Amip kullanarak bir yansıma tabanlı hızlı bakteriyel virülans tahlil

Bu yöntem, bakteri hücrelerinde konak öldürücü virülans efektörlerinin ne zaman eksprese edildiği ve yüzeye bağlı implantonik hücrelerin virülans durumları nelerdir gibi bakteriyel patogenez alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hızlı, kantitatif olması ve konakçı hücrelerin kullanımının nispeten kolay olmasıdır. Bu yöntem için ilk olarak, Pseudomonas'ın yüzeye bağlı implantonik alt popülasyonunun farklı konak öldürme fenotiplerine sahip olduğunu fark ettiğimizde aklımıza geldi.

Başlamak için, metin protokolünde belirtildiği gibi E.coli suşu BR'yi gece boyunca büyütün. Daha sonra E.coli kültürünü oda sıcaklığına getirin. Tahta bir çubuk kullanarak, amipleri kültürün 750 litresine aşılayın.

Hemen 700 l amip E.coli karışımını bir GYP plakasına ekleyin. Kültürü plakanın yüzeyine eşit şekilde yaymak için plakayı eğin. Ardından plakayı yüksek nem oranını koruyan bir kutuya yerleştirin.

Kutunun içindeki plakayı 22 ° C'de dört ila beş gün boyunca inkübe edin. Kuluçka süresi bittikten sonra, plakanın yarısından amip sporlarını toplamak için steril bir pipet ucu kullanın. Ardından, pipet ucundaki amipleri 1 mL PS ortamında yeniden süspanse etmek için yukarı ve aşağı pipetleyin.

Aşı karışımını, antibiyotik antimikotik solüsyonu ile desteklenmiş 25 mL PS ortamı ile 250 mL'lik bir şişeye aktarın. Amipleri 22 ° C'de 100 rpm'de dönen bir çalkalayıcıda büyütün. Pseudomonas aeruginosa'yı gece boyunca kültürledikten sonra, kültürü 6 cm'lik bir petri kabında PSB ortamı ile seyreltin.

Daha sonra kültürü 37 ° C'de 100 rpm'ye ayarlanmış bir tezgah üstü döndürücüde çalkalayın.İlk mikrodalgada 250 mL'lik bir şişede DB tamponunda 50 mL% 1 agar. 15 mL erimiş agar'a 15 L kalsiyum ekleyin ve hafifçe karıştırın. Erimiş agar karışımını 12 x 10 cm'lik bir cam tabağa dökün ve agarın oda sıcaklığında on dakika katılaşmasına izin verin.

Ardından, katılaşmış agar pedini 1,5 x 1,5 cm'lik daha küçük bölümler halinde kesmek için metal bir cetvel ve baskılı bir ızgara kullanın. Kullanıma hazır olana kadar jelin nemli kaldığından emin olun. Daha sonra, yüzeye tutturulmuş hücreleri izole etmek için, sıvı ortamı petri kabından çıkarın.

Daha sonra planktonik hücreleri çıkarmak için kabı 1 mL geliştirme tamponu ile yıkayın. Yüzeye bağlı bakteri hücrelerinin virülansını test etmek için, daha önce elde edilen yüzeye bağlı bakteri hücrelerinden 10 L amip hücresi ekleyin. Planktonik hücreleri izole etmek için, kültürün 10 L'sini taze bir petri kabına aktarın.

Daha sonra, 10 L amip hücresini daha önce elde edilen planktonik bakterilerle karıştırarak planktonik hücrelerin virülansını test edin. Küçük agar pedini hemen petri kabı yüzeyindeki uygun bakteri amip karışımının üzerine yerleştirin. Ardından, fazla sıvıyı hafifçe pipetleyerek fazla sıvıyı çıkarın ve yemeğin 20 dakika kurumasını bekleyin.

Çanağı kapakla örtün ve oda sıcaklığında 40 dakika daha inkübe edin. Son olarak, en az 100 amip hücresi için görüntü elde etmek için bir floresan mikroskobu kullanın. Bu protokolde, planktonik ve yüzeye bağlı Pseudomonas aeruginosa hücrelerinin virülansı test edildi.

Yüzeye bağlı vahşi tip Pseudomonas aeruginosa, yuvarlak bir amip hücre şekli ve kalsein floresansının varlığı ile gösterilen amipleri öldürdü. Planktonik hücrelerle karşılaştırıldığında, yüzeye bağlı vahşi tip Pseudomonas aeruginosa yüksek bir konak öldürme indeksine sahipti. Planktonik hücreler, amorf amip hücre şekilleri ve nispeten az kalsein floresansı ile gösterilen amip tarafından tüketildi.

Bu prosedürü denerken, taze bir kalsein, ve amip hücreleri stoğu kullanmayı unutmamak ve amipin optik yoğunluğunu yakından takip etmek önemlidir. Bu prosedürü takiben, planktonik ve yüzeye bağlı alt popülasyonda hangi genler aktive edilir? gibi ek soruları yanıtlamak için transkripsiyon profili oluşturma gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, hızlı görüntü tabanlı virülans testinin nasıl yapılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.