp Bot. 58 (5), 1173-1183 (2007).</li>
<li>Nagasaki-Takeuchi, N., Miyano, M., Maeshima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plasma+membrane-associated+protein+of+Arabidopsis+thaliana+AtPCaP1+binds+copper+ions+and+changes+its+higher+order+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">A plasma membrane-associated protein of Arabidopsis thaliana AtPCaP1 binds copper ions and changes its higher order structure.</a> J Biochem. 144 (4), 487-497 (2008).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MDP25%2C+A+Novel+Calcium+Regulatory+Protein%2C+Mediates+Hypocotyl+Cell+Elongation+by+Destabilizing+Cortical+Microtubules+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">MDP25, A Novel Calcium Regulatory Protein, Mediates Hypocotyl Cell Elongation by Destabilizing Cortical Microtubules in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 23 (12), 4411-4427 (2011).</li>
<li>Qin, T., Liu, X., Li, J., Sun, J., Song, L., Mao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+microtubule-destabilizing+protein+25+functions+in+pollen+tube+growth+by+severing+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis microtubule-destabilizing protein 25 functions in pollen tube growth by severing actin filaments.</a> Plant Cell. 26 (1), 325-339 (2014).</li>
<li>Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezawa, S. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0074769608624523">Tobacco BY-2 Cell Line as the &#34;HeLa&#34; Cell in the Cell Biology of Higher Plants.</a> Int Rev Cytol. 132, 1-30 (1992).</li>
<li>Hellens, R. P., Anne Edwards, E., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pGreen%3A+A+versatile+and+flexible+binary+Ti+vector+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">pGreen: A versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Plant Mol Biol. 42 (6), 819-832 (2000).</li>
<li>Vermeer, J. E. M., Thole, J. M., Goedhart, J., Nielsen, E., Munnik, T., Gadella, T. W. J. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+phosphatidylinositol+4-phosphate+dynamics+in+living+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Imaging phosphatidylinositol 4-phosphate dynamics in living plant cells.</a> Plant J. 57 (2), 356-372 (2009).</li>
<li>Laňková, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Dynamics+of+Plant+Plasma+Membrane+Proteins+with+Fluorescence+Recovery+and+Raster+Image+Correlation+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Microanal%22%5BJournal%5D)">Determination of Dynamics of Plant Plasma Membrane Proteins with Fluorescence Recovery and Raster Image Correlation Spectroscopy.</a> Microsc Microanal. 22 (2), 290-299 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada anlatılan yöntem floresans yoğunluklarda5ölçme üzerinde dayalı diğer yaklaşımlar göre periferik ilişkili proteinler için plazma zarı bölümleme daha doğru bir tahmin oluşturur. Bu yöntemin önemli gelişme bu ışık kırınım ve süperpozisyon plazma zarı ve sitoplazmik sinyalleri dikkate alır olduğunu. Bu yöntem sonuçlar floresan yoğunluğu ile ortalama sitoplazmik membran konumundaki karşılaştırılması temel alan bir basit yöntemi sonuçları ile ilişki içinde olmakla birlikte (daha önce<sup class="x...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/57837/determination-plasma-membrane-partitioning-for-peripherally">Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins</a>. The Affiliations section was updated.
One of the affiliations was updated from:
Department of Experimental Plant Biology, University of Science, Charles University
to:
Department of Experimental Plant Biology, Faculty of Science, Charles University

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/57837/determination-plasma-membrane-partitioning-for-peripherally">Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins</a>. The Affiliations section was updated.

Erratum: Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

Periferik ilişkili plazma-membran proteinlerinin yolları sinyal cep anahtar bileşenleri vardır. Temel rollerini onların geçici plazma zarı Derneği ve plazma zarı ve sitoplazma arasında sinyal iletimi için önemlidir ayrılma biridir. Plazma zarı periferik ilişkili proteinler plazma membran üzerinde lipid çapa (N-miristoillenme, S-asilasyonu veya prenilasyon) veya (etkileşim phosphatidylinositol fosfat, phosphatidic asit, ile lipid bağlayıcı etki alanları eklenebilir vb).
Plazma zarı bağlama özellikleri bu proteinlerin olabilir vivo içinde Örneğin, bir fluorescently öğesini protein temel amino asitler bir site yönettiği mutagenesis tarafından değiştirildiğinde, etkileyen çeşitli inhibitörleri ile tedavi ederken incelendi lipid işaret. Protein yeniden dağıtılması açık olduğunda özellikle durumlarda, periferik plazma membran proteinlerinin dağılımları çoğunlukla nitelik, değerlendirilen. Sunulan protein yeniden dağıtımı yalnızca kısmi ve kantitatif değerlendirilmesi gerekli olduğunda durumlar için en iyi yöntemdir. Sık kullanılan bir yaklaşım ne zaman plazma zarı Derneği confocal üzerinden tahmin edilmektedir, lazer tarama mikroskobu görüntüleri bir oranı floresans yoğunluklarını plazma zarı ve sitoplazma1,2, ama basit değil gibi doğru. Plazma zarı koyulukları floresan ışık kırınım özelliği nedeniyle plazma zarı ve sitoplazma sinyal belirli floresans mikroskobu tekniği ve optik öğeleri kullanılan3için süperpozisyon yansıtır. Sonuç olarak, sitoplazmik sinyal aynı membran bölgede yer alır. Bu nedenle, FM 4-64 boyama desen bir membran sinyal seçimi4için bir maske olarak kullanılamaz. Ayrıca, gerçek plazma zarı sinyal periferik ilişkili plazma-membran protein süperpozisyon nedeniyle membran sinyal FM 4-64 sistematik olarak her zaman maksimum boyama tarafından tanımlanan konumundaki basit ölçümleri abartma membran ve sitoplazmik bileşik. Gözlenen sinyaller fluorescently öğesini periferik ilişkili proteinler için maksimum da plazma zarı marker (yani, FM 4-64 styryl boya) maksimum ile birlikte yerelleştirmek değil ama sitoplazma doğru kaymıştır. FM 4-64 emisyon en yüksek ışık kırınım3dalga boyu bağımlılığı nedeniyle GFP gibi yeşil flüoresan proteinler için emisyon zirveleri ile karşılaştırıldığında daha geniş gerçeğine dayalı başka bir kısıtlamadır.
Burada açıklanan yöntemde tagged protein sinyal varsayımsal dağılımı plazma zarı ve sitoplazma sinyal, sırasıyla açıklayan iki ampirik işlevleri tarafından takılmıştır. Bu sinyal ayrışma hücre yüzeyine dik plazma membran protein fluorescently öğesini ifade düzenli, iki kanallı confocal bölümleri kaynak görüntüler için uygulanan lineer floresan profilleri uygulanır FM 4-64 boya ile etiketli hücreleri.
Montaj için kullanılan ilk işlev hücre kenarında bir kırınım bir sitoplazma sinyal açıklar. Plazma zarı periferik ilişkili protein ilgi olarak aynı chromophore tarafından öğesini bir sitoplazma protein marker ifade hücrelerdeki ölçüldü daha önce alınan floresans profilleri elde edilir. Bir plazma zarı sinyal bir kırınım açıklayan ikinci işlev FM 4-64 floresans türetilmiştir. Bu sinyal öncelikle bir nokta kaynak ışık kırınım yaklaşık bir modelleme için kullanılmakta olan bir Gauss işlev tarafından yaklaşık. İkinci olarak, bu model, kırmızı FM 4-64 emisyon için geçerli matematiksel bir emisyon dalga boyu periferik ilişkili proteinler plazma zarı, ilgi etiketleme için kullanılan chromophore ilgilidir forma dönüşür. Her iki işlevleri sırasıyla maksimum yoğunluk ve en yüksek değerleri FM 4-64 sinyal ve sitoplazmik protein sinyal, yüzde 10'u ortalamasından normalleştirilmiş. Bu sinyal ayrıştırma tarafından (doğrusal olmayan en azından kare uygun yöntemi), plazma zarı oranını ve muayene protein sitoplazma kısmını kolayca ve doğru bir şekilde tahmin edilebilir. Hesaplanan bölümleme katsayısı gerçek fiziksel boyut mikrometre, aralıkta çünkü sitoplazmik birim konsantrasyon plazma membran yüzey konsantrasyon ile karşılaştırılır. Plazma zarı mesafe içinde plazma zarı bitişik alan olduğu gibi proteinler aynı miktarda yerelleştirilmiştir sitoplazma tanımlar. Bu değer bölümleme için eşdeğerdir katsayısı K2 tanıttı daha önce5. Çok hızlı, mikroskop, tarama rutin confocal lazer kullanılarak kazanılması sadece tek confocal bölümleri gerektiren yöntemdir ve değil hesaplama açısından talep ediyor. Analiz çekirdek bir taşınabilir R pakette uygulamaya konmuştur ve ek bir ImageJ makro analiz sezgisel iletişim kutuları çalıştırmak için grafik kullanıcı arabirim sağlamak için yazıldı. Yazılım ve daha ayrıntılı bir açıklama yöntemi (daha önce yayınlanmamış6) http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/ bulunabilir.
Yöntem izole hücreler, önceki ve dokular, uygun olan bireysel hücrelerin plazma zarı açıkça ayırt olduğu yerde bir fluorescently öğesini yapı ifade periferik ilişkili protein inceledi. 4-64 boyama kullanılmalıdır FM ile uyumlu bir chromophore. FM 4-64 kırmızı floresans yayar; Bu nedenle, muayene protein-ebilmek var olmak tagged floresans protein ile mavi, yeşil ya da sarı emisyon (Örneğin, GFP, CFP, YFP) tarafından. Protein dağıtım daha az yapay ve daha tekrarlanabilir gözlemleri sağladığından biyolojik malzemenin istikrarlı dönüştürme önerilir. Muayene protein nispeten homojen bir sitoplazmik dağılımı gösterir gereklidir. Endoplazmik retikulum veya başka bir hücre içi membran yuvası bir proteinin yerelleştirme yapay sonuçlar verebilir.
Ayrıca, sitoplazmik bir işaretleyici ifade aynı biyolojik malzeme karşılaştırma için kullanılması gerekir. Hücre membran kaldırıldı bağlama kapasitesi ile ücretsiz chomophore (aynı etiketleme, Örneğin, ücretsiz GFP periferik protein için kullanılan) veya ilgi tagged protein dönüştürülebilir. Membran bağlama kapasitesi, örneğin, kırpma membran bağlayıcı etki alanının veya site yönettiği mutagenesis anahtar amino asit residua (Örneğin, N-miristoillenme, S-asilasyonu, ya da prenilasyon, vbsiteleri), kaldırılmış.
Confocal tarama Mikroskopi için hücre membran marker FM 4-64 boya gibi tarafından etiketlenmesi gerekir. 4-64 boyama FM (nedeniyle sokan autofluorescence, zavallı Boya Penetrasyon, vb) okudu malzeme için uygun değilse, plazma zarı, örneğin, etiketli bir uygun chomophore (ayrılmaz plazma membran protein tarafından etiketli mCherry, RFP, vb). İşaretçiyi hücre içi membran bölmeleri (endomembranes) ihmal edilebilir yerelleştirme olması zorunludur.
Eğer sabit örnekleri ve antikorlar ile çalışma, düzeltilebilir analog FM 4-64FX veya uygun bir hedef karşı antikor tarafından plazma zarı etiketleme kullanılabilir. Bu durumda, fiksasyon yordamlar sitoplazma ve plazma zarı proteinler seçici kaybına yol açabilir çünkü sonuçları çok dikkatli bir şekilde değerlendirmek için esastır.

<table><tbody><tr><td>FM 4-64</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T13320</td><td>Plazma membran boyası</td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540 Sigma</td><td>Boya çözücü</td></tr><tr><td>Sıradan ekipman (mikroskobik slaytlar, pipetler, uçlar, tüpler)</td><td></td><td></td> <td>Hücre etiketleme ve mikroskopi ekipmanı</td></tr><tr><td>Konfokal lazer tarama mikroskobu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sıradan bilgisayar</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

plazma zarı periferik ilişkili proteinler için bölümleme belirlenmesi

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

Bu yöntem plazma zarı arasında floresan yoğunluğu profilleri kullanarak herhangi bir fluorescently öğesini periferik ilişkili protein plazma zarı bölümleme belirlenmesi için hızlı bir yaklaşım sağlar. Ölçülen floresans profilleri dik hücre çevre için uygulanan bir çizgi boyunca membran ve sitoplazma floresans dağıtım için bir model ile donatılmıştır. Bu model fluorescently öğesini işaret sitoplazma ve FM 4 64 etiketli plazma zarı ile ifade başvuru hücrelerdeki floresan yoğunluğu değerleri üzerinden inşa edilmiştir. Yöntemi çeşitli hücre tipleri ve organizmalar için uygulanabilir; Ancak, sadece plazma zarı olmayan komşu hücre değerlendirilebilir. Bu hızlı mikroskobu tabanlı yöntem deneyler, nerede plazma zarı ilişkili işaretçileri ince ve dinamik değişiklikler bekleniyor ve sayısal gerek, Örneğin, proteinler, önleyici tedaviler mutant sürümleri analiz için uygundur, ve sinyal iletim gözlemler. Kullanıcı dostu bir arabirim olarak hizmet veren bir ImageJ makro ile birleştiğinde bir çoklu platform R paket içinde uygulanan yöntemi.

DREPP10 ' dur bir N-miristoillenme ve phosphatidylinositol fosfat11, ile elektrostatik bir etkileşim yoluyla plazma zarı ile ilişkili bir bitki özgü periferik ilişkili plazma-membran proteini 12. DREPP kalsiyum sinyalli makine bitki hücresinde bir bileşeni olarak tanımlanmıştır ve ayrıca sitoiskeleti13,14ile etkileşime girer. Sunulan denemede DREPP2...

Burada, plazma zarı Derneği düzeyinin kantitatif analiz için periferik ilişkili protein fluorescently öğesini gerçekleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Yöntemi membran Hesaplamalı ayrışma ve plazma zarı floresan marker ile etiketli hücrelerdeki gözlenen sinyal sitoplazmik bileşeni dayanmaktadır.

Plazma zarı periferik ilişkili proteinler için bölümleme belirlenmesi

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

Bu yöntem, hücre sinyal yollarının çözülmesi de dahil olmak üzere hücre biyolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Dolayısıyla bu tekniğin ana avantajı, aslında herhangi bir sofistike, mikroskobik yaklaşım gerektirmemesidir. Aynı zamanda çok hızlıdır ve bu nedenle hücrelerdeki protein dağılımının gerçek zamanlı olarak gözlemlenmesi için kullanılabilir.Periferik olarak ilişkili proteinin membran bölünmesinin değerlendirilmesi ve miktarının belirlenmesi, mikroskop altında plazma membranı ve sitoplazmik floresan karışımına neden olan ışık kırınımı nedeniyle karmaşıktır. Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı gibi biyolojik materyalin hazırlanması ile başlayın. Hazırlanan malzemeyi, çalışılan malzemeye uygun bir boyama protokolü uygulayarak FM 4-64 boya ile boyayın.Tütün BY-2 hücreleri için, 200 mikrolitre hücre süspansiyonunu dimetil sülfoksit içinde 0.2 mikrolitre 10 milimolar FM 4-64 çözeltisi ile boyayın. Bir hücre başına bir ekvatoral konfokal bölümü yakalamak için, protein etiketi olarak kullanılan kromofor ve FM 4-64 için sıralı iki kanallı bir tarama ayarlayın. Ayrıca daha yüksek bir optik çözünürlük ayarlayın.Örnek bir kurulum, 1.3 sayısal diyafram

determination-plasma-membrane-partitioning-for-peripherally

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Düzenlenmiş endositoz, hücre zarı proteinleri çoğunluğu yüzey ekspresyon düzeyleri yönetir. Burada, dopamin taşıyıcısı (DAT), polytopic membran proteini endositik hızını ölçmek için indirgenebilir, Membran geçirgenliği olmayan biyotinilasyon reaktifleri kullanmaktadır. Bu yöntem çoğu plazma membran proteinlerinin endositik oranını ölçmek için basit bir yaklaşımdır kolaylaştırır.

Tersinir biyotinilasyon Plazma Membran Protein endositik Oranları Ölçüm

Yaşayan hücrelerin plazma membranında flüoresan proteinlerin lipid sal bölümleme araştırmak için bir yöntem tarif edilmiştir. Bu lipid sallar içinde veya dışında bulunan proteinlerin difüzyon zamanlarda eşitsizlik yararlanır. Kazanım kontrol koşullarda ya da ilaç eklenmesinden sonra dinamik olarak gerçekleştirilebilir.

Lipid Raft belirlenmesi Flüoresan Korelasyon Spektroskopisi (FCS) tarafından Yaşayan hücreler içinde floresan etiketli Soruşturmasının Bölümleme

Burada tam 15 N etiketli Arabidopsis thaliana hücre kültürleri etiketlenmemiş bir karışımına dayanan deterjan dayanıklı ve deterjan çözünür membran içine bitki plazma zarlarının parçalanması için ve in vivo güçlü bir yöntem açıklanmaktadır. Prosedür sinyal süreçleri anlamak için karşılaştırmalı proteomik çalışmalar için uygulanır.

Mukayeseli Proteomik Analizi Metabolik Etiketleme ve Membran Fraksiyonasyon<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Süspansiyon Hücre Kültürleri

Burada, canlı hücrelerdeki integral zar proteinlerinin oryantasyonunu ve topolojisini belirlemek için bir protokol sunuyoruz. Bu basit protokol, ilgilenilen protein ile GFP arasındaki kimeraların seçici proteaz duyarlılığına dayanır.

Floresan Proteaz Koruma Kullanma Membran Protein topolojisini belirlenmesi (FPP)

Birçok protein, zar yüzeylerine bağlandığında işlevlerini yerine getirir. Ekstrinsik proteinlerin nanodisk membranları üzerindeki bağlanması, transmisyon elektron mikroskobu ile dolaylı olarak görüntülenebilir. Negatif leke sodyum fosfotungstat tarafından indüklenen nanodisklerin karakteristik istiflenmesinin (rouleau), ekstrinsik proteinin bağlanmasıyla önlendiğini gösteriyoruz.

Yöntem gözünüzde canlandırın ve Transmisyon Elektron Mikroskobu Membran Etkileşen Proteinler Analiz için

Burada, farklı sinaptik bölmelere ait proteinleri izole etmek için sağlam bir prosedürü temsil eden bir beyin zar fraksiyonasyon protokolünü sunuyoruz.

Beyin Membranı Fraksiyonu: Bir<emEx Vivo</em&gt; Subsınaptik Protein Lokalizasyonunu Değerlendirmede Yaklaşım

Burada, pH modülasyonuna dayalı etiketsiz bir yöntem kullanarak protein-fosfoinositid etkileşimlerini incelemek için bir mikroakışkan platform bağlamında desteklenen bir lipid çift katmanı sunmaktayız.

PIP-on-a-chip: Protein-fosfoinositid Etkileşimlerinin Etiketsiz Bir Çalışması

Burada iletişim kuralları için deterjan-Alerjik homojenizasyon kültürlü memeli hücrelerinin azot kavitasyon ve sonraki sitozolik ve membran bağlı proteinler ayrılması ultrasantrifüj tarafından dayalı mevcut. Bu yöntem periferik membran proteinlerinin çözünür arasındaki bölümleme izlemek için idealdir ve membran kesirler.

Azot kavitasyon ve diferansiyel Santrifüjü sağlar periferik membran proteinlerinin kültürlü hücrelerdeki dağılımını izlemek için

Burada, elektron mikroskopisi ile birlikte yerli hücreli membran nanopartikül sistemini kullanan membran proteinlerinin oligomerik durumunun belirlenmesi için bir protokol sunulmaktadır.

Membran Protein-Protein Etkileşim Analizi için Yerli Hücreli Membran Nanopartiküller Sistemi

Bu makale, canlı hücrelerin plazma zarındaki moleküler difüzyonu ölçmek için nokta varyasyonu Floresan Korelasyon Spektroskopisi (svFCS) mikroskobunun nasıl oluşturulacağına dair bir protokol sunmayı amaçlamaktadır.

Canlı Hücrelerin Plazma Membranında Moleküler Difüzyonun Analizi için Spot Varyasyon Floresan Korelasyon Spektroskopisi

Lipozomal membran geçirgenliğini değerlendirmek için geleneksel tekniklere göre üstün hassasiyet ve çözünürlükle uygun maliyetli bir yöntem sunuyoruz. Yeni bir kapsüllenmiş ligand ikame reaksiyonu kullanan bu teknik, model membranlarda fosfolipaz A2 ile indüklenen değişiklikleri tespit eder. Standart analizlerle kolayca entegre edilen bu erişilebilir yaklaşım, membran biyofiziği ve toksin etkileşimlerini incelemek için çözünürlüğü artırır.

Fosfatidilinositol Fosfat Gruplarının Venom PLA2'nin Membranotropik Etkisi Üzerindeki Etkilerini Araştırmak için Bir Lipozom Membran Geçirgenlik Testi

Keşfedin plazma zarı periferik ilişkili proteinler için bölümleme belirlenmesi yöntemini. FM 4-64 boyama ve hesaplamalı floresan ayrıştırma ile gerçek zamanlı protein dağılımı gözlemi yapın. Hücre biyolojisi ve sinyal yolu araştırmaları için hızlı, erişilebilir bir protokoldür.

Plazma zarı periferik ilişkili proteinler için bölümleme belirlenmesi

Daha fazla video keşfet