Timus bağlı ve timus bağımsız immünglobulin izotip yanıt Immunosorbent Assay enzim bağlı kullanarak farelerde karakterizasyonu
7 Eylül 2018
Bu yazıda, biz T-bağımlı ve T-bağımsız immünglobulin (Ig) izotip yanıt ELISA kullanarak farelerde karakterize için bir protokol tanımlamak. Bu yöntem tek başına veya kullanılabilir akış ile birlikte sitometresi araştırmacılar T-bağımlı ve bağımsız T antijen bağışıklama takip farelerde B hücre-aracılı Ig izotip yanıtlarında farkları belirlemek için izin verir.
Bu yöntem, immünoloji alanında antijen bağışıklamasına bağlı bağımlı ve bağımsız antikor yanıtlarının yanı sıra B hücresi aktivasyonu ve germinal merkez reaksiyonları hakkındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, farelerde B hücre aktivasyonu ve humoral bağışıklığın doğrudan karşılaştırılması ile güvenilir ve kantitatif Ig izotip yanıt ölçümleri sağlamasıdır. TNP-polisakkarit bağışıklaması için, fare başına 100 mikrolitre taze hazırlanmış antijen çözeltisi ile bir mililitre insülin şırıngası yükleyin ve alt organ enjeksiyonunu önlemek için iğneyi her hayvanın sağ alt çeyreğine yaklaşık 30 derecelik bir açıyla yerleştirin.
Tüm fareler enjekte edildiğinde, hayvanları belirli bir patojen içermeyen tesiste barınmak üzere kafeslerine geri koyun. Uygun deneysel zaman noktalarında, retro-orbital kanama ile aşılanmış her hayvandan 150 ila 200 mikrolitre kan toplayın ve örneklerin oda sıcaklığında bir ila iki saat boyunca pıhtılaşmasına izin verin. İnkübasyonun sonunda, pıhtılaşmış kan örneklerini santrifüjleyin ve berrak serumu her bir kan pıhtısının üstünden steril bir 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
Kalan kan pıhtısını çıkarmak için ikinci bir santrifüjlemeden sonra, eksi 80 santigrat derecede saklamak için 50 mikrolitre serumu ayrı ayrı steril 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Kaplamadan önce, bireysel 96 kuyucuklu immünoplate, toplam serum Ig izotipi için uygun fare Ig izotipi spesifik yakalama antikorları, TNP'ye özgü Ig izotipi için TNP-38BSA antijeni veya yüksek afiniteli TNP'ye özgü Ig izotipi için TNP-3BSA antijeni ile kaplayın ve kaplanmış plakaları gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi sabah, plakaları kuyucuk başına 200 mikrolitre yıkama tamponu ile iki kez yıkayın.
Yıkama tamponunu atın ve her yıkamadan sonra plakaları bir yığın kağıt havlu üzerinde kurulayın. Daha sonra, plakaları oda sıcaklığında bir saatlik inkübasyon için oyuk başına 200 mikrolitre engelleme tamponu ile bloke edin. Plakalar bloke edilirken, uygun standardı ve serum seyreltmelerini ve bloke edici tamponu, belirtildiği gibi kuyucuk başına 150 mikrolitrede ayrı bir işlenmemiş 96 oyuklu plakada hazırlayın.
Daha sonra ELISA plakasını gösterildiği gibi yıkama tamponu ile yıkayın ve her seyreltilmiş Ig izotip standardından ve serum örneğinden 100 mikrolitre ELISA plakasının uygun kuyucuklarına ekleyin. Dört santigrat derecede bir gece inkübasyondan sonra, plakaları gösterildiği gibi yıkayın ve oda sıcaklığında bir ila iki saatlik bir inkübasyon için her bir oyuğa bloke edici tampon içinde seyreltilmiş 100 mikrolitre uygun bir alkalin fosfataz konjuge izotipe özgü antikor ekleyin. Kuluçka işleminin sonunda, plakaları yıkayın ve her bir oyuğa 100 mikrolitre taze hazırlanmış substrat çözeltisi ekleyin.
Oda sıcaklığında önümüzdeki birkaç dakika içinde reaksiyonun geliştikçe izlenmesi. Reaksiyon analiz edilecek kadar sağlam olduğunda, plakayı bir mikroplaka okuyucuya yerleştirin ve dalga boyunu 405 nanometreye ayarlamak için ayarlara tıklayın. Tamam'a tıklayın, ardından 96 kuyu plakası kurulumuna göre uygun boş, standart ve bilinmeyen kuyuları atamak için şablona tıklayın.
Ardından, en konsantre standart yaklaşık bir, 1.5, iki ve 2.5'lik bir optik yoğunluğa ulaştığında, plakayı okumak ve her analizden sonra elde edilen veri dosyasını kaydetmek için oku'ya tıklayın. Bağışıklamanın yokluğunda, B hücresine özgü TNF reseptörü ile ilişkili faktör üç veya B-TRAF3 nakavt farelerinde, cinsiyet ve yaş eşleştirilmiş B-TRAF3 yeterli altlık kontrol hayvanlarına kıyasla, IgM, IgG2a, IgG2b, IgG3 ve IgA'nın bazal serum seviyelerinde bir artış gözlenir. TNP-polisakkarit veya TNP-KLH ile aşılamadan yedi gün sonra, az önce gösterildiği gibi, timustan bağımsız Ig izotipinin bağışıklamaya verdiği yanıtların analizi, miyeloid hücreye özgü TRAF3 nakavt farelerinde önemli ölçüde daha yüksek timustan bağımsız TNP'ye özgü IgG3 seviyelerinin yanı sıra yüksek timusa bağımlı TNP'ye özgü IgG2b seviyelerini ortaya koymaktadır.
Ayrıca, TNP-KLH bağışıklamasına timüse bağımlı fare primer ve hafıza yanıtlarının değerlendirilmesi, T hücresine özgü TRAF3 nakavt farelerinde kısmen azalmış timus bağımlı IgM primer yanıtlarının ve kusurlu IgG1 primer ve hafıza yanıtlarının varlığını gösterir. Bu prosedürü denerken, ELISA'nın genellikle standart eğrilerin doğrusal aralığı tarafından tanımlanan tespit limitlerine sahip olduğunu ve bu nedenle numunenizin birden fazla seyreltilmesi gerekebileceğini unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, belirli bir deneysel ortamda antikor yanıtlarının kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını sağlamak için akış sitometrisi veya L noktası gibi diğer tamamlayıcı yöntemler gerçekleştirilebilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, ELISA kullanarak farelerde T-bağımlı ve T-bağımsız immünoglobulin (Ig) izotip yanıtlarını karakterize etmek için bir protokol tanımlamaktadır. Bu yöntem, araştırmacıların antijen immünizasyonunu takiben B hücresi aracılı Ig izotip yanıtlarındaki farklılıkları belirlemelerine olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- İmmünoloji
- Antikor yanıtları
- B hücresi aktivasyonu
Arka Plan
- T-bağımlı ve T-bağımsız antikor yanıtlarını anlamak immünolojide kritik öneme sahiptir.
- Ig izotip yanıtlarının karakterizasyonu, humoral immünitenin incelenmesine yardımcı olur.
- Detaylı analizler için akış sitometrisi, ELISA'yı tamamlayabilir.
- Ig izotip yanıtlarının güvenilir ölçümleri, araştırmalar için gereklidir.
Çalışmanın Amacı
- Farelerde Ig izotip yanıtlarını ölçmek için bir protokol sağlamak.
- Farklı antijenlere yanıt olarak B hücresi aktivasyonunu karşılaştırmak.
- Çeşitli bağlamlardaki immün yanıtların anlaşılmasını geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Ig izotipi yanıtlarını nicelendirmek için ELISA.
- B hücresi aktivasyonunu analiz etmek için akış sitometrisi.
- İmmünizasyon için farelere antijen solüsyonu enjeksiyonu.
- Serum analizi için kan örneklerinin toplanması.
Ana Sonuçlar
- Ig izotip yanıtlarının kantitatif ölçümleri gerçekleştirildi.
- Antijen tipine bağlı olarak B hücresi aktivasyonunda farklılıklar gözlemlendi.
- Yöntemin, humoral immüniteyi incelemek için güvenilir olduğu kanıtlandı.
- İleri analizler için berrak serum örnekleri elde edildi.
Sonuçlar
- Bu protokol, antikor yanıtlarının karakterizasyonu için etkilidir.
- B hücresi aracılı bağışıklığa dair bilgiler sağlar.
- Bu yöntem, çeşitli immünolojik çalışmalara uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Sektörel Uygunluk
Bu protokol, biyofarma araştırmacılarının fare modellerinde timusa bağımlı ve timusdan bağımsız immünoglobulin izotip yanıtlarını kantitatif olarak analiz etmelerine olanak tanıyarak B hücresi aktivasyonu ve humoral immüniteye dair mekanistik içgörüler sağlar. Güvenilir ve izotipe özgü ELISA ölçümleri sunarak, aşı ve immünomodülatör geliştirme süreçlerinde hedef doğrulamayı ve öngörücü risk azaltma çalışmalarını destekler. Yöntem, akış sitometrisi gibi tamamlayıcı analizlerle birleştirildiğinde translasyonel sürekliliği artırır ve erken keşif aşamalarındaki karar süreçlerine veri sağlar.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Timus bağımlı ve timus bağımsız stimülasyonlara karşı antijen spesifik IgM ve izotip değiştirmiş IgG/IgA/IgE yanıtlarını nicelendirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasını sağlar.
- Operasyonel Değer: İmmünomodülatör adayların fonksiyonel hedef etkileşimini ve biyolojik aktivitesini açıklığa kavuşturan standartlaştırılmış, tekrarlanabilir serum antikor ölçümleri sunar.
- Öngörücü Değer: İzotip değiştirme paternleri ve hafıza yanıt kinetiğine dayanarak immünojenlerin mekanistik sınıflarını ayırt ederek portföy önceliklendirmesini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Alt akış tarama iş akışları için uygun, kantitatif Ig izotip çıktılarına sahip valide edilmiş biyolojik sistemler (fare serumları) üretir.
- Tekrarlanabilirlik: Tanımlanmış dilüsyon gereksinimleri ve lineer aralık kontrolleri ile standardize edilmiş ELISA prosedürleri sunarak deneyler arasında analiz tutarlılığını sağlar.
- Ölçeklenebilirlik: İmmünojenite tarama kampanyalarında antijen formülasyonlarının, adjuvanların veya genetik modellerin karşılaştırmalı analizi için platformun yeniden kullanımını destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlişki: İnsan humoral immünitesini yansıtan modellerde antijene özgü yanıtların değerlendirilmesine olanak tanıyarak translasyonel biyobelirteç uyumunu destekler.
- Preklinik Süreklilik: İmmünizasyon öncesi ve sonrası boylamsal serum örneklemesi aracılığıyla, erken keşif aşamasındaki Ig izotip profillemesini preklinik doğrulama ile bağdaştırır.
- Riskten Arındırılmış Kararlar: İzotip değişimindeki (örneğin IgG1) kusurları veya belirli hücresel yolaklarla (örneğin T hücresi TRAF3) ilişkili hafıza yanıtlarını belirleyerek ilerleme kriterlerini bilgilendirir.
Pipeline ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, erken hedef doğrulamadan aday bileşik tanımlamaya ve preklinik değerlendirmeye kadar uzanan keşif sürekliliğine uygundur; özellikle izotip profillemenin fonksiyonel sonuçları öngördüğü immünomodülatörler ve aşılar için geçerlidir.
- Keşif Biyolojisi: Antijen maruziyetini tanımlanmış Ig izotip imzalarına (örneğin, TI IgG3'e karşı TD IgG2b) bağlayarak hipotez testlerini ve yolak netleştirilmesini destekler.
- Tarama: Yüksek özgüllük ve hassasiyetle, analiz için hazır, kantitatif okumalar sağlayarak adaylar arasındaki immünojenik potansiyelin güvenilir şekilde karşılaştırılmasına olanak tanır.
- Analitik: Standart eğrilerden interpole edilen 405 nm'de optik yoğunluk tabanlı ölçümler sunarak, antikor titrelerinin gruplar arası istatistiksel karşılaştırmasına imkan verir.
- Translasyonel Araştırma: Aşı adayı değerlendirmesi için kritik olan primer ve hafıza yanıtların boylamsal takibini sağlayarak preklinik süreklilikle uyum sağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: B hücresi aracılı yanıtları içeren birden fazla projeye uygulanabilecek, yeniden kullanılabilir bir immünolojik profilleme aracı oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: B hücresi aktivasyon yollarındaki mekanistik belirsizliği azaltarak hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Tanımlanmış serum dilüsyon protokolleri ve ELISA optimizasyon adımları aracılığıyla standardizasyon ve tekrarlanabilirliği sağlar.
- Stratejik Değer: İzotip profillerini fonksiyonel immün sonuçlarla ilişkilendirerek go/no-go karar verme sürecini iyileştirir ve geç evre biyolojik riskleri azaltır.
- Portföy Etkisi: Adayların istenen izotip değiştirmiş ve bellek yanıtlarını uyandırma kapasitelerine göre risk ayarlı önceliklendirmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Standart eğrilerin doğrusal aralığında doğru kantifikasyon sağlamak için fare immünolojisi, serum işleme ve ELISA optimizasyonu konularında uzmanlık gerektirir.
- Serum işleme ve analiz uygulamaları için mikroplaka okuyuculara, inkübatörlere, santrifüjlere ve steril doku kültürü tesislerine erişime bağımlıdır.
- Veri bütünlüğünü korumak için örnek toplama zamanlaması, kan alma teknikleri (örneğin, retro-orbital) ve saklama koşullarının (−80 °C) ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Farklı fare soylarına, antijenlere (örneğin, TNP-KLH'ye karşı TNP-polisakkarit) veya adjuvan sistemlerine (alum'a karşı PBS) genişletilirken adaptasyon değerlendirmeleri gerektirir.
- Pratik sınırlama: Sinyal doygunluğunu önlemek ve standart eğrilerden doğru interpolasyon sağlamak için örneklerin seri dilüsyonu genellikle gereklidir ve bu durum uygulama süresini artırır.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:04
Title
0:43
2,4,6-Trinitrophenyl (TNP)-polysaccharide and TNP-keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) Immunization and Serum Preparation
1:54
Enzyme-linked Immunosorbent Analysis (ELISA)
4:17
Results: Representative Thymus-independent (TI) and Thymus-dependent (TD) Ig Isotype responses to TNP-polysaccharide and TNP-KLH Immunization
5:36
Conclusion
