Name: Timus bağlı ve timus bağımsız immünglobulin izotip yanıt Immunosorbent Assay enzim bağlı kullanarak farelerde karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Öğrenin farelerde ELISA kullanarak T bağımlı ve T bağımsız immünglobulin izotip yanıtlarını karakterize etme yöntemini. Bu protokol B hücre aktivasyonu ve humoral bağışıklık üzerine güvenilir ölçümler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışmada sağlık hibe R01 CA158402 Ulusal Enstitüleri (s. Xie) tarafından desteklenen ve R21 AI128264 (s. Xie), Savunma Bakanlığı'nın izni W81XWH-13-1-0242 (s. Xie), bir Pilot Ödülü gelen Kanser Enstitüsü New Jersey Grant numarası P30CA072720 ile Ulusal Kanser Enstitüsü (s. Xie), Busch Biyomedikal Grant (s. Xie), Victor Stollar Bursu (A. Lalani) ve bir Anne B. ve James B. Leathem Bursu (S. Zhu).

Bu iletişim kuralı Rutgers Üniversitesi Kurumsal hayvan Araştırma Etik Komitesi kuralları izler. Bütün fareler NIH yönergelere uygun olarak ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmış bir hayvan iletişim kuralı altında kullanılır.
1. hazırlık fareler ve saf fare Sera topluluğu
<ol><li>Bütün fareler bağışıklama deneyler için belirli bir patojen ücretsiz hayvan tesisi tutun.</li>
	<li>Kullanım cinsiyet eşlemeli, Genç Yetişkin (8-12 hafta yaşlı) nakavt ve littermate aynı veliler ve aşılama çalışmaları için kümesler paylaşmak fare kontrol eder.</li>
	<li>Aşılama ve Şekil 1' de gösterildiği gibi serum koleksiyonu zamanlamaları planlayın.</li>
	<li>Saf serum her fare bağışıklama önce 7 gün (-7 gün) hasat. 4. adımda aşağıda ayrıntılı olarak retro-orbital kanama ve serum hazırlama yordamları izleyin.</li>
</ol>2. TNP-polisakkarit (TI antijen) ve TNP-KLH (TD antijen) hazırlanması
<ol><li>İyice 0,5 mg/mL yapmak için steril PBS (pH 7,4) antijen tozlar TNP-polisakkarit stok ve 1 mg/mL TNP-KLH hisse senedi çözümleri geçiyoruz. Aliquot her antijen 0.5 mL/Tube steril microfuge tüpler içine çözüm stok ve uzun süreli depolama için-80 ° C'de aliquots tutun. Birden çok donma ve antijen aliquots tezcan kaçının.</li>
	<li>Enjeksiyon günde TNP-polisakkarit hacmi hesaplamak (50 µg/100 µL/fare) veya TNP-KLH (100 µg/100 µL/fare) enjekte edilir fareler sayısına göre gerekli. Uygun sayıda TNP-polisakkarit veya TNP-KLH aliquots (RT) Oda sıcaklığında erimek.</li>
	<li>TNP-KLH enjeksiyon için ilk final konsantrasyonu 10 mg/ml steril PBS 3 cilt ile şap adjuvan (40 mg/mL) oranında seyreltin. Şap adjuvan karışımı seyreltme önce iyi askıya alınmış olduğundan emin olun.</li>
	<li>10 mg/mL şap adjuvan Bulamaç adım 2.3 ve çözdürülen TNP-KLH çözüm (1 mg/mL) eşit hacmi 5 mL polipropilen boru birleştirmek, iyice karıştırın ve 30 dk. bu TNP-KLH/şap mix taze enjeksiyon önce Prepare için 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
</ol>3. bağışıklama farelerin
<ol><li>Mayi (IP) enjeksiyon TNP-polisakkarit veya TNP-KLH/şap 1 mL insülin şırınga Biyogüvenlik kabine ile fareler bağışıklık için gerçekleştirin. Yaklaşık 30 ° açı tercihen çeyreğinde alt sağ iç organları içine enjeksiyon önlemek için her fare iğne yerleştirin.</li>
	<li>TNP-polisakkarit ı.p. 100 µL fare başına gün 0 TI Ag bağışıklama (Şekil 1A) için enjekte et.</li>
	<li>I.p. 200 µL (taze hazırlanan adım 2.4) TNP-KLH/şap Mix fare başına gün 0 TD Ag bağışıklama için enjekte et. Alttan yukarıya ittirmek aşı olarak günde 21 enjeksiyon aynı bellek çalışmaları (Şekil 1B) için yineleyin.</li>
	<li>Enjeksiyon, ardından her fare onun kafes için dönün ve enjekte fareler belirli patojen arındırılmış durumda tutun.</li>
</ol>4. retro-orbital kanama ve Serum hazırlık
<ol><li>Hasat fare sera farklı zaman noktalarda: TNP-polisakkarit bağışıklama için toplamak fare sera günü -7 ve 7 (resim 1-A); TNP-KLH/şap aşılama için fare sera günü -7, 7, 14 ve 28 (Şekil 1B) toplamak.</li>
	<li>Retro-orbital için kanama, her fare ile %5 isoflurane Biyogüvenlik kabini251-2 min için anestezi. Her fare yeterli anestezi sağlamak için pedal refleks gerçekleştirin.</li>
	<li>Böylece geri dışarı yuva25göz küresi protrudes göz küresi çevresindeki deri çekerek başparmak ve işaret parmağı ile bir elinde imzalat fareyi tutun. Göz çukuru göz küresi25altında iç köşesine 45 °'in bir açıyla bir sigara heparinized Pasteur pipet veya kılcal tüp takın.</li>
	<li>Hafif aşağı doğru basınç uygulayın ve pipet veya hafifçe damar içine kırmaya ve 150-200 µL kan pipet veya tüp toplamak için tüp döndürün. Hemen bir steril 1.5 mL microfuge tüp kan aktarmak ve fareyi kurtarmak için onun kafes dönmek.</li>
	<li>Kan örnekleri RT için 1-2 h koagüle oturup izin.</li>
	<li>Pıhtılaşmış kan örnekleri, 13.000 x g 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi Açık serum kan pıhtısı üstüne yeni bir steril 1.5 mL microfuge tüp aktarın.</li>
	<li>Adımı 4,6 kalan kan pıhtısı kaldırıp açık serum toplamak için bir kez daha yineleyin.</li>
	<li>Aliquot içine steril 1.5 mL microfuge tüpler 50 µL/Tube, serum ve sera-80 ° C'de depolayın</li>
	<li>Her göz için en az iki kere bütün deneyin bled için farklı zaman noktalarda kanama göz alternatif. Kanama terminal, her fare ötenazi önce ilâ 1 mL kan toplamak. Fare ile % 5 CO2 servikal çıkığı tarafından takip ötenazi. Not: Dalak B hücreleri akış sitometrik analizleri ve vitro kültür çalışmaları için hasat edilebilir. Ayrıca her fare genotip doğrulamak için genomik DNA'ları splenocytes hazırlayın.</li>
</ol>5. fare Ig izotip özel ELISA
<ol><li>
Arabellekleri ve çözümleri ELISA önce hazırlayın.
	<ol>
<li>Kaplin arabelleği (PBS, pH 7,4) 500 mL hazırlayın.</li>
		<li>500 mL yıkama çözeltisi hazırlamak (PBS-T (% 0.05 arası 20), pH 7,4).</li>
		<li>100 mL engelleme arabelleği hazırlamak (PBS, pH 7.4, içinde % 1 BSA 4 ° C'de depolanan).</li>
		<li>1 L substrat arabelleği hazırlamak (1 M diethanolamine, pH 9,8 (H2O, 10 M HCl kullanarak ayarlanır pH 1 litre diethanolamine 97 mL) ve 0,5 mM MgCl2). Substrat arabellek gelen ışık şişe alüminyum folyo ile sarma tarafından korumak. 4 ° C'de mağaza</li>
		<li>Durmak eriyik (3 M NaOH) 100 mL hazırlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ELISA plakaları kat:
	<ol>
<li>Toplam serum Ig izotip ELISA için yakalama poliklonal keçi Anti-fare Ig izotip özgü 10 µg/mL ile 96-şey IMMUNO plakalar ceket (M, G1, G2a, G2b, G3, A veya E) Abs içinde kaplin arabellek (PBS) 100 µL/iyi yönü.</li>
		<li>TNP özgü Ig izotip ELISA için 96-şey IMMUNO pilakalar ve 10 µg/mL TNP(38)-BSA PBS içinde 100 µL/iyi, kat.</li>
		<li>Yüksek afinite TNP özgü Ig izotip ELISA için 96-şey IMMUNO pilakalar ve 10 µg/mL TNP(3)-BSA PBS içinde 100 µL/iyi26kat. 4 ° C'de plakaları gecede kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kaplama kuluçka sonra 2 kez 200 µL/iyi PBS-t. ile tabak yıkama Yıkama arabellek atın ve leke kuru (her tabak kağıt havlu bir yığın üzerinde baş aşağı dokunun) levhalar her yıkama sonra.</li>
	<li>Tabakları blok: 200 µL/iyi engelleme eklemek tampon (PBS % 1 BSA) kaplamalı kalıplara ve plakalar RT. 1 h için kuluçkaya</li>
	<li>
Tabakları engelleme iken, Ig izotip standartları ve engelleme arabelleği serum örneklerinde ayrı, tedavi edilmemiş 96-şey plaka, 150 µL/iyi dilutions hazır olun.
	<ol>
<li>Başlangıç standart toplama (St01) 250 ng/mL Ig izotip standartları hazırlamak ve 7-10 1:2 seri dilutions IG standartları yapmak (St02 St07 veya St10, Şekil 2A).</li>
		<li>1: 100 veya 1:500 seyreltme, örnekleri başlangıç seyreltme faktörü ve 3 veya 4 1:10 toplam Ig izotip için seri dilutions veya her serum örneği (Şekil 2A) TNP özgü Ig izotip için 1:5 seri dilutions yapmak fare serum hazırlamak. IgE ELISA, fare serum numuneleri, 1:2 seyreltme faktörü başlangıç seyreltme olarak hazırlamak ve her serum örneği 1:5 seri dilutions 3 olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Engelleme sonra adım 5,4 üç kez 200 µL/iyi PBS-t ile tabak yıkama ve leke kuru tabakları her yıkama sonra.</li>
	<li>100 µL/iyi seyreltilmiş Ig izotip standartları (yakalama ve algılama Abs için uygun) ve seyreltik serum numuneleri adımından 5.5 5.6 adımda hazırlanan tabak aktarın. Standartlar ve örnekleri 4 ° C'de pilakalar gecede kuluçkaya.</li>
	<li>3 kez ile 200 µL/iyi PBS-t tabak yıkama ve leke kuru tabakları her yıkama sonra.</li>
	<li>Her plaka 100 µL/iyi bir uygun alkalen fosfataz (AP) 10 µg/mL eklemek-Konjüge izotip özgü keçi Anti-fare IG (M, G1, G2a, G2b, G3, A veya E) engelleme arabellekte seyreltilmiş Abs.</li>
	<li>AP Birleşik Abs RT. 1-2 h ile plakalar kuluçkaya IgE tespiti için plakalar için 1-2 h 37 ° C'de kuluçkaya</li>
	<li>İki tablet, 5 mg fosfataz substrat 10 ml substrat arabellek çözülerek 1 mg/mL substrat çözeltisi hazırlamak.</li>
	<li>Her plaka 5 kere ile 200 µL/PBS-t iyi yıkama ve leke kuru tabakları her yıkama sonra.</li>
	<li>100 µL/kuyuya substrat çözeltisi, her plaka ekleyin. Genellikle sadece birkaç dakika sürer RT geliştirmek tepki sağlar.</li>
	<li>
405 her plaka okuma nm Mikroplaka Okuyucu ile ilişkili yazılımı kullanarak.
	<ol>
<li>Tıkırtı ""Lm1"dalga boylarında ayarlamak içinayarları", "405 nm" ve "Tamam" düğmesini tıklatın.</li>
		<li>"Şablon"boş"wells,"standartlar"wells ve 96-şey plaka kuruluma göre"Bilinmeyen"wells atamak için" seçeneğini tıklatın.</li>
		<li>"Standartlar" wells için "serisi"İlk örnek"olarak"St01"küme,"Başlamak--dan"üst"seçin ve "çoğaltır" "2" olarak ayarlamak için "'ı tıklatın. "Örnek Descriptor" adlı ve "Standart değeri" giriş: "birim"olarak"ng/mL" seçin, "Başlangıç değeri" "250" olarak ayarlamak, "adım" "2" olarak ayarlayın. "Tamam" düğmesini tıklatın.</li>
		<li>"Ne zaman standart ulaştığı en konsantre bir optik yoğunluk (OD) ~ 1 plaka okumak için oku" seçeneğini tıklatın.</li>
		<li>"Dosya" menüsünü tıklayıp "dosyayı kaydetmek için"Kaydet' i tıklatın.</li>
		<li>"En yoğun standart OD405 ~ 1.5, 2 ve 2.5, sırasıyla yaklaştığında plaka tekrar okumak için,Oku"'ı tıklatın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reaksiyon 25 µL/iyi 3 M NaOH ekleyerek durdurmak. Bir tabak için adımları 5.12-5,15 tamamlamak.</li>
	<li>
Mikroplaka Okuyucu ile ilişkili yazılım kullanarak ELISA verileri çözümleyin:
	<ol>
<li>Okuma dosyaları Ig izotip standartlarının OD405 değerlerini denetleyin ve ayrıntılı veri analizi için standartlar iyi doğrusal dizi ile uygun bir okuma seçin.</li>
		<li>Standart eğriler çizmek için 4-parametre uygun programı seçin. Co-verimli > 0,98 iyi veri kalitesi sağlamak için gerekli olan standart eğri (R2), kontrol edin.</li>
		<li>OD405 değerleri her örneğinin giderek artan bir seyreltme faktörler azaltmak olup olmadığını kontrol edin. Tüm seyreltilmiş örnek wells konsantrasyon "Bilinmeyen" tıklayarak geri.</li>
		<li>Her örnek OD405 ile uygun bir kuyu Ig izotip standart eğri konsantrasyon hesaplaması için doğrusal aralığını seçin.</li>
		<li>Serum Ig izotip toplama formülü kullanarak her örneğinin hesaplamak: serum Ig konsantrasyon seçili iyi konsantrasyon seyreltme faktörü x =.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Grafikleri çizmek ve istatistiksel analizleri uygun yazılım9,10,11kullanarak gerçekleştirebilirsiniz. Dikey scatter araziler serum Ig izotip düzeyleri aynı zamanda noktada IG yanıt-e doğru karşılaştırmak için yapmak. TD bellek yanıt çalışmaları için önce ve sonra alttan yukarıya ittirmek aşı Ig izotip yanıt-e doğru incelemek için zaman-ders yanıt eğrileri olun. Hata çubuklarını örnekleri her grubunun standart sapma (SD) göstermek için kullanın. Ig izotip yanıt farelerin iki genotip arasında karşılaştırmak için istatistiksel anlamlılık belirlemek için unpaired t test için iki-ölçütlü veri kullanın. P değeri < 0,05 olarak önemli ölçüde farklı ayarla.</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali ilgi alanlarına sahip.

Burada, TD ve TI Ig izotip yanıt ELISA kullanarak farelerde karakterizasyonu için protokol açıklayın. Bu protokol başarılı uygulama ELISA tahlil tabaklar, bağışıklama Ags, fare Ig izotip özel antikorlar ve standartlar dahil olmak üzere Tablo 1' de belirtilen malzeme kullanımı gerektirir. Doku kültürü tedavi plakaları ELISA için kullanmamak için özen gösterilmelidir. Dilutions standartları ve serum numuneleri ayrı tedavi edilmezse levha (yuvarlak-alt) yapılır ve ELISA kalıplara ekledi. Bu iletişim kuralın...

B lenfositler humoral bağışıklık asıl Player'da ve memelilerde aynı zamanda immünglobulin (Ig)1,2olarak adlandırılan antikorlar, üretebilen tek hücre tipi vardır. B hücreleri tarafından salgılanan antikorlar patojenler Nötralizasyon, opsonizasyonla ve kompleman aktivasyonu, koruyucu bağışıklık3' e lider gibi çeşitli mekanizmalar yoluyla istila karşı müthiş bir savunma sağlar. B hücreleri tarafından antikorların salgısının sadece normalde iki ayrı3sinyalleri gerektiren tam harekete geçirmek belirli B hücrelerinin sonra elde edilir. Sinyal 1 antijen (Ag) doğrudan bağlama tarafından belirli naif B hücreleri3yüzeyinde ifade B hücre reseptörü (BCR) için geçirilir. Sinyal 2 kaynağına bağlı olarak, B hücre aktivasyonu timus bağımlı (TD) veya timus bağımsız (TI)3,4bölünmüş olabilir. TD antijen yanıt olarak sinyal 2 CD154, co-stimulatory reseptör B hücreleri1,2,3ifade CD40 ligand hızlı harekete geçirmek soydaş CD4 T yardımcı (TH) hücreleri tarafından sağlanır. TI antijen yanıt olarak sinyal 2 Toll benzeri reseptörler ya nişan gelir (TLR 1 türü söz konusu olduğunda TI Ag) veya geniş BCRs ile ilişkilendirerek (tip 2 durumunda TI Ag)3,4B hücreleri. Tip 1 TI (TI-1) antijenleri TLRs, bakteriyel lipopolisakkaritler (LPS), viral RNA'ların ve mikrobiyal CpG DNA4,5gibi bir mikrobiyal ligandlar vardır. Tip 2 TI (TI-2) antijenleri son derece tekrarlayan yapıya sahip ve uzun süreli ve kalıcı birden çok BCRs4,6/ cross-linking tarafından için B hücre sinyallemesi teslim edebiliyoruz. Pnömokok polisakkaritler ve hapten Birleşik polisakkarit6,7TI-2 antijenleri ile ilgili örnekler içermektedir. TD ve TI antijenleri sağlam antijen spesifik IgM yanıt-e doğru çıkarmak ve ayrıca izotip anahtarlamalı antikorlar (IgG, IgA ve IgE) üretim hücreleri (ZPT) dendritik hücreler (DC)1 gibi sunulması antijen tarafından sağlanan yardımı ile neden olabilir ,2,3. Ayrıca, TD ve TI antijenleri bellek yanıtları ZPT yardımıyla ikna edebiliyoruz, ama TD antijenleri bellek B hücre üretimi3,8inducing verimlidir.
Bu protokol için TD ve TI IG yanıt farelerde hapten Birleşik modeli antijenleri 2,4,6-trinitrophenyl-anahtar deliği vantuzlu hemocyanin (TNP-KLH) ve TNP-polisakkarit (bağımsız çok dallı, mayi (IP) aşılama tarafından elde edildi ve yüksek-kütle), sırasıyla9,10,11. TD antijenleri genellikle bir adjuvan ile antikor12üretimini artırmak için kullanılır. Burada bizim iletişim kuralında, TNP-KLH şap, yaygın olarak kullanılan adjuvan aşılama çalışmaları12ile enjekte edilir. Tam ya da eksik Freund's adjuvan (CFA veya IFA), kullanılabilir adjuvan diğer örnekler monophosphoryl-lipid A / trehalose dicorynomycolate ("Ribi" adjuvan) ve KSY oligodeoxynucleotides, vb13, 14. sera TNP özgü antikor sayısal kullanarak Ig izotip özgü enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA)9,10, ve bağışıklama sonra fare sera farklı zaman noktalarda hasat 11.
ELISA yaygın ve Biyomedikal araştırma15,16analitik bir araç olarak tıpta bir tanı aracı olarak kullanıldığı plaka tabanlı bir tahlil olduğunu. Algılamak ve antikorlar, hormonlar, sitokinler, kemokinler ve çeşitli antijenleri, vbdahil olmak üzere analitler ölçmek için kullanılır. ELISA doğrudan, dolaylı, sandviç ve rekabetçi ELISA15,16da dahil olmak üzere, birkaç farklı biçimlerde gerçekleştirilebilir. Genel olarak, birincil bir antikor ile inkübe genellikle bir 96-şey microtiter plaka, sağlam bir yüzeye antijen immobilizasyon içerir. Kuluçka sonra ilişkisiz antikor yıkadı. Bir doğrudan ELISA, birincil antikor doğrudan hangi gibi bir sinyal algılama aracı tarafından algılanan bir görünür renk değişikliği vermeye chromogenic bir substrat ayırmak bir enzim için (genellikle horseradish peroksidaz veya alkalen fosfataz), Birleşik bir Spektrofotometre15,16. Bir enzim bağlı ikincil antikor birincil antikor bağlamak için kullanılan, buna ek olarak, o zaman bu bir dolaylı ELISA15,16kabul edilir. Dolaylı ELISA daha duyarlı15,16ise doğrudan ELISA daha hızlıdır. Bir sandviç ELISA, tabakları faiz örneklerde antijen hareketsiz için kullanılan bir "yakalama" antikor ile kaplı olan ve daha sonra yakalanan antijen bir doğrudan veya dolaylı şekilde15, başka bir "algılama" antikor tarafından tespit edilebilir 16. sandviç ELISA sunar yüksek özgüllük beri antijen iki farklı antikor-antijen tarafından algılanır. Rekabetçi bir ELISA, rekabet örnek antijen ve plaka bağlı antijen için birincil antikor bağlanma arasında kurulan ve örnek antijen konsantrasyonu substrat sinyalini azalma ölçerek sonra sayılabilir 15 , 16. rekabetçi ELISA yukarıda belirtilen doğrudan veya dolaylı biçim kullanılarak yapılır ve tek epitope15,16ile küçük antijenleri tespiti için yararlıdır.
Electrochemiluminescence (ECL) tahlil ve yüzey plasmon rezonans (SPR) tahlil17, antikorların ölçümü için alternatif teknikleri radyo-immunoassay (RIA) içerir. RIA ilk immunoassay yüksek özgüllük ve radiolabeled kimyasalları18,19kullanarak hassasiyeti ile bu önlemleri bir antijen (veya antikor) varlığını gelişmiş olmasıdır. Ancak, kaygılar radyoaktif toksisite, bertaraf maliyeti, raf ömrü ve radyoaktif malzeme ile çalışmak için özel lisans nedeniyle ELISA daha iyi bir ve20,21ortak için daha uygun bir teknik kullanır. ECL olduğunu hangi chemiluminescent reaksiyonlar istikrarlı öncüleri bir elektrot yüzeyinde büyük ölçüde reaktif türler oluşturmak için elektrik kullanarak başlatılır ve analitler miktarını ölçmek için kullanılan son derece hassas bir tahlil (antijenleri gibi veya antikorlar)22. Ancak, ECL özel bir araç gerektirir ve böylece kadar geniş ELISA23kullanılmaz. SPR olduğunu ligandlar bağlama ölçmek için kullanılan bir doğrudan tahlil (e.g., antikorlar) molekülleri immobilize (e.g., antijenleri) bir sensör üzerinde yüzey24chip. SPR etkileşimleri çok özellikle gerçek zamanlı olarak algılar ve ELISA olduğu gibi etiketli reaktifler kullanımını gerektirmez. Ancak, SPR Ayrıca özel bir ekipman gerektirir ve ELISA17daha düşük duyarlılık vardır. Alternatif yöntemleri kısıtlamaları göz önüne alındığında, ELISA amacımız bu iletişim kuralı için en uygun ve uygun teknik olduğunu. Burada, biz sandviç ELISA toplam Ig izotip düzeyleri Analizi ve antijen spesifik IG isotypes analizi için dolaylı ELISA işlemleri için nasıl kullanılacağını açıklar.

<table><tbody><tr><td>VersaMax Ayarlanabilir Mikroplaka Okuyucu</td><td>MDS Analitik Teknolojiler</td><td>VERSAMAX</td><td>Plakaları okumak için ekipman</td></tr><tr><td>SOFTmax PRO 5.3 MDS</td><td>Analitik Teknolojiler</td><td>SOFTmax PRO 5.3</td><td>Plaka okuyucu için yazılım</td></tr><tr><td>GraphPad Prizma GraphPad</td><td></td><td>Prism</td><td>Grafik ve istatistik yazılımı</td></tr><tr><td>TNP-AECM-polisakkarit (FICOLL)</td><td>Biyoarama Teknolojileri</td><td>Bağışıklama için F-1300-10</td><td>A TI Ag</td></tr><tr><td>TNP-KLH</td><td>Biyoarama Teknolojileri</td><td>T-5060-5</td><td>Bağışıklama için A TD Ag</td></tr><tr><td>TNP(38)-BSA</td><td>Biyoarama Teknolojileri</td><td>T-5050-10 (konjugasyon oranı: 38)</td><td>TNP'ye özgü ELISA için Kaplama</td></tr><tr><td>Ag TNP(3)-BSA</td><td>Biyoarama Teknolojileri</td><td>T-5050-10 (konjugasyon oranı: 3)</td><td>Yüksek afiniteli TNP'ye özgü Ig</td></tr><tr><td>Imject Şap için Kaplama Ag</td><td>Fisher Bilimsel&nbsp;</td><td>PI-77161</td><td>Bağışıklama için şap adjuvanı</td></tr><tr><td>Falcon Polipropilen tüpler</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>14-959-11A</td><td>TNP-KLH / şap</td></tr><tr><td>BD İnsülin Şırıngası</td><td>Fisher Scientific'in inkübasyonu için&nbsp;</td><td>14-829-1B</td><td>Farelerin i.p. enjeksiyonu için</td></tr><tr><td>Immuno 96 Kuyulu Plakalar, Düz Tabanlı</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>14-245-61</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>İşlenmemiş 96 Kuyucuklu Mikroplakalar için, Yuvarlak Tabanlı</td><td>VWR</td><td>82050-622</td><td>Standartların ve numunelerin seri seyreltmeleri için</td></tr><tr><td>Fosfataz substratı, 5 mg Tabletler</td><td>Sigma</td><td>S0942-200TAB</td><td>AP substrat</td></tr><tr><td>Dietanolamin</td><td>VWR</td><td>IC15251690</td><td>AP substrat tamponunun bir bileşeni</td></tr><tr><td>Keçi anti-fare IgM</td><td>SouthernBiotech</td><td>1020-01</td><td>Fare için Ab'yi yakalayın IgM</td></tr><tr><td>Keçi anti-fare IgG1</td><td>SouthernBiotech</td><td>1070-01</td><td>Fare IgG1 için Ab'yi yakalayın</td></tr><tr><td>Keçi anti-fare IgG2a</td><td>SouthernBiotech</td><td>1080-01</td><td>Fare için Ab'yi yakalayın IgG2a</td></tr><tr><td>Keçi anti-fare IgG2b</td><td>SouthernBiotech</td><td>1090-01</td><td>Fare için Ab'yi yakalayın IgG2b</td></tr><tr><td>Keçi anti-fare IgG3</td><td>SouthernBiotech</td><td>1100-01</td><td>için Ab'yi yakalayın fare IgG3</td></tr><tr><td>Keçi anti-fare IgA</td><td>SouthernBiotech</td><td>1040-01</td><td>Fare IgA Keçi</td></tr><tr><td>anti-fare IgE</td><td>SouthernBiotech</td><td>1110-01</td><td>Fare IgE</td></tr><tr><td>AP-Keçi anti-fare IgM</td><td>SouthernBiotech</td><td>1020-04</td><td>Fare IgM</td></tr><tr><td>AP-Keçi anti-fare IgG1</td> için <td>Algılama Ab SouthernBiotech</td><td>1070-04</td><td>Fare IgG1 için Algılama Ab</td></tr><tr><td>AP-Keçi anti-fare IgG2a</td><td>SouthernBiotech</td><td>1080-04</td><td>Fare IgG2a için Algılama Ab</td></tr><tr><td>AP-Keçi anti-fare IgG2b</td><td>SouthernBiotech</td><td>1090-04</td><td>Fare IgG2b için Algılama Ab</td></tr><tr><td>AP-Keçi anti-fare IgG3</td><td>SouthernBiotech</td><td>1100-04</td><td>Fare IgG3</td></tr><tr><td>AP-Keçi anti-fare IgA</td> için <td>Algılama Ab SouthernBiotech</td><td>1040-04</td><td>Fare IgA</td></tr> <tr>için Algılama Ab<td>AP-Keçi anti-fare IgE</td><td>SouthernBiotech</td><td>1110-04</td><td>Fare</td></tr><tr><td>IgE Fare IgM standardı</td><td>BD Biosciences</td><td>553472</td><td>TNP'ye özgü IgM, Klon için Algılama Ab; G155-228</td></tr><tr><td>Fare IgG1 standardı</td><td>BD Biosciences</td><td>554054</td><td>TNP'ye özgü IgG1, Klon&nbsp; 107.3</td></tr><tr><td>Fare IgG2a standardı</td><td>BD Biosciences</td><td>556651</td><td>TNP'ye özgü IgG2a, Klon&nbsp; G155-178</td></tr><tr><td>Fare IgG2b standardı</td><td>BD Biosciences</td><td>554055</td><td>TNP'ye özgü IgG2b, Klon&nbsp; 49.2</td></tr><tr><td>Fare IgG3 standardı</td><td>BD Biosciences</td><td>553486</td><td>KLH'ye özgü IgG3, Klon&nbsp; A112-3</td></tr><tr><td>Fare IgA standardı</td><td>BD Biosciences</td><td>550924</td><td>Mineral yağ kaynaklı IgA, Klon&nbsp; MOPC-320</td></tr><tr><td>Fare IgE standardı</td><td>BD Biosciences</td><td>557079</td><td>TNP'ye özgü IgE, Klon&nbsp; C38-2</td></tr></tbody></table> Serisi

timus bağlı ve timus bağımsız immünglobulin izotip yanıt immunosorbent assay enzim bağlı kullanarak farelerde karakterizasyonu

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

B lenfositler, humoral bağışıklık içinde plasmablasts/plazma hücreleri tarafından salgılanan immünoglobulinler (Ig), Ayrıştırılan olarak da adlandırılan antikorlar, çeşitli mekanizmalar yoluyla patojenler istila karşı müthiş bir savunma sağlar. Aşı bir ana amacı hayati enfeksiyonları önlemek için koruyucu antijen spesifik antikorlar teşvik etmektir. Hem timus bağlı (TD) ve timus bağımsız (TI) antijenleri sağlam antijen spesifik IgM yanıt-e doğru çıkarmak ve ayrıca izotip anahtarlamalı antikorlar (IgG, IgA ve IgE) üretimi yanı sıra bellek B hücreleri yardımıyla nesil neden olabilir antijen sunan hücreler (ZPT) tarafından sağlanan. Burada, TD ve TI Ig izotip yanıt enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) kullanarak farelerde karakterize için bir protokol açıklayın. Bu protokol için TD ve TI IG yanıt farelerde mayi (IP) aşılama ile hapten Birleşik modeli antijenleri TNP-KLH (şap içinde) ve TNP-polisakkarit (PBS) içinde tarafından sırasıyla elde edildi. TD bellek yanıt ikna etmek için 3 hafta sonra aynı antijen/adjuvan ile ilk aşılama TNP-KLH bir alttan yukarıya ittirmek aşı şap içinde verilir. Fare sera farklı zaman noktalarda öncesi ve sonrası aşılama hasat. Serum Ig düzeyleri toplam ve TNP özgü antikorların Ig izotip özel sandviç ve dolaylı ELISA, sırasıyla kullanarak daha sonra sayılabilir. Doğru her Ig izotip serum konsantrasyonu ölçmek için örnekleri uygun standart eğrileri doğrusal Aralık içinde sığacak şekilde seyreltilmiş gerekir. Bu iletişim kuralını kullanan, biz sürekli olarak güvenilir sonuçlar yüksek özgüllük ve hassasiyet elde etmiş olursunuz. Akış Sitometresi, dalak B hücreleri ve immunohistokimyasal vitro kültür gibi diğer tamamlayıcı Yöntemler ile birlikte kullanıldığında (IHC) boyama, bu iletişim kuralını araştırmacılar antikor kapsamlı bir anlayış kazanmak izin verir Yanıt verilen bir deneysel ortamda.

Bağışıklık sisteminin, TRAF3, TI ve TD Ig izotip yanıt-e doğru9,10,11kritik bir regülatör rollerini araştırmak için bu protokolü kullanmış. TRAF3 doğrudan veya dolaylı olarak düzenleyen doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık reseptörleri TNF reseptör süper dahil olmak üzere, bir dizi sinyal iletimi, Toll benzeri reseptörler ve T hücre reseptör/CD28, diğerleri arasında27<su...

Bu yazıda, biz T-bağımlı ve T-bağımsız immünglobulin (Ig) izotip yanıt ELISA kullanarak farelerde karakterize için bir protokol tanımlamak. Bu yöntem tek başına veya kullanılabilir akış ile birlikte sitometresi araştırmacılar T-bağımlı ve bağımsız T antijen bağışıklama takip farelerde B hücre-aracılı Ig izotip yanıtlarında farkları belirlemek için izin verir.

Timus bağlı ve timus bağımsız immünglobulin izotip yanıt Immunosorbent Assay enzim bağlı kullanarak farelerde karakterizasyonu

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Bu yöntem, immünoloji alanında antijen bağışıklamasına bağlı bağımlı ve bağımsız antikor yanıtlarının yanı sıra B hücresi aktivasyonu ve germinal merkez reaksiyonları hakkındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, farelerde B hücre aktivasyonu ve humoral bağışıklığın doğrudan karşılaştırılması ile güvenilir ve kantitatif Ig izotip yanıt ölçümleri sağlamasıdır. TNP-polisakkarit bağışıklaması için, fare başına 100 mikrolitre taze hazırlanmış antijen çözeltisi ile bir mililitre insülin şırıngası yükleyin ve alt organ enjeksiyonunu önlemek için iğneyi her hayvanın sağ alt çeyreğine yaklaşık 30 derecelik bir açıyla yerleştirin.Tüm fareler enjekte edildiğinde, hayvanları belirli bir patojen içermeyen tesiste barınmak üzere kafeslerine geri koyun. Uygun deneysel zaman noktalarında, retro-orbital kanama ile aşılanmış her hayvandan 150 ila 200 mikrolitre kan toplayın ve örneklerin oda sıcaklığında bir ila iki saat boyunca pıhtılaşmasına izin verin. İnkübasyonun sonunda, pıhtılaşmış kan örneklerini santrifüjleyin ve berrak serumu her bir kan pıhtısının üstünden steril bir 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın.Kalan kan pıhtısını çıkarmak içi

characterization-thymus-dependent-thymus-independent-immunoglobulin

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, önceden aşılanmış farelerde yeni bir nanoemülsiyon adjuvan aşısına karşı antikor bağışıklık tepkisini değerlendirmek için bir yöntemi göstermektedir. Bağışıklama, IgG antikor titrelerinin belirlenmesiyle doğrulandığı gibi antikor yanıtını arttırır.

Bir fare serumunda bir test aşısına karşı immünoglobulin G seviyelerinin ölçülmesi

Diğer T hücresi alt kümelerinin farklı efektör işlevleri ile, Th17 hücreleri merkezi inflamatuar otoimmün implike edilmiştir. Bu in vitro Th17 farklılaşma protokolü naif CD4 + T lenfositleri Th17 hücrelerine ayırt edebilir, ve daha fazla otoimmün ve konak cevabı rollerini incelemek belirlemek için bir araç sağlar.

İzolasyon ve naif CD4 T Lenfositler Th17 Farklılaşma

Burada izolasyonu, tanımlanması ve fare timik epitelial hücreler üzerinde (Tecs) saflaştırılması için etkili bir yöntem tarif eder. Bu protokol, normal T-hücresi gelişimi, timus disfonksiyon ve T hücresi sulandırılacak timus fonksiyonunun çalışmaları için kullanılabilir.

İzolasyon, tanımlama ve Murin Thymic Epitel Hücreleri saflaştırılması

Farelerde sınıf anahtarı rekombinasyonunun in vitro analizi, B hücrelerinin yüzeyindeki Fc reseptörlerine bağlı sitofilik IgE molekülleri nedeniyle zordur.  Sitoplazmik floresan boyama için fiksasyon ve geçirgenlikten önce yüzeye bağlı IgE'nin tripsin aracılı bölünmesini kullanarak IgE tespiti için bir yöntem tarif ediyoruz.

Doğru Algılama Fare B Lineage Hücreleri IgE-ifade

Bu rapor, immün yetmezliği olan fare alıcılarının böbrek kapsülü altına farklı yaştaki donör farelerden murin timi naklinin ayrıntılı bir tanımını sağlar. Bu yaklaşımın amacı, T hücresi gelişimi ve timik seçim olaylarını in vivo olarak modellemektir.

İzolasyon ve Farklı Yaşlı Fare Timik Greft Nakli.

Naif CD4+ T hücreleri, aktivasyon sırasındaki ortama bağlı olarak çeşitli alt kümelere polarize olur.  Naif CD4 + T hücrelerinin çeşitli efektör alt kümelerine farklılaşması, T hücresi reseptör uyaranlarının ve spesifik sitokin sinyallerinin eklenmesiyle in vitro olarak elde edilebilir.

Fare Naif CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Hücre İzolasyonu ve<em&gt; In vitro</em&gt; T hücre alt içine Farklılaşma

Bu makale, T hücresi soylarının nesil, fenotip ve sayı kinetiğinin analizi ile timik çökelme öncüllerini karakterize etmek için in vivo ve in vitro metodolojiyi açıklamaktadır.

Timus Karakterizasyonu kullanma Fare Embriyo atalarıdır Settling<em&gt; In Vivo</em&gt; Ve<em&gt; In Vitro</em&gt; Tahliller

Hidoma teknolojisine dayalı monoklonal antikorların üretilmesi için optimize edilmiş bir protokol sunulmuştur. Fareler bir immünokonjugat ile aşılandı. Dalak hücreleri, PEG ve ölümsüz miyelom hücreleri ile bir elektrik darbesi ile kaynaştırıldı. Antikor üreten hibridoma hücreleri HAT ve antijene özgü ELISA taraması ile seçildi.

Hibridoma teknolojisi ile murin monoklonal antikorlar üretilmesi

Bu çalışmada, biz bir roman ve lenfositlerin izolasyonu için etkili iletişim kuralı Peyer's yamalar (PPs), daha sonra in vivo ve in vitro fonksiyonel deneyleri için hem de akış sitometrik çalışmalar foliküler t kullanılabilir sunmak yardımcı ve germinal Merkez B hücreleri.

Humoral bağışıklık çözülen anahtar oyuncular: gelişmiş ve lenfosit yalıtım antikorundan Peyer's yamalar iletişim kuralından en iyi duruma getirilmiş

Burada periton, dalak ve kemik iliği dokularındaki murin immün B hücre bölmesinin akış sitometrisine göre heterojenliğinin basit bir analizinde açıklanmaktadır. Protokol diğer fare dokularına uyarlanabilir ve genişletilebilir.

Murine B Hücre Gelişiminin Akış Sitometrik Karakterizasyonu

Manyetik boncuk bazlı T hücresi zenginleştirmesi ve peptit: majör histouyumluluk kompleksi (MHC) tetramerleri aracılığıyla fare akciğerlerindeki nadir antijene özgü T hücresi popülasyonlarını izole etmek ve tanımlamak için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Fare Akciğerlerinden Nadir Antijene Özgü T Hücrelerinin Peptit ile Tanımlanması: Majör Histouyumluluk Kompleksi Tetramerleri

Öğrenin farelerde ELISA kullanarak T bağımlı ve T bağımsız immünglobulin izotip yanıtlarını karakterize etme yöntemini. Bu protokol B hücre aktivasyonu ve humoral bağışıklık üzerine güvenilir ölçümler sağlar.

Timus bağlı ve timus bağımsız immünglobulin izotip yanıt Immunosorbent Assay enzim bağlı kullanarak farelerde karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet