Ham Virion ayıklama DNA analizi yeni virüs genleri keşfetmek için virüslü yaprakları gelen RNA analizi ile birleştirerek

Bu yöntem, yeni hastalıkların ortaya çıkması gibi çevre virolojisine dair temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemin temel avantajı, varyantların hücresel bileşenlerden saflaştırılması ve bu varyantların sekanslama için DNA ekstraksiyonunda kullanılmasıdır. Bu fikirle ilk kez, seralarımızdaki bitkilerin bir veya daha fazla bilinmeyen Badnavirus ile enfekte olduğunu fark ettiğimizde karşılaştım. Bu yöntemde yeni olan kişiler üç nedenden dolayı zorluk yaşayabilirler. Birincisi, kaliteli verim elde etmek için homojenizasyon kritik bir adımdır. İkincisi, diferansiyel santrifüjleme birden fazla pelet oluşturabilir ve bu peletlerin nasıl tanımlanıp ayrıştırılacağını bilmeniz gerekir. Üçüncüsü, biyoanalizör sonuçlarının yorumlanması da zor olabilir.

Bu prosedürün tüm aşamalarında laboratuvar önlüğü ve eldiven giyilmelidir. İşleme, daha önce -20 °C'de dondurulmuş hastalıklı bitkilerden 80 ila 100 gram yaprak keserek başlayın. Ardından yaprakları, 200 mL öğütme tamponu ve %0,5 sodyum sülfit kullanarak bir Waring blenderında öğütün. Homojenatı bir litrelik bir behere aktarın.

Uygun kişisel koruyucu ekipmanlar hala giyiliyorken, homogenata 18 gram üre ve 25 mililitre %10 non-iyonik deterjan ekleyin ve beheri folyo ile kapatın. Bir manyetik karıştırıcı ile gece boyunca karıştırın. Ertesi gün, homogenatı 250 mililitrelik santrifüj rotor şişelerine aktarın ve sabit açılı bir rotorda 4 °C'de 4000 ×g'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatantı geri kazanın ve dört katlı peynir bezinden süzün. Geri kazanılan sıvı homogenatın hacmini ölçün ve ardından homogenatı 38,5 mililitrelik polipropilen santrifüj tüplerine paylaştırın. Homogenatı 4 °C'de 40.000 ×g'de 2,5 saat santrifüjleyin. Santrifüj işlemi tamamlandığında, tüpün dibinde yeşil bir pelet ve tüp boyunca beyaz bir pelet olup olmadığını kontrol edin. Her iki peleti de muhafaza ederek süpernatantı dökün ve örnekleri buza yerleştirin.

Beyaz ve yeşil peletin birbirinden ayrılması, prosedürün en zorlayıcı adımlarından biridir. Bu işlem sabır ve beceri gerektirir.

Kimyasal çeker ocakta çalışırken, peletleri ayırmak için bir kauçuk polis (rubber policeman) kullanın. Peletleri sıyırarak farklı rotor şişelerine aktarın. Beyaz peletleri içeren rotor şişelerini buza yerleştirin. Her şişeye bir mililitre su ekleyin ve pipetle çekip bırakarak karıştırın. Bir ila iki saatlik süre boyunca, her beş dakikada bir, peleti yeniden süspansiyon haline getirmek için karışımı pipetle çekip bırakarak karıştırın. Beyaz peletler yeniden süspanse edildikten sonra, süspansiyonları gece boyunca dört derece santigrat sıcaklıkta saklayın.

Ertesi gün, kalan döküntüleri uzaklaştırmak için süspansiyonu 4 °C'de 6000 ×g'de 10 dakika santrifüjleyin. Konsantre süspansiyonları yeni tüplere aktarın ve virionları çöktürmek için 4 °C'de 136,000 ×g'de iki saat boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırın ve pelletini 1 mL tampon içerisinde yeniden süspanse edin.

Bu prosedüre viriyonları parçalayarak başlayın. Pellet süspansiyonlarına 2 µg/µL proteinaz K çözeltisinden 40 µL ekleyin ve 37 °C'de 15 dakika inkübe edin. Her örneğe bir hacim fenol kloroform izoamil alkol ekleyin ve 20 saniye boyunca elle çalkalayın.

Oda sıcaklığında 16.000 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Üstteki sulu fazı uzaklaştırın ve yeni bir tüpe aktarın. Bu ekstraksiyon işlemini iki veya daha fazla kez tekrarlayın.

DNA'yı etanol çöktürme yöntemiyle konsantre edin. 0.3 molar sodyum asetat pH 5.2 ve 2,5 hacim %95 etanol kullanın. Numuneleri -20 °C'de 30 ila 60 dakika bekletin. Ardından, DNA'yı çöktürmek için 13.000 ×g'de 10 ila 20 dakika santrifüjleyin.

Laboratuvar tezgahında çalışarak, DNA peletini bir mililitre 0.1 milimolar TE tamponu içerisinde yeniden süspande edin. Süspansiyonu, santrifüjasyon yoluyla ticari bir jel filtrasyon kolonundan süzün. Hazırlıkların kalitesini görmek ve metinde belirtildiği şekilde DNA kalitesini değerlendirmek için etidyum bromür boyaması kullanarak örnekleri %1 agaroza jel elektroforezi ile analiz edin.

Transmisyon elektron mikroskobu ile incelendiğinde, enfekte canna yapraklarının kaba fraksiyonasyonu ile elde edilen beyaz pellet içerisinde virüs partikülleri tespit edilmiştir. Yeşil ve beyaz pelletlerden geri kazanılan DNA'nın agaroz jel elektroforezi, kırmızı ve sarı noktalarla belirtilen beyaz fraksiyonda iki yüksek moleküler ağırlıklı DNA bandı olduğunu belirlemiştir.

Enfekte yapraklardan izole edilen RNA'nın bütünlüğü, agaroz jel elektroforezi ile de doğrulanmıştır. Bu grafik, ham virüs preparasyonundan birleştirilen kontiglerin bolluğunu ve taksonomik dağılımını göstermektedir. Ve bu grafik, Caulimoviridae familyası, Badnavirus cinsi ile ilişkili virüs kontiglerinin ve birbiriyle yakından ilişkili üç türle ilişkili kontiglerin oranlarını betimlemektedir.

Sıradaki iki grafik, taksonomik dağılımlarına göre RNA dizilemesinden türetilen contiglerin bolluğunu göstermektedir. Sağdaki grafik, Caulimoviridae ailesi Badnavirus cinsi ve birbirleriyle yakından ilişkili üç türe ait virüs contig popülasyonu içindeki contig bolluğunu betimlemektedir. Ortak bir iskele olarak DNA ve RNA dizilemesiyle üretilen virüs genom uzunluğu contiglerinin karşılaştırılması, iki tam uzunluktaki virüs genomunun varlığını doğrulamaktadır.

Son olarak, virüsle enfekte olmuş yapraklardan izole edilen RNA kullanılarak yapılan RT-PCR analizi ile her iki virüs genomu da tespit edilmiştir.

Bu teknik uzmanlaşıldığında iki gün sürebilirken, yeni başlayan bir kişi için üç gün sürebilir. Bu prosedürü ilk kez gerçekleştirirken, her bir süpernatanttaki homojenat hacminin kayıtlarını tutmanız önemlidir; böylece prosedürün sonunda, nihai DNA verimini başlangıç materyali ile karşılaştırabilirsiniz.

Keşfedilmesinden sonra bu yöntem, bitki virolojisi alanında araştırmacıların çevredeki yeni DNA virüslerini tanımlamalarının önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, bitki materyalinin nasıl homojenize edileceği, varyantların nasıl konsantre edileceği ve yeni nesil dizileme için kullanılabilecek yüksek verimli DNA'nın nasıl elde edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Üre ve fenol kloroform ile çalışmanın son derece tehlikeli olduğunu unutmayın; bu kimyasallarla çalışırken her zaman koruyucu gözlük, eldiven, laboratuvar önlüğü ve maske takmak gibi önlemler alınmalıdır. Güvenli ultrasantrifüj işlemi için tüplerin uygun şekilde dengelenmesi önemlidir; bu nedenle tüpleri tartmanız, sallayıcıya karşılıklı olarak yerleştirmeniz ve ağırlık farkının 0,01 arasında olması gerekir.