Gaz kromatografi-kütle spektrometresi (GC-MS) Drosophila larva örnekleri hazırlanması-Metabolomics dayalı

Bu yöntem, onkometabolit L2-hidroksilütaratın sağlıklı hücrelerde nasıl sentezlendiği gibi metabolizma alanındaki temel soruları yanıtlayabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kullanıcının 100'den fazla metaboliti hassas ve tekrarlanabilir bir şekilde doğrudan ölçmesine izin vermesidir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, protokol verimli numune işleme gerektirdiğinden ve su buharına karşı son derece hassas olduğundan mücadele edeceklerdir.

Protokole başlamak için, önceden hazırlanmış larvaları içeren 1,5 mililitrelik bir tüpe bir mililitre buz gibi% 0.9 sodyum klorür ekleyin. Kapağı kapatın, larvaları iyice yıkamak için tüpü dikey olarak çevirin ve tüpü 30 saniye boyunca buzun üzerine yerleştirin. Larvalar tüpün dibine batacak, ancak maya süspansiyon halinde kalacaktır.

Tüm larvalar gevşek bir pelet oluşturduktan sonra, bir mililitrelik bir pipet kullanarak sodyum klorür çözeltisini çıkarın. Numuneleri 2.000 g'da dört santigrat derecede bir dakika santrifüjleyin. 200 mikrolitrelik bir pipet kullanarak kalan tüm çözeltiyi çıkarın ve numuneyi hemen sıvı nitrojen içinde dondurun.

İki mililitrelik vidalı kapaklı boncuk tüpünün yan tarafını etiketlemek için etanol geçirmez bir işaretleyici kullanın. Ardından, 0,01 miligramı doğru bir şekilde ölçebilen bir analitik terazi kullanarak etiketli boncuk tüpünün kütlesinin darasını alın. 1.5 mililitrelik numune tüpünü sıvı nitrojen dewardan çıkarmak için uzun forseps kullanın.

Nitril eldiven giyerek donmuş tüpü alın, ters çevirin ve donmuş peleti çıkarmak için tüp kapağını tezgah üstüne keskin bir şekilde vurun. Peleti hemen önceden darası alınmış iki mililitrelik vidalı kapaklı boncuk tüpüne dökün. Endojen metabolik yolların yeniden aktive edilmemesini sağlamak için numune hızlı bir şekilde işlenmelidir.

Larva peleti ve boncuk tüpünün birleşik kütlesini hızlı bir şekilde ölçün. Numune tüpünü hemen sıvı nitrojenin içine yerleştirin. Numune tüplerini negatif 20 santigrat derece tezgah üstü soğutucuya yerleştirin.

Her tüpe mililitre süksinik-D4 asit başına iki mikrogram içeren 0,8 mililitre önceden soğutulmuş% 90 metanol ekleyin. Numuneleri negatif 20 santigrat derece tezgah üstü soğutucuya geri koyun. Boş bir boncuk tüpüne mililitre süksinik-D4 asit başına iki mikrogram içeren 0,8 mililitre önceden soğutulmuş% 90 metanol ekleyerek negatif bir kontrol ayarlayın.

Ardından, dört santigrat derece sıcaklık kontrol odasında bulunan bir boncuk değirmeni homojenizatörü kullanarak numuneleri saniyede 6,45 metrede 30 saniye boyunca homojenize edin. Homojenize edilmiş numuneleri negatif 20 santigrat derece tezgah üstü soğutucuya geri koyun ve soğutucuyu en az bir saat boyunca negatif 20 santigrat derece dondurucuya aktarın. İnkübe ettikten sonra, elde edilen çökeltiyi çıkarmak için tüpleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca 20.000 g'da santrifüjleyin.

600 mikrolitre süpernatanı yeni bir 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve çökeltiyi rahatsız etmeyin. Tüm numune tüplerini açın ve bir vakum santrifüjüne yerleştirin. Tüm çözücü çıkarılana kadar numuneleri oda sıcaklığında kurutun.

Kurutulmuş numuneler eksi 80 santigrat derecede saklandıysa, açılmamış numune tüplerini bir vakum santrifüjüne koyun ve 30 dakika kurutun. Susuz piridin içinde mililitre metoksilamin hidroklorür veya MOX başına 40 miligramlık bir çözelti hazırlayın. MOX ve piridini bir desikatörde saklayın.

Ardından, bir mililitrelik bir cam şırıngayı yaklaşık beş saniye kurutmak için bir ısı tabancası kullanın. Şırınganın iğnesini susuz piridin şişesine yerleştirin. Bir mililitre piridini çıkarın ve 40 miligram MOX içeren bir mikrofüj tüpüne ekleyin.

Protokolün bu kısmı suya karşı son derece hassastır. Tüm reaktifler kullanımdan önce bir desikatörde saklanmalıdır. Ek olarak, kullanıcı, numunenin atmosferik su buharına minimum düzeyde maruz kaldığından emin olmalıdır.

Ardından, susuz piridin şişesini argon ile yıkayın. Şişeyi kapatın ve desikatöre geri koyun. Tüpü 35 santigrat derecede bir termal karıştırıcıda 600 rpm'de 10 dakika inkübe ederek MOX'u piridin içinde çözün.

Daha sonra, kurutulmuş numuneye susuz piridin çözeltisi içinde mililitre MOX başına 40 mikrolitre 40 miligram ekleyin. Numuneyi 10 saniye boyunca vorteksleyin ve kısaca santrifüjleyin. Ardından, numuneyi bir termal karıştırıcıda inkübe edin.

Partikül maddeyi çıkarmak için numuneyi 20.000 g veya maksimum hızda beş dakika santrifüjleyin. 25 mikrolitre süpernatanı, 250 mikrolitrelik devre dışı bırakılmış cam mikro hacimli bir ek parçaya sahip bir otomatik numune alma şişesine aktarın. % 1 TMCS içeren 40 mikrolitre MSTFA ekleyin.

Otomatik numune alma cihazı şişesine bir kapak yerleştirin ve bir kıvırma aleti kullanarak şişeyi kapatın. Numuneyi 37 santigrat derecede 250 rpm'de çalkalanarak bir saat inkübe edin. Son olarak, enjeksiyondan hemen önce robotik bir otomatik numune alma cihazı kullanarak otomatik numune alma cihazına üç mikrolitre önceden hazırlanmış yağ asidi metil ester standardı veya FAMES solüsyonu ekleyin.

Laktat dehidrojenaz mutant larvalarının gaz kromatografisi-kütle spektrometresi, kontrol larvalarına kıyasla laktat, piruvat ve L2-hidroksilütaratta önemli değişiklikler gösterir. Protokol ile oluşturulan GC-MS spektrumları, normalde bir larva örneğindeki en büyük zirveyi temsil eden trehaloz için birçok görünür özellik ve dikkate değer bir tepe gösterir. Temel bileşen analizi veya PCA, nakavt ve vahşi tip grupların birbirinden ayrıldığını ve her iki grupta da aykırı değer olmadığını açıkça göstermektedir.

Bu prosedürü denerken, homojenizasyondan önce numuneleri donmuş halde tutmayı ve prosedür boyunca tüm reaktifleri kuru tutmayı unutmamak önemlidir.