Name: Gaz kromatografi-kütle spektrometresi (GC-MS) Drosophila larva örnekleri hazırlanması-Metabolomics dayalı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Öğrenin Drosophila larva örneklerini GC-MS tabanlı metabolomik analiz için nasıl hazırlayacağınızı. Bu hassas ve tekrarlanabilir yöntem, 100'den fazla metabolitin doğrudan ölçümünü sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Indiana Üniversitesi kütle spektroskopisi tesis ve Utah Üniversitesi Metabolomics çekirdek tesis bu iletişim kuralı en iyi duruma getirme konusunda yardım için teşekkür ederiz. J.M.T. tarafından ulusal genel tıbbi Bilimler Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri Ödülü numarası R35GM119557 altında desteklenir.

1. yumurta toplama
<ol><li>Yetişkin erkek ve istenen genotip bakire kadın toplamak. Tek tek bu hayvanlara yiyecek şişe standart Bloomington medya ile 3-5 gün için yaş.</li>
	<li>Uygun matings kadar 50 bakire kadın ve 25 erkekler için yeni bir gıda şişe aktararak ayarlayın. Not: Her genotip için en az altı bağımsız matings ayarlanmalıdır. Sadece bir örnek her (altı bağımsız matings toplanan Yani, altı örnekleri) çiftleşme üzerinden toplanacaktır.</li>
	<li>
Pekmez yumurta döşeme kapaklar hazırlayın.
	<ol>
<li>115 mL pekmezi ve agar 29 g H2O 2 lt şişeye içinde 700 mL ile karıştırın.</li>
		<li>Pekmez agar karışımı sıcak plaka üzerinde kaynatın.</li>
		<li>70 ° C'ye serin</li>
		<li>Asit karışımı (20 mL % 85 fosforik asit ve 209 mL propiyonik asit H2O; 1 L 25 mL ekleyin Bir kahverengi şişe deposunda) ve 10 mL % 10 p-hidroksi-benzoic asit metil ester % 95 etanol içinde.</li>
		<li>Pekmez agar 35 x 10 mm2 doku kültürü çanak kapağı ve alt bölümünü içine dökün. Not: pekmez ağar kaplamalar dökülmeden önce kapakları ve/veya 35 x 10 mm2 tabak tabanının kuytu bir Drosophila hisse senedi şişe (adım 1,6 olarak açıklanan) ağız içine sığacak emin olun. Bankası kullanılan plakalar marka bağlı olarak kullanılamayabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Taze Maya distile su ekleyerek yapıştırmak için etkin hale getirmek Kuru Maya (5 g Maya/7 mL su) karışım kadar katı bir yüzeye (yani, fıstık ezmesi tutarlılığını) kolayca yayılabilir bir hamur haline gelir.</li>
	<li>Yaklaşık 1.5 g Maya hamur bir pekmez yumurta döşeme kap yüzeyinde yayılmış.</li>
	<li>Dört hava delikleri bir plastik 6 oz. Drosophila hisse senedi şişe 22 G iğne kullanarak ters tarafı poke.</li>
	<li>Yeni şeklindeki sineklerin yiyecek şişe kültür şişe aktarın. Not: Sinekler tarafından aktarılabilir olarak geçici bir anestezi veya şişe şişenin ağzına üst tutarak ve keskin bir benchtop karşı şişe dibinde dokunarak CO2 kullanarak.</li>
	<li>Hızlı bir şekilde bir pekmez yumurta döşeme kap Maya Yapıştır ile yüzey Drosophila hisse senedi şişe ağız içine yerleştirin. Laboratuvar bant yerde yumurta döşeme kap güvenliğini sağlamak için kullanın. Not: sinekler aktarmak için imzalat rahip olsaydı, tüm sinekler iyileşti kadar şişe yatay olarak benchtop üzerinde yer almalıdır. Sinekler tamamen mobil olduğunda, bir kuluçka pekmez yumurta döşeme kap alt kültür ile şişe yerleştirin.</li>
	<li>Pekmez yumurta atarken kapağı günde en az bir kez ilk iki gün için hisse senedi şişeyi ters çevirme, benchtop karşı şişenin dibinde dokunarak, eski yumurta kap kaldırarak ve yeni bir yumurta kap şişenin ağzına getirdikten hemen değiştirin. Eski yumurta atarken kapağı atmak. Not: Bu adım dişi yumurtalarını tutuyorsun değil ve senkronize nüfus topluluğu için sağlar sağlar.</li>
	<li>Yeni bir yumurta döşeme kap sonra günde 3, 2 h sonra Değiştir hisse senedi şişe içine yerleştirin ve atın. Kaldırmak ve dört saat sonra ikinci yumurta atarken kapağı değiştirin. Bu yumurta döşeme kap Tarih, saat ve genotip ile alt etiket. Not: Bu 4 h pencere sırasında toplanan yumurta analizi için kullanılır. Bu eşitleme özel gelişim aşamalarında analiz etmek için kritik bir adımdır. Yumurta bu şekilde birkaç gün için toplanabilir.</li>
	<li>Yumurta döşeme kapaklar bir 60 x 15 mm2 Petri tabağı ve kuluçka istenilen sıcaklık ve nem yerine takın.</li>
	<li>Yumurta döşeme kapaklar her gün açlık, nüfus yoğunluğu veya kirlenme ile ilgili sorunlar için kontrol edin. Not: Larva sürekli gelişimi sağlamak için yeterli gıda erişiminiz olmalıdır. Gerekirse, taze Maya Yapıştır deneyde kullanılacak Tüm yumurta döşeme kapaklar üzerindeki yayılabilir. Buna ek olarak, larva nüfus yoğunluğu çok yüksek ise larva kültür plaka dışarı dolaşmaya başlayacak. Yüksek nüfus yoğunluğu ve açlık wandering süre deneyimli ara nöbetleri tutarsız verilerde neden olur çünkü bu örnekler metabolomic analiz için kullanılmamalıdır. ~ 80 – 100 yoğunluğu orta orta üçüncü biçim (L3) plaka başına larva tavsiye edilir ikinci biçim larva (L2) veya plaka başına 40-50. Gözle görülür bakteri ve mantarlar ile kontamine örnekleri atılmalıdır.</li>
</ol>2. larva örnek koleksiyonu
<ol><li>İstenen sahne kadar yaş larvaları. L3 larva toplama, L2-L3 tüy dökme, örnekleri yeniden eşitleyin. Yeniden eşitleme işlemi yaygın gelişimsel kilometre taşı15ön vızıltısı kullanan bir yukarıda açıklanan yöntemi kullanarak elde edilir. Alternatif olarak, orta-L3 larva sgs3 muhabir gen16kullanarak eşitlenebilir. Not: Bu bağlamda, biz bulmak L2 orta larva (~ 60 yumurta döşeme sonra h) çoğu analizleri için idealdir larva gelişme bu aşamada hala nispeten zaman uyumlu olduğundan, özenle toplanan örnekleri var bu timepoint için geliştirmek için yeterli yiyecek ve yönetilebilir (aşağıya bakın) hayvanlar örnek başına sayısıdır. L3 geliştirme sırasında oluşan çok sayıda ecdysone bakliyat metabolizma üzerinde dramatik etkiler ve eserler eşitlenmemiş nüfus oluşturur çünkü bir ek eşitleme adım L3 larva için gereklidir.</li>
	<li>Parçalanmış bir iğne hafifçe Maya Yapıştır agar kapalı kaldırmak için kullanın. Maya yeni bir pekmez agar kap üzerine yerleştirin. Not: Çoğu larva pekmez agar ve Maya Yapıştır arasında arayüz, yiyeceğim.</li>
	<li>Larva pekmez agar yeni maruz yüzeyinden toplamak için küçük bir fırça kullanın. Larvalar buz üzerinde 1,5 mL santrifüj tüpü yerleştirin. Not: Her gelişim aşaması için uygun örnek boyutları aşağıdaki gibidir: 50 ilk biçim larva (L1); 25 orta-L2 larva; 20 erken L3 larva; 15 L3 orta veya geç L3 larvaları.</li>
	<li>Yıkama ve büyük örnek kümesi toplarken örnekleri (adım 2,3 2,8 ile) küçük gruplar halinde (4-6 örnekleri) dondur. Örnekleri larva tüplerde yerleştirerek 20 dk içinde donmuş olmalısın. Not: Diğer tüpler örnek transfer sırasında adım 3 ile girişime neden olabilir çünkü Eppendorf 1.5 mL tüpler Flex kullanmanızı öneririz. Örnekleri microfuge tüplerde toplanan gerekir. 3.1. adımda anlatılan boncuk tüpler örnekleri toplamayın. Seramik Boncuklar yanlış kitle ölçüm sonuçları ve kirletici örnek tanıttı NaCl yıkama çözüm korur.</li>
	<li>Buz gibi %0,9 1 mL ekleyin NaCl içine tüp, kapağını kapatın ve dikey olarak tüp iyice larvalar yıkamak için ters çevirin.</li>
	<li>Tüp buz ~ 30 için geri koyun s. Bu süre içinde larva tüp alt batacağı ama Maya süspansiyon kalacaktır. Bir kez tüm larva gevşek Pelet oluşturdular, 1 mL pipet kullanarak NaCl çözüm kaldırın.</li>
	<li>Adım 2.4 ve adım 2.5 iki kez yineleyin veya son yıkama çözüm kadar temizleyin. Not: Ek yıkama adımlar toplanan örnek Maya aşırı miktarda varsa gerekli olabilir.</li>
	<li>2.000 × g 4 ° C'de 1 dk. için de örnekler santrifüj kapasitesi</li>
	<li>Tüm kalıntı çözüm 200 µL pipet kullanarak kaldırın.</li>
	<li>Hemen örnek sıvı azot dondur. Not: Bu adımda protokol duraklatılmış. Örnekleri-80 ° C'de 3 aya kadar saklanabilir</li>
</ol>3. transferi örnekleri boncuk tüpler için
<ol><li>Larva her örnek 1.5 mL microfuge tüpünden 1.4 mm Seramik Boncuklar içeren 2 mL screwcap tüpler aktarılması gerekir. Bu transfer adım için hazırlık olarak, bir etanol geçirmez işaretleyici (kapak üzerindeki işaretleri adımı sırasında 4.4 yok olacak) bir 2 mL screwcap boncuk tüp tarafında etiketlemek için kullanın.</li>
	<li>Dara doğru 0.01 mg ölçme yeteneğine sahip bir analitik denge kullanarak etiketlenmiş boncuk tüp kitle.</li>
	<li>Larva örnekleri-80 ° C'de depolanmış, örnek tüpler aktarmak için sıvı azot önceden içinde koyun.</li>
	<li>Uzun forseps 1,5 mL örnek tüp sıvı azot kaldırmak için kullanın dewar.</li>
	<li>Giyen nitril eldiven, donmuş kapmak Tüp, ters çevir ve keskin tüp kapağı donmuş Pelet çıkarmak için benchtop karşı pound. Hemen Pelet 2 mL önceden şeytan screwcap boncuk tüp içine dökün. Pelet çıkarmak başarısız olursa, tüp için sıvı azot dönmek ve tekrarlayın. Not: Tüm microfuge tüpleri larva granül çıkarmak değil. Önerilen bir başka bir tüp kullanarak, analiz için numune toplama önce larva granül yerinden Eğer belirleyin.</li>
	<li>Hızlı bir şekilde larva Pelet ve boncuk tüp kombine kitle ölçmek. Hemen örnek tüp sıvı azot yerleştirin. Larva Pelet kitle metabolomic verileri normalleştirmek için kullanılacaktır. Not: Bu adımda protokol duraklatılmış. Örnekleri-80 ° C'de 3 aya kadar saklanabilir</li>
</ol>4. örnek çıkarma
<ol><li>Yer örnek-20 ° C benchtop soğutucu borular.</li>
	<li>Prechilled (-20 ° C) % 90 metanol her tüpün içine 2 µg/mL d4 süksinik asit içeren 0.8 mL ekleyin. Örnek-20 ° C benchtop soğutucu dönün. Not: D4 süksinik asit bir iç standart olarak hizmet vermektedir. Sadece HPLC Sınıf H2O ve metanol kullanın. Metanol ve diğer organik solventler uçucu ve doğru hava deplasman pipetler kullanarak ölçmek zor olduğundan, bu adım ve tüm aşağıdaki adımları için pozitif deplasmanlı pipetler kullanmanızı öneririz.</li>
	<li>Bir negatif kontrol 0.8 mL prechilled (-20 ° C) % 90 metanol 2 µg/mL d4 süksinik asit içeren bir boş boncuk tüp içine ekleyerek ayarlayın.</li>
	<li>Örnekler: 6.45 m/s 4 ° C sıcaklık kontrol odasında bulunan bir boncuk değirmen homogenizer kullanarak 30 saniye lunaparkçı. Not: başarısızlık hızla ve tamamen larva Pelet homojenize değişkenlik metabolomics analizde yaygın kaynağıdır. Sadece 30 içinde larva doku dondurulmuş yok edebilecek homogenizers kullanın s.</li>
	<li>Homojenize örnekleri tüpler-20 ° C benchtop soğutucu dönün ve onları en az 1 h için-20 ° C dondurucuda kuluçkaya.</li>
	<li>20.000 × g veya maksimum hızda 4 ° C'de 5 min için tüpler santrifüj kapasitesi elde edilen çökelti kaldırmak için.</li>
	<li>600 µL süpernatant ile yeni 1.5 mL microcentrifuge tüp içine aktarın. Çökelti rahatsız etmeyin. Acele Pelet süpernatant pipetting sırasında yerinden olur varsa, tüm süpernatant tüp dönüp 4,6 arasındaki adımları yineleyin.</li>
	<li>Örnek tüpler bir vakum santrifüje yerleştirin. Tüm tüpler santrifüj sızdırmazlık önce açık olduğundan emin olun. Tüm çözücü kaldırılana kadar örnekleri, oda sıcaklığında kuru (Bu adım genellikle ~ 16 tamamlamak için saat sürer). Not: gerekirse, bu adımda protokol duraklatılmış. Kurutulmuş örnek-80 ° C'de depolanan</li>
</ol>5. kimyasal Derivatization
<ol><li>Kurutulmuş örnekleri-80 ° C'de depolanmış, açılmamış örnek tüpler bir vakum santrifüje yerleştirin ve 30 dk için kuru. Bu adımı örnek tüp açmadan önce gerçekleştirilmelidir. Not: Bu adımı dondurucudan çıkardığında microfuge tüp dış toplar yoğunlaşma kaldırır. Protokol bu bölümünü H2için O son derece duyarlıdır ve tüm reaktifler mümkün olduğunca kuru tutmak için ekstra önlem alınmalıdır.</li>
	<li>
Susuz pyridine 40 mg/mL methoxylamine hidroklorid (MOX) çözeltisi hazırlamak. Sadece susuz pyridine kullanın. MOX ve pyridine bir desiccator depolamak ve günlük MOX çözüm hazırlamak. Dikkat: MOX ve pyridine zehirlidir. Bu çözüm duman başlıklı hazırlayın.<ol>
<li>1 mL Cam şırınga Kuru Isı tabancası kullanın.</li>
		<li>Şırınga iğne susuz pyridine şişe içine yerleştirin. 1 mL pyridine kaldırın ve MOX 40 mg içeren bir microfuge tüp ekleyin.</li>
		<li>Argon ile susuz pyridine şişe floş. Şişe mühür ve desiccator için dönmek.</li>
		<li>Pyridine MOX 600 rpm'de 10 dk 35 ° c termal bir mikser tüpte kuluçka tarafından çözülür.</li>
	</ol>
</li>
	<li>40 mg/ml MOX 40 µL susuz pyridine çözümünde kurutulmuş örnek ekleyin.</li>
	<li>10 s ve kısaca santrifüj için girdap (10.000 x g 20 s).</li>
	<li>30 ° c termal bir karıştırıcı 600 RPM 1 h için kuluçkaya.</li>
	<li>20.000 × g veya partikül madde kaldırmak için 5 dakika için en yüksek hızı santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>25 µL süpernatant ile 250 µL devre dışı cam microvolume eklemek ile bir Otomatik Örnekleyici şişe içine aktarın.</li>
	<li>N- metil -N- trimethylsilyltrifluoracetamide (MSTFA) % 1'i içeren 40 µL eklemek TMCS. Dikkat: MSTFA zehirlidir. Duman mahallede bu adımı gerçekleştirin. Not: varsa, bu adımı Gerstel Otomatik Örnekleyici tarafından tamamlanabilir.</li>
	<li>Bir kap üzerinde Otomatik Örnekleyici şişe yerleştirin ve crimper aracını kullanarak kapatın.</li>
	<li>Örnek 37 ° C'de (250 devir/dakika) sallayarak ile 1 saat kuluçkaya.</li>
	<li>Bir yağ asidi metil ester standart (ALEVLERİNİ) çözüm daha önce3desceribed hazırlayın. ALEVLERİNİ 3 µL robot otomatik örnekleyici hemen önce enjeksiyon kullanarak Otomatik Örnekleyici şişe ekleyin. Not: Alevlerini tutma zaman kaydırma kalibre ve cihazlarının performansını kontrol etmek için kullanılır. Hiçbir robot otomatik örnekleyici kullanılabilir durumdaysa, alevlerini adımı sırasında 5,8 eklenebilir.</li>
</ol>6. GC-MS algılama
Not: çoğu durumda, Kullanıcı bir kütle spektroskopisi çekirdek tesis yardımı ile bu adımı yürütecek. Bu iletişim kuralı bir 30 m, GC sütun 5 m koruma sütun ile kullanılmak üzere tasarlanmıştır.
<ol><li>Örnek sipariş rastgele.</li>
	<li>
GC-MS hazırlayın.
	<ol>
<li>Küme helyum taşıyıcı gaz akış hızı 1 mL/dak.</li>
		<li>Giriş sıcaklığı 250 ° C'ye ayarla</li>
		<li>Aşağıdaki Sıcaklık gradyanı yürütmek için GC programı:<ol>
<li>İlk sıcaklığı 95 ° c ile 1 dk bir tutun.</li>
			<li>2 dk bir tutun ile 40 ° C/dk hızında 110 ° c sıcaklık artışı.</li>
			<li>250 ° C-5 ° C/dak rampa tarafından artırmak.</li>
			<li>330 ° c 4 dk son bir tutun ile 25 ° C/dk hızında artış.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Solvent gecikme için 3,5 dk ayarlayın. Not: Zaman GC-MS sistemine göre değiştirilebilir. Bu adımın amacı Dedektör zarar MSTFA ve MOX önlemektir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Derivatized örnek 1 µL GC-MS (10:1 oranı split) enjekte. Not: örnek 2 µL doruklarına yoğunluğunu çok düşükse enjekte et. Örnekleri enjeksiyon sırasını randomize.</li>
	<li>Kütle Spektrometre tam tarama modunda bir kitle 50-500 m aralığında faaliyet/z.</li>
</ol>7. veri analizi
<ol><li>Ya hedefli veya hedeflenmemiş bir yaklaşım kullanarak metabolomic veri analiz. Hedeflenen analiz metabolitleri, biz aşağıda tarif laktat ölçümleri gibi tanımlanmış bir dizi bolluğu ölçme üzerinde odaklanmıştır. Buna ek olarak, hedefsiz analiz iki örnek kümesi arasındaki önemli ölçüde değişti herhangi bir metabolik özelliği tanımlamak için tarafsız bir yaklaşım kullanır. Not: Bizim laboratuvar öncelikle ücretsiz programlar MetAlign17 ve MetaboAnalyst18,19 veri analizi için kullanır. Hem kalite kontrol, normalleştirme ve veri işleme adımları yeterli bir açıklama bu yazının kapsamı dışındadır olduğundan, Kullanıcı veri işleme20,21' eayrılmış olan daha ayrıntılı iletişim kurallarına bakın, 22. Ayrıca, bu çözümleme için gereken adımları açıklayan bir akış şeması8başka bir yerde bulunabilir.</li>
</ol>

<ol><li>Owusu-Ansah, E., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+metabolic+homeostasis+and+nutrient+sensing+in+Drosophila%3A+implications+for+aging+and+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Modeling metabolic homeostasis and nutrient sensing in Drosophila: implications for aging and metabolic diseases.</a> Disease Models & Mechanisms. 7 (3), 343-350 (2014).</li>
<li>Sieber, M. H., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+metabolic+states+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The role of metabolic states in development and disease.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 45, 58-68 (2017).</li>
<li>Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+metabolism+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying metabolism in Drosophila.</a> Methods. 68 (1), 105-115 (2014).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larvae+synthesize+the+putative+oncometabolite+L-2-hydroxyglutarate+during+normal+developmental+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Drosophila larvae synthesize the putative oncometabolite L-2-hydroxyglutarate during normal developmental growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (6), 1353-1358 (2017).</li>
<li>Tennessen, J. M., Baker, K. D., Lam, G., Evans, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+Estrogen-Related+Receptor+Directs+a+Metabolic+Switch+that+Supports+Developmental+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The Drosophila Estrogen-Related Receptor Directs a Metabolic Switch that Supports Developmental Growth.</a> Cell Metabolism. 13 (2), 139-148 (2011).</li>
<li>Nicholson, J. K., Lindon, J. C., Holmes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabonomics%27%3A+understanding+the+metabolic+responses+of+living+systems+to+pathophysiological+stimuli+via+multivariate+statistical+analysis+of+biological+NMR+spectroscopic+data%5BTitle%5D)+AND+%22Xenobiotica%22%5BJournal%5D)">Metabonomics': understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data.</a> Xenobiotica. 29 (11), 1181-1189 (1999).</li>
<li>Fiehn, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+-+the+link+between+genotypes+and+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Metabolomics - the link between genotypes and phenotypes.</a> Plant Molecular Biology. 48 (1-2), 155-171 (2002).</li>
<li>Cox, J. E., Thummel, C. S., Tennessen, J. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28684601">Metabolomic Studies in Drosophila.</a> Genetics. 206 (3), 1169-1185 (2017).</li>
<li>Lenz, E. M., Wilson, I. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17269702">Analytical strategies in metabonomics.</a> Journal of Proteome Research. 6 (2), 443-458 (2007).</li>
<li>Pasikanti, K. K., Ho, P. C., Chan, E. C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas+chromatography%2Fmass+spectrometry+in+metabolic+profiling+of+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B-Analytical+Technologies+in+the+Biomedical+and+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Gas chromatography/mass spectrometry in metabolic profiling of biological fluids.</a> Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 871 (2), 202-211 (2008).</li>
<li>Want, E. J., Nordstrom, A., Morita, H., Siuzdak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+exogenous+to+endogenous%3A+The+inevitable+imprint+of+mass+spectrometry+in+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">From exogenous to endogenous: The inevitable imprint of mass spectrometry in metabolomics.</a> Journal of Proteome Research. 6 (2), 459-468 (2007).</li>
<li>Garcia, A., Barbas, C. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/book/10.1007%2F978-1-61737-985-7">Metabolic Profiling: Methods and Protocols Vol. 708 Methods in Molecular Biology</a>. Metz, T. O. , Humana Press Inc. Totowa, Nj. 191-204 (2011).</li>
<li>Chan, E. C. Y., Pasikanti, K. K., Nicholson, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+urinary+metabolic+profiling+procedures+using+gas+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Global urinary metabolic profiling procedures using gas chromatography-mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1483-1499 (2011).</li>
<li>Dunn, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedures+for+large-scale+metabolic+profiling+of+serum+and+plasma+using+gas+chromatography+and+liquid+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).</li>
<li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Drosophila%3A+A+Laboratory+Manual%22">Drosophila: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 171-178 (1989).</li>
<li>Biyasheva, A., Do, T. V., Lu, Y., Vaskova, M., Andres, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glue+secretion+in+the+Drosophila+salivary+gland%3A+a+model+for+steroid-regulated+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Glue secretion in the Drosophila salivary gland: a model for steroid-regulated exocytosis.</a> Developmental Biology. 231 (1), 234-251 (2001).</li>
<li>Lommen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MetAlign%3A+Interface-driven%2C+versatile+metabolomics+tool+for+hyphenated+full-scan+mass+spectrometry+data+preprocessing%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">MetAlign: Interface-driven, versatile metabolomics tool for hyphenated full-scan mass spectrometry data preprocessing.</a> Analytical Chemistry. 81 (8), 3079-3086 (2009).</li>
<li>Xia, J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+MetaboAnalyst+3.0+for+comprehensive+metabolomics+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Using MetaboAnalyst 3.0 for comprehensive metabolomics data analysis.</a> Current Protocols in Bioinformatics. 55, (2016).</li>
<li>Xia, J., Sinelnikov, I. V., Han, B., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MetaboAnalyst+3.0-making+metabolomics+more+meaningful%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">MetaboAnalyst 3.0-making metabolomics more meaningful.</a> Nucleic Acids Research. 43 (W1), W251-W257 (2015).</li>
<li>Lommen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+%28pre-%29processing+of+nominal+and+accurate+mass+LC-MS+or+GC-MS+data+using+MetAlign%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Data (pre-)processing of nominal and accurate mass LC-MS or GC-MS data using MetAlign.</a> Methods in Molecular Biology. 860, 229-253 (2012).</li>
<li>Xia, J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+MetaboAnalyst+3.0+for+comprehensive+metabolomics+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Using MetaboAnalyst 3.0 for comprehensive metabolomics data analysis.</a> Current Protocols in Bioinformatics. 55, (2016).</li>
<li>Xia, J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Web-based+inference+of+biological+patterns%2C+functions+and+pathways+from+metabolomic+data+using+MetaboAnalyst%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Web-based inference of biological patterns, functions and pathways from metabolomic data using MetaboAnalyst.</a> Nature Protocols. 6 (6), 743-760 (2011).</li>
<li>Li, H., Tennessen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+the+metabolic+basis+of+Drosophila+development%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods for studying the metabolic basis of Drosophila development.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 6 (5), (2017).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Metabolomics ara metabolizma oluşturmak metabolik reaksiyonları incelemek için eşsiz bir fırsat sağlar. Bu teknoloji, duyarlılığını ancak, genetik arka plan, gelişimsel ipuçları ve çevresel stresleri, sıcaklık, nem, nüfus yoğunluğu ve besin kullanılabilirliği de dahil olmak üzere çeşitli duyarlı verileri işler. Bu nedenle, bir yüksek kaliteli ve tekrarlanabilir metabolomics analiz gerektirir örnekleri son derece kontrollü koşullar altında toplanması. Burada birkaç değerlendirmeleri bu noktası3<sup...

Meyve sineği Drosophila melanogaster ara metabolizma düzenleyen moleküler mekanizması eğitim için ideal bir sistem olarak ortaya çıkmıştır. Sadece çoğu metabolik yollar Drosophila ve insanlar arasında korunmuş ama anahtar besin sensörler ve büyüme düzenleyiciler, insülin, Tor ve myc, gibi aynı zamanda sinek1,2' aktif. Sonuç olarak, Drosophila insan hastalıkları diyabet ve obezite ateş ve kanser kadar çeşitli metabolik temeli keşfetmek için kullanılabilir. Bu bağlamda, Drosophila larva geliştirme hangi aerobik glikoliz veya Warburg etkisi olarak bilinen bir metabolik program çalışmak ideal çerçeve sağlar. Sadece birçok tümör aerobik glikoliz biyokütle karbonhidrat oluşturmak için kullanırken, öylesine Drosophila yapmak larva gelişimsel büyüme3,4,5tanıtmak için aerobik glikoliz harekete geçirmek. Bu benzerlikler arasında larva ve anlayış nasıl aerobik için anahtar bir model olarak Drosophila kurmak tümör metabolizma glikoliz düzenlenmiş vivo içindeolduğunu.
Anında metabolizma çalışmak için popüler bir model olarak ortaya çıkmıştır olmasına rağmen bireysel metabolitleri3, trehalose, trigliserid veya ATP gibi ölçmek için tasarlanmıştır yöntemleri en Drosophila çalışmaları güveniyor. Belirli bir iletişim kuralı her metaboliti ölçmek için gerekli olduğundan, tahlil tabanlı çalışmalar emek yoğun, pahalı ve ticari kitleri kullanarak ölçülen bu bileşikler karşı önyargılı vardır. Bir çözüm için bu kısıtlamalar Drosophila metabolizma eğitim daha etkili ve tarafsız bir yol sunan metabolomics alandan ortaya çıkmıştır. Tahlil tabanlı çalışmada farklı olarak, bir tek metabolomic Analizi aynı anda yüzlerce küçük molekül metabolitleri ölçebilir ve bir organizmanın metabolik durum6,7kapsamlı bir anlayış sağlamak. Bu teknik kapsamı Drosophila metabolik çalışmaların önemli ölçüde genişletti ve bu yeni ortaya çıkan alan8geleceği temsil eder.
Metabolomic çalışmalar öncelikle üç teknolojilerini kullanarak yapılır: (i) nükleer manyetik rezonans (NMR), (ii) sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (LC-MS) ve (III) gaz kromatografi-kütle spektrometresi (GC-MS)9. Farklı avantajları ve dezavantajları her yaklaşım sunuyor ve tüm bu teknolojilerin başarıyla Drosophila metabolizma çalışmaya kullanılmıştır. Bizim laboratuarımızda yapılan araştırma üzerinde küçük, kutup metabolitleri odaklandığı öncelikle bir GC-MS tabanlı yöntemi kullanır. GC-MS birçok avantajı da dahil olmak üzere yüksek tekrarlanabilirlik, en yüksek çözünürlük, hassasiyet, kullanıcıyla sağlar ve hızlı tanımlanması için izin veren bir standart elektron etkisi (EI) spektral Kütüphane kullanılabilirliğini metabolik keşfetti Şekil10,11. Örnekleri hazırlanması için GC-MS, ancak, biraz karmaşık ve ayrıntılı bir dikkat gerektirir. Örnekleri gerekir toplanacak, yıkanmış, tartılır ve hızlı bir şekilde metabolik reaksiyonlar quenches bir şekilde dondurulmuş. Ayrıca, sinek karkas standart homojenizasyon protokolleri için dayanıklı ve en uygun metaboliti ayıklama emin olmak için bir boncuk değirmen gerektirir. Son olarak, GC-MS tarafından analiz örnekleri algılama12önce kimyasal derivatization geçmek zorundadır. Daha önce yayımlanmış yöntemleri tarif tüm bu adımları3,13,14iken, Acemi kullanıcının tekrarlanarak yüksek kalitede veri oluşturmasına olanak sağlayacak görsel iletişim kuralı hala gereklidir. Burada Drosophila larva örnekleri metabolomics GC-MS tabanlı analiz için hazırlamak nasıl gösterir. Bu iletişim kuralı tekrarlanarak birçok merkezi karbon metabolizması oluşturmak küçük kutup metabolitleri ölçmek Kullanıcı sağlar.

<table><tbody><tr><td>Kükürtsüz çörek otu pekmezi</td><td>İyi Yemek, INC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Agar Tip II</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-103</td><td></td></tr><tr><td>Piridin</td><td>EMD Millipore</td><td>PX2012-7</td><td></td></tr><tr><td>Metoksiamin hidrokolorid (MOX)</td> <td>MP Biomedicals, LLC</td><td>155405</td><td></td></tr><tr><td>MSTFA ile% 1 trimetilklorosilan</td><td>Sigma</td><td>69478</td><td></td></tr><tr><td>Fleischmann' s Aktif kuru maya</td><td>AB Mauri Food Inc</td><td>2192</td><td></td></tr><tr><td>6oz Drosophila stok şişesi</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-130</td><td></td></tr><tr><td>Yumuşak doku homojenleştirici karışım (2 mL tüp)&nbsp;</td><td>Omni International</td><td>SKU: 19-627</td><td></td></tr><tr><td>Flakon ek, 250 & L polimer ayaklı deaktif cam</td><td>Agilent</td><td>5181-8872</td><td></td></tr><tr><td>Süksinik asit-2,2,3,3-d4</td><td>Sigma</td><td>293075</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Thermo&nbsp;</td><td>SC210A</td><td></td></tr><tr><td>o-Fosforik asit</td><td>Fisher Scientific</td><td>A242-1</td><td></td></tr><tr><td>Propiyonik asit</td><td>Sigma</td><td>P5561</td><td></td></tr><tr><td>p-Hidroksi benzoik asit metil ester</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-258</td><td></td></tr><tr><td>Boncuk Ruptor</td><td>Omni Uluslararası</td><td>SKU:19-040E</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer F1.5</td><td>Eppendorf</td><td>5384000012</td><td></td></tr><tr><td>24 X 12 mm bloklu MultiTherm Çalkalayıcı</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H5000</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL santrifüj tüpü</td><td>Eppendorf</td><td>22364111</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 35 X 10 mm doku kültürü kabı</td><td>Corning Incorporated</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>GC sütunu</td><td>Phenomex</td><td>ZB-5MSi</td><td></td></tr></tbody></table>

gaz kromatografi-kütle spektrometresi (gc-ms) drosophila larva örnekleri hazırlanması-metabolomics dayalı

Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS)-based Metabolomics

Metabolomics alanındaki son gelişmeler meyve sineği Drosophila melanogaster hayvan metabolizma çalışmak için güçlü bir genetik model olarak kurduk. Drosophila genetik araçları geniş dizi ara metabolizmasının büyük tarama alanı anket yeteneği ile birleştirerek, bir metabolomics yaklaşım diyet, genotip, hayat-tarih olayları ve çevre ipuçları arasındaki karmaşık etkileşimler ortaya çıkarabilir. Buna ek olarak, metabolomics çalışmalar roman enzimatik mekanizmaları keşfetmek ve görünüşte farklı metabolik yollar arasında daha önce bilinmeyen bağlantıları ortaya çıkarmak. Bu teknoloji Drosophila topluluk arasında daha yaygın kullanımını kolaylaştırmak için burada Drosophila larva örnekleri gaz kromatografi-kütle spektrometresi (GC-MS) için hazırlamak açıklar detaylı bir protokol sağlamak- metabolomic analizi dayalı. Bizim iletişim kuralı larva örnek koleksiyon, metaboliti ayıklama, kimyasal derivatization ve GC-MS çözümleme açıklamalarını içerir. Bu iletişim kuralı başarıyla tamamlanması amino asit, şeker ve organik asitler dahil glikoliz ve TCA döngüsü de dahil olmak üzere küçük kutup metabolitleri göreli bolluk ölçmek kullanıcılar izin verir.

Laktat dehidrogenaz dLDH etkinliği4ve genetik olarak uyumlu denetimleri eksikliği (dLDH) mutantlar L2 orta larva toplanmıştır ve yukarıda açıklanan protokolüne göre işlenir. Denetimleri ile karşılaştırıldığında, mutant larva laktat, pyruvate ve L-2-hydroxyglutarate4önemli değişiklikler sergi. Spectra bir AGILENT GC6890-5973i MS sistemi ile elde. GC-MS spectra örneği oluşturmak ile bizim protokol Şekil 1...

Bu iletişim kuralı, Drosophila larva metabolomic GC-MS tabanlı analiz için hazırlamak açıklar.

Gaz kromatografi-kütle spektrometresi (GC-MS) Drosophila larva örnekleri hazırlanması-Metabolomics dayalı

Recent advances in the field of metabolomics have established the fruit fly Drosophila melanogaster as a powerful genetic model for studying animal ...

Bu yöntem, onkometabolit L2-hidroksilütaratın sağlıklı hücrelerde nasıl sentezlendiği gibi metabolizma alanındaki temel soruları yanıtlayabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kullanıcının 100'den fazla metaboliti hassas ve tekrarlanabilir bir şekilde doğrudan ölçmesine izin vermesidir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, protokol verimli numune işleme gerektirdiğinden ve su buharına karşı son derece hassas olduğundan mücadele edeceklerdir.Protokole başlamak için, önceden hazırlanmış larvaları içeren 1,5 mililitrelik bir tüpe bir mililitre buz gibi% 0.9 sodyum klorür ekleyin. Kapağı kapatın, larvaları iyice yıkamak için tüpü dikey olarak çevirin ve tüpü 30 saniye boyunca buzun üzerine yerleştirin. Larvalar tüpün dibine batacak, ancak maya süspansiyon halinde kalacaktır.Tüm larvalar gevşek bir pelet oluşturduktan sonra, bir mililitrelik bir pipet kullanarak sodyum klorür çözeltisini çıkarın. Numuneleri 2.000 g'da dört santigrat derecede bir dakika santrifüjleyin. 200 mikrolitrelik bir pipet kullanarak kalan tüm çözeltiyi çıkarın ve numuneyi hemen sıvı nitrojen içinde dondurun.İki mililitrelik vidalı kapaklı boncuk tüpünün yan tarafını etiketlemek için etanol geçirmez bir işaret

preparation-drosophila-larval-samples-for-gas-chromatography-mass

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Kararlı izotop profil aracı metabolik akı gaz kromatografisi kütle spektrometrik analizi, nematod...

Kararlı İzotopik Profil geliştirilmesi ve Yetişkin Sahne Aracı Metabolik Akı Caenorhabditis elegans</em

Biz burada mRNA ekstraksiyonu ve saflaştırılması için işlemler ve metabolitlerin...

Transkript ve Metabolitler gelen saflaştırılması<em&gt; Drosophila</em&gt; Kafaları

Mitokondri, metabolizma ve homeostazın düzenlenmesinde merkezi rol oynar. Organizma fizyolojisini etkileyen mitokondriyal metabolizmadaki ince değişikliklerin tüm organizma metabolomik çalışmalarında tespit edilmesi zor olabilir. Burada, Drosophila melanogaster'deki ince metabolik değişimlerin tespitini geliştiren bir izolasyon yöntemini açıklıyoruz.

Metabolik Analiz Mitokondriyal Zenginleştirilmiş Kesirler Hazırlanması<em&gt; Drosophila</em

Bu protokolün amacı , orta derecede (0.5-1 g) Drosophila embriyolarının toplanması ve afinite saflaştırması-kütle spektrometresi (AP-MS) gibi protein proteini uygulamalarında kullanılabilen protein ekstraktlarının hazırlanması için basit ve ucuz bir yaklaşım sağlamaktır ).

Orta Ölçekli Hazırlanışı<em&gt; Drosophila</em&gt; Proteomik Denemeler için Embriyo Özleri

Küçük işçi karınca türlerin Colobopsis explodens kendi çene kemiğinde bezi hipertrofik rezervuarlar sonraki solvent ekstraksiyon ve çözümleme gaz kromatografi-kütle spektrometresi tarafından depolanan balmumu benzeri içerik yalıtmak için kesmiştim. Ek açıklama ve kimlik uçucu bileşenlerin açık kaynak yazılım MetaboliteDetector kullanarak da açıklanmıştır.

Yalıtım Borneo dan çene kemiğinde bezi rezervuar İçindekiler ' GC-MS ve MetaboliteDetector göre Volatilome analiz için karıncalar (karınca) patlayan

Bu iletişim kuralı bir yöntem Caenorhabditis elegans büyük ölçekli ekimi için katı medyada açıklar. Sıvı kültür alternatif, bu protokol parametreleri farklı ölçeklerde plaka tabanlı ekilen almak sağlanır. Bu sonuçlar karşılaştırılabilir sıvı ve katı Medya kültürü arasındaki morfolojik ve metabolik farklar ihmal olarak artırır.

Large-scale tarımı plaka tabanlı Caenorhabditis elegans: diyabet metabolik değişiklikler çalışma için numune hazırlama

Bu iletişim kuralı tek bir üretim için doğal organik madde ve mikrobiyal proteomik farklı ekosistemleri içinde tam olarak eşleştirilmiş karakterizasyonu sonuçlanan tamamlayıcı analitik ve omics teknikleri açıklar. Bu yaklaşım sağlam karşılaştırmalar metabolik yollar ve sera gazı üretim tanımlamak ve çevresel değişimin yanıt tahmin için önemli dönüşümleri tanımlamak için izin verir.

Karmaşık doğal organik madde karışımları karakterize için tek işlem hacmi tamamlayıcı yüksek çözünürlüklü analitik teknikler

Bu protokolde, birçok numunenin verimli ve hızlı bir şekilde numune hazırlamasını birleştiren optimize edilmiş bir iş akışı sunuyoruz. Ek olarak, metabolik GWAS çalışmalarının yüksek verimli değerlendirilmesi için analitik varyasyonları azaltmak için adım adım bir kılavuz sunuyoruz.

Büyük Ölçekli Multi-omik Genom Çapında İlişkilendirme Çalışmaları (Mo-GWAS): Numune Hazırlama ve Normalleştirme Kılavuzları

Bu protokolün amacı, matris yardımlı lazer desorpsiyon / iyonizasyon (MALDI) kütle spektrometrisi görüntülemesini kullanarak Drosophila beyni gibi küçük dokularda lipit ve metabolit analizi için uygun numune hazırlama konusunda ayrıntılı rehberlik sağlamaktır.

Matris Destekli Lazer Desorpsiyon/İyonizasyon Kütle Spektrometrisi Görüntüleme Kullanarak Drosophila Beyinde Hızlı Lipid Analizi için Örnek Hazırlama

Burada, Zebra balığı seks farklılaşması ve bakım soruşturmaları kolaylaştıracaktır larva zebrabalıkları, gonadal doku izole etmek için bir protokol mevcut.

Larva Zebra balığı Gonadal Doku Diseksiyon

Öğrenin Drosophila larva örneklerini GC-MS tabanlı metabolomik analiz için nasıl hazırlayacağınızı. Bu hassas ve tekrarlanabilir yöntem, 100'den fazla metabolitin doğrudan ölçümünü sağlar.

Gaz kromatografi-kütle spektrometresi (GC-MS) Drosophila larva örnekleri hazırlanması-Metabolomics dayalı

Daha fazla video keşfet