Name: Ham Virion ayıklama DNA analizi yeni virüs genleri keşfetmek için virüslü yaprakları gelen RNA analizi ile birleştirerek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Keşfedin, bitki virolojisinde yeni DNA virüslerini tanımlamak için enfekte yapraklardan virion saflaştırma ve DNA izolasyonu yöntemini. Bu teknik, yeni virüs genomlarının keşfi için güvenilir bir çerçeve sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Araştırma bilim ilerleme ve teknoloji uygulanan araştırma programı faz II AR 132-053-2 için Oklahoma Merkezi tarafından finanse edildi; ve tarım özel bitkileri Oklahoma departmanı tarafından hibe programı araştırma. Biz Dr HongJin Hwang ve OSU Biyoinformatik çekirdek tesisi olan NSF (EOS-0132534) ve NIH (2P20RR016478-04, 1P20RR16478-02 ve 5P20RR15564 / 03) gelen hibe tarafından desteklenen teşekkür ederim.

<ol><li>Dijkstra, J., Jager, C. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDijkstra%2C+J+%22Practical+Plant+Virology+%3A+Protocols+and+Exercises%22">Practical Plant Virology : Protocols and Exercises</a>. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 1 edn (1998).</li>
<li>Roossinck, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+virus+metagenomics%3A+biodiversity+and+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Plant virus metagenomics: biodiversity and ecology.</a> Annu Rev Genet. 46, 359-369 (2012).</li>
<li>Melcher, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+novel+viruses+by+analysis+of+nucleic+acids+in+virus-like+particle+fractions+from+Ambrosia+psilostachya%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Evidence for novel viruses by analysis of nucleic acids in virus-like particle fractions from Ambrosia psilostachya.</a> J Virol Methods. 152 (1-2), 49-55 (2008).</li>
<li>Stobbe, A. H., Schneider, W. L., Hoyt, P. R., Melcher, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+metagenomic+data+for+viruses+using+the+e-probe+diagnostic+nucleic+Acid+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Screening metagenomic data for viruses using the e-probe diagnostic nucleic Acid assay.</a> Phytopathology. 104 (10), 1125-1129 (2014).</li>
<li>Borah, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacilliform+DNA-containing+plant+viruses+in+the+tropics%3A+commonalities+within+a+genetically+diverse+group%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Bacilliform DNA-containing plant viruses in the tropics: commonalities within a genetically diverse group.</a> Mol Plant Pathol. 14 (8), 759-771 (2013).</li>
<li>Bousalem, M., Douzery, E. J., Seal, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taxonomy%2C+molecular+phylogeny+and+evolution+of+plant+reverse+transcribing+viruses+%28family+Caulimoviridae%29+inferred+from+full-length+genome+and+reverse+transcriptase+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Virol%22%5BJournal%5D)">Taxonomy, molecular phylogeny and evolution of plant reverse transcribing viruses (family Caulimoviridae) inferred from full-length genome and reverse transcriptase sequences.</a> Arch Virol. 153 (6), 1085-1102 (2008).</li>
<li>Geering, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Banana+contains+a+diverse+array+of+endogenous+badnaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Banana contains a diverse array of endogenous badnaviruses.</a> J Gen Virol. 86, Pt 2 511-520 (2005).</li>
<li>Kunii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+putative+DNA+virus+from+endogenous+rice+tungro+bacilliform+virus-like+sequences+in+the+rice+genome%3A+implications+for+integration+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of putative DNA virus from endogenous rice tungro bacilliform virus-like sequences in the rice genome: implications for integration and evolution.</a> BMC Genomics. 5, 80(2004).</li>
<li>Laney, A. G., Hassan, M., Tzanetakis, I. E. <a target="_blank" href="https://apsjournals.apsnet.org/doi/abs/10.1094/PHYTO-12-11-0351">An integrated badnavirus is prevalent in Figure germplasm.</a> Phytopathology. 102 (12), 1182-1189 (2012).</li>
<li>Gambley, C. F., Geering, A. D., Steele, V., Thomas, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+viral+and+non-viral+reverse+transcribing+elements+in+pineapple+%28Ananas+comosus%29%2C+including+members+of+two+new+badnavirus+species%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of viral and non-viral reverse transcribing elements in pineapple (Ananas comosus), including members of two new badnavirus species.</a> Arch Virol. 153 (8), 1599-1604 (2008).</li>
<li>Gayral, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+Banana+streak+virus+integration+event+in+the+banana+genome+as+the+origin+of+infectious+endogenous+pararetrovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A single Banana streak virus integration event in the banana genome as the origin of infectious endogenous pararetrovirus.</a> J Virol. 82 (13), 6697-6710 (2008).</li>
<li>Lyttle, D. J., Orlovich, D. A., Guy, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+analysis+of+endogenous+badnaviruses+in+the+New+Zealand+flora%5BTitle%5D)+AND+%22AoB+Plants%22%5BJournal%5D)">Detection and analysis of endogenous badnaviruses in the New Zealand flora.</a> AoB Plants. 2011, 008(2011).</li>
<li>Le Provost, G., Iskra-Caruana, M. L., Acina, I., Teycheney, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+detection+of+episomal+Banana+streak+viruses+by+multiplex+immunocapture+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved detection of episomal Banana streak viruses by multiplex immunocapture PCR.</a> J Virol Methods. 137 (1), 7-13 (2006).</li>
<li>Singh, K., Talla, A., Qiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNA+profiling+of+virus-infected+grapevines%3A+evidences+for+virus+infection-associated+and+variety-specific+miRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Funct+Integr+Genomics%22%5BJournal%5D)">Small RNA profiling of virus-infected grapevines: evidences for virus infection-associated and variety-specific miRNAs.</a> Funct Integr Genomics. 12 (4), 659-669 (2012).</li>
<li>Alfson, K. J., Beadles, M. W., Griffiths, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+determining+whole+viral+genomic+sequences+including+termini+using+a+single+deep+sequencing+run%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A new approach to determining whole viral genomic sequences including termini using a single deep sequencing run.</a> J Virol Methods. 208, 1-5 (2014).</li>
<li>Kreuze, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+viral+genome+sequence+and+discovery+of+novel+viruses+by+deep+sequencing+of+small+RNAs%3A+a+generic+method+for+diagnosis%2C+discovery+and+sequencing+of+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Complete viral genome sequence and discovery of novel viruses by deep sequencing of small RNAs: a generic method for diagnosis, discovery and sequencing of viruses.</a> Virology. 388 (1), 1-7 (2009).</li>
<li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VirusDetect%3A+An+automated+pipeline+for+efficient+virus+discovery+using+deep+sequencing+of+small+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">VirusDetect: An automated pipeline for efficient virus discovery using deep sequencing of small RNAs.</a> Virology. 500, 130-138 (2017).</li>
<li>James, A. P., Geijskes, R. J., Dale, J. L., Harding, R. M. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1744-7348.2011.00466.x">Molecular characterisation of six badnavirus species associated with leaf streak disease of banana in East Africa.</a> Annals of Applied Biology. 158 (3), 346-353 (2011).</li>
<li>Baranwal, V. K., Sharma, S. K., Khurana, D., Verma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+analysis+of+shorter+than+genome+length+episomal+Banana+streak+OL+virus+like+sequences+isolated+from+banana+in+India%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Genes%22%5BJournal%5D)">Sequence analysis of shorter than genome length episomal Banana streak OL virus like sequences isolated from banana in India.</a> Virus Genes. 48 (1), 120-127 (2014).</li>
<li>Sukal, A., Kidanemariam, D., Dale, J., James, A., Harding, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+badnaviruses+infecting+Dioscorea+spp.+in+the+Pacific+reveals+two+putative+novel+species+and+the+first+report+of+dioscorea+bacilliform+RT+virus+2%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of badnaviruses infecting Dioscorea spp. in the Pacific reveals two putative novel species and the first report of dioscorea bacilliform RT virus 2.</a> Virus Res. 238, 29-34 (2017).</li>
<li>BÖmer, M., Turaki, A. A., Silva, G., Kumar, P. L., Seal, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sequence-independent+strategy+for+amplification+and+characterisation+of+episomal+badnavirus+sequences+reveals+three+previously+uncharacterised+yam+badnaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">A sequence-independent strategy for amplification and characterisation of episomal badnavirus sequences reveals three previously uncharacterised yam badnaviruses.</a> Viruses. 8 (7), (2016).</li>
<li>Momol, M. T., Lockhart, B. E. L., Dankers, H., Adkins, S. <a target="_blank" href="https://www.plantmanagementnetwork.org/pub/php/brief/2004/canna/">Canna yellow mottle virus detected in Canna in Florida.</a> Plant Health Progress. , August 2-4 (2004).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Canna+yellow+mottle+virus+in+a+new+host%2C+Alpinia+purpurata%2C+in+Hawaii%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Characterization of Canna yellow mottle virus in a new host, Alpinia purpurata, in Hawaii.</a> Phytopathology. 107 (6), 791-799 (2017).</li>
<li>Wijayasekara, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+two+badnavirus+genomes+associated+with+Canna+yellow+mottle+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of two badnavirus genomes associated with Canna yellow mottle disease.</a> Virus Res. 243, 19-24 (2018).</li>
<li>Covey, S. N., Noad, R. J., al-Kaff, N. S., Turner, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caulimovirus+isolation+and+DNA+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Caulimovirus isolation and DNA extraction.</a> Methods Mol Biol. 81, 53-63 (1998).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+A+laboratory+manual.+2nd+edn%22">Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd edn</a>. , Cold Spring Harbor Press. (1989).</li>
<li>Radford, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+next-generation+sequencing+technologies+in+virology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Application of next-generation sequencing technologies in virology.</a> J Gen Virol. 93, Pt 9 1853-1868 (2012).</li>
<li>Kanagal-Shamanna, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emulsion+PCR%3A+Techniques+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Emulsion PCR: Techniques and Applications.</a> Methods Mol Biol. 1392, 33-42 (2016).</li>
<li>Getts, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+blockade+in+lethal+West+Nile+virus+encephalitis+indicates+a+crucial+role+for+very+late+antigen+%28VLA%29-4-dependent+recruitment+of+nitric+oxide-producing+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Targeted blockade in lethal West Nile virus encephalitis indicates a crucial role for very late antigen (VLA)-4-dependent recruitment of nitric oxide-producing macrophages.</a> J Neuroinflammation. 9, 246(2012).</li>
<li>van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Library+preparation+methods+for+next-generation+sequencing%3A+tone+down+the+bias%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias.</a> Exp Cell Res. 322 (1), 12-20 (2014).</li>
<li>Gel filtration principles and methods. <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma-Aldrich/General_Information/1/ge-gel-filtration.pdf">GE Healthcare</a>. , (2010).</li>
<li>Goff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+iPlant+Collaborative%3A+Cyberinfrastructure+for+Plant+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">The iPlant Collaborative: Cyberinfrastructure for Plant Biology.</a> Frontiers in Plant Science. 2, (2011).</li>
<li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+and+bioinformatic+approaches+to+detect+and+analyze+influenza+virus+in+ferrets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dev+Ctries%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing and bioinformatic approaches to detect and analyze influenza virus in ferrets.</a> J Infect Dev Ctries. 8 (4), 498-509 (2014).</li>
<li>Artimo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ExPASy%3A+SIB+bioinformatics+resource+portal%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">ExPASy: SIB bioinformatics resource portal.</a> Nucleic Acids Res. 40, Web Server issue 597-603 (2012).</li>
<li>Edgar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MUSCLE%3A+a+multiple+sequence+alignment+method+with+reduced+time+and+space+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MUSCLE: a multiple sequence alignment method with reduced time and space complexity.</a> BMC Bioinformatics. 5, 113(2004).</li>
<li>Hung, J. H., Weng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+Alignment+and+Homology+Search+with+BLAST+and+ClustalW%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Sequence Alignment and Homology Search with BLAST and ClustalW.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2016 (11), (2016).</li>
<li>Sohpal, V. K., Dey, A., Singh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEGA+biocentric+software+for+sequence+and+phylogenetic+analysis%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Bioinform+Res+Appl%22%5BJournal%5D)">MEGA biocentric software for sequence and phylogenetic analysis: a review.</a> Int J Bioinform Res Appl. 6 (3), 230-240 (2010).</li>
<li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3--new+capabilities+and+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Res. 40 (15), 115(2012).</li>
<li>Dhaliwa, A. DNA extraction and purification. Mater Methods. 3, 191(2013).</li>
<li>Moeller, J. R., Moehn, N. R., Waller, D. M., Givnish, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paramagnetic+cellulose+DNA+isolation+improves+DNA+yield+and+quality+among+diverse+plant+taxa%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Paramagnetic cellulose DNA isolation improves DNA yield and quality among diverse plant taxa.</a> Appl. Plant Sci. 2 (10), (2014).</li>
<li>Moeller, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paramagnetic+cellulose+DNA+isolation+improves+DNA+yield+and+quality+among+diverse+plant+taxa%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Paramagnetic cellulose DNA isolation improves DNA yield and quality among diverse plant taxa.</a> Appl. Plant Sci. 2 (10), (2014).</li>
<li>Grooms, K. <a target="_blank" href="https://www.semanticscholar.org/paper/Review%3A-Improved-DNA-Yield-and-Quality-from-Diverse-Grooms/b0a1299cacd7451cbbb9270caf72762379cd8e5d">Review: Improved DNA Yield and Quality from Diverse Plant Taxa</a>. , (2015).</li>
<li>Nishimori, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+antivirus+activity+of+an+anti-programmed+death-ligand+1+%28PD-L1%29+rat-bovine+chimeric+antibody+against+bovine+leukemia+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo antivirus activity of an anti-programmed death-ligand 1 (PD-L1) rat-bovine chimeric antibody against bovine leukemia virus infection.</a> PLoS One. 12 (4), 0174916(2017).</li>
<li>Rojas, M. R., Gilbertson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.springer.com/us/book/9783540757627">Plant Virus Evolution</a>. Roossinck, M. J. 1, Springer-Verlag. 27-51 (2008).</li>
<li>Roossinck, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+big+unknown%3A+plant+virus+biodiversity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Virol%22%5BJournal%5D)">The big unknown: plant virus biodiversity.</a> Curr Opin Virol. 1 (1), 63-67 (2011).</li>
<li>Roossinck, M. J., Martin, D. P., Roumagnac, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+Virus+Metagenomics%3A+Advances+in+Virus+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Plant Virus Metagenomics: Advances in Virus Discovery.</a> Phytopathology. 105 (6), 716-727 (2015).</li>
<li>Momol, M. T., Lockhart, B. E. L., Dankers, H., Adkins, S. <a target="_blank" href="NULL">Plant Health Progress</a>. , Online (2004).</li>
<li>Eni, A., Hughes, J. D., Asiedu, R., Rey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+diversity+among+badnavirus+isolates+infecting+yam+%28Dioscorea+spp.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Sequence diversity among badnavirus isolates infecting yam (Dioscorea spp.).</a> Archives of Virology. 153 (12), Ghana, Togo, Benin and Nigeria. 2263-2272 (2008).</li>
<li>Harper, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diversity+of+Banana+streak+virus+isolates+in+Uganda%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Virol%22%5BJournal%5D)">The diversity of Banana streak virus isolates in Uganda.</a> Arch Virol. 150 (12), 2407-2420 (2005).</li>
<li>Muller, E., Sackey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+variability+analysis+of+five+new+complete+cacao+swollen+shoot+virus+genomic+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Virol%22%5BJournal%5D)">Molecular variability analysis of five new complete cacao swollen shoot virus genomic sequences.</a> Arch Virol. 150 (1), 53-66 (2005).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Son yıllarda çeşitli yöntemler istihdam bitki virüs biyoçeşitlilik virüs benzeri parçacıklar (VIP) ya da virüs belirli RNA veya DNA2,3,44için zenginleştirici içeren doğal ortamlarda çalışmaya, 45,46 . Bu yöntemler NGS ve bioinformatic analiz tarafından takip edilmektedir. Bu çalışmanın amacı ekili fabrikasında ortak bir hastalık nedensel Ajan bulmaktı. Hastalık bu sigara zarflı bacilliform parçacıklar vardır ve yalnızca bir 565 bp parçası klonlanmış47olduğu bilinmeyen bir virüs sonucu olduğu bildirildi. Bu bilgi kuramsal olarak Caulimoviridaeaile içinde cins Badnavirus virüs atamak önceden araştırmacılar için yeterli oldu. Önceki raporlar canna lilyum canna mottle hastalığında bu çalışmada, özetlenen metagenomics yaklaşımı kullanarak tek bir badnavirus sonucuydu onaylanmadığına karar ise hastalık iki geçici badnavirus türler24tarafından neden olduğu belirledi. Böylece, biz şimdi durumlar belirleyebilir bir hastalık nedensel Ajan keşfetmek için bir metagenome yaklaşımı kullanmanın gücü olduğunu yerde birden fazla nedeni olabilir.
DNA ve RNA sıralama veri birleştirerek yaklaşımımız kapsamlı olduğunu ve ayrıca iki yaklaşım kullanarak sonuçları tutarlı sonuçlar vermiştir ve iki ilgili virüs varlığını doğruladı. Biz caulimoviruses yalıtım için değiştirilmiş bir yordam istihdam ve bu ilişkili virüs nükleik asitler için zenginleştirilmiş ve bu virüs kapsid içinde korunan bir örnek üretti. Bir hizmet laboratuar DNA sıralama dışarı taşımak için sözleşme imzalamıştı. Temel de novo sıralama için bu DNA polimeraz nükleotit bir DNA şablon iplik DNA sentezi sıralı döngüsü sırasında etiketli floresan içerir bir kavramdır. Contigs monte takip NGS tarafından virüs contigs tespit edilmiştir birkaç contigs üreten bir bioinformatic iş akışı içine sunuldu. Doğrulanmadı iki virüs genleri10,24,48,49,50 bioinformatic Analizi ribo tükenmiş RNA ürünleri alınan RNA-seq veri ile elde edildi. Bir ilginç sonuç dizileri nüfus DNA ve RNA sıralama tarafından kurtarılan öğrenmek için çıktı bu benzer viral sigara ve viral nükleik asitleri dağılımları sağlanan. DNA ve RNA sıralama için < %0,5 sıralarının virüs kökenli idi. Virüs dizileri 78-%82 Caulimoviridaeailesine ait nüfus içinde. DNA ve RNA sıralama üzerinden birleştirilmiş virüs contigs karşılaştırarak, iki monte genleri her iki veri kümelerini meydana geldiğini doğruladı.
Yeni virüs genleri tanımlamak için tek DNA sıralama kullanarak bir endişe badnavirus genom açık bir dairesel DNA olmasıdır. Süreksizliklerin genom içinde üst üste dizileri contigs genom derleme için engel mevcut olabilir tahmin edebilmiş. DNA sıralama sonuçlarının ilk sınav iki benzer virüs genleri ortaya koydu. Biz bu genleri de değil okudu bir türün genetik çeşitlilik temsil olan veya24aynı ortak bulaşmasını temsil iki tür bitki. Bu nedenle, toplu bioinformatic analiz NGS DNA ve RNA sıralamanın, tarafından elde edilen veri kümeleri iki tam uzunlukta genomları varlığı teyit etkin.
VIP ve nükleik asitler bitki homogenates metagenomic araştırmalar, DNA dan karnabahar mozaik virüsü (CaMV; bir caulimovirus)3kurtarmak için yordamlar dayalı çıkarma için alternatif bir Yöntem geliştiren başka bir rapordur. Bu yaklaşım Roman RNA ve DNA virüs olmayan ekili bitkiler serilerinde tespit edilmiştir. Doğal olarak enfekte bitkiler24VIP ayıklamak için türetilmiş adımları aksine bir hastalık ekili bitkiler nedensel Ajan keşfetmek için bu çalışmada kullanılan caulimovirus yalıtım yordamla elde adımlar vardır. Değiştirilmiş her iki yöntem başarısı caulimovirus yalıtım framework yordamı genel bitki virüs metagenomic çalışmalar için değerli bir başlangıç noktası olabileceğini düşündürmektedir.

Ortaya çıkan bitki hastalıklarının araştırmacılar doğru nedensel temsilcisi tanımlamak için yeni araçlar geliştirmek için sürücü. Yeni veya yinelenen virüs hastalıklarının başlangıç raporlarını mozaik ve yaprak, takas ven, cücelik, solan, lezyonlar, nekroz malformasyonlar gibi yaygın olarak karşılaşılan belirtiler veya diğer belirtiler üzerinde temel alır. Diğer bulaşıcı patojenler ayırmak için bir hastalık için nedensel ajan olduğu gibi yeni bir virüs raporlama için standart uygun konukçuda yaymak ve özgün ana bilgisayar türlerinin sağlıklı bitkiler aşı hastalık ürerler. Bu yaklaşımda bitki virüslerin birçok cins bir böcek ya da diğer vektörleri iletim uygun bir ana bilgisayar veya yeniden özgün ana türler için üzerine bağlıdır kısıtlamadır. Bu durumda, uygun vektör için arama uzun, Yöneyin laboratuar koloniler kurmak için zorluklar olabilir ve daha fazla çabaları bir protokol deneysel iletimi için hazırlamak gereklidir. Eğer başarılı laboratuar iletim çalışmaları için koşullar elde çalışma yeni bir virüs hastalık raporlama için standart kısa düşüyor. Çok düşük titreleri doğal onların ana oluşan virüs olarak araştırmacılar araştırma taşımak için yeterli bulaşıcı hisse senetleri korumak için alternatif hosts yayma için tanımlamanız gerekir. Sadece bir kaç bitki bulaştırmak virüs türler için bu da hisse senedi kültürler1büyüyen için bir engel olabilir.
Son yıllarda, bilim adamları daha sık yüksek üretilen iş NGS ve metagenomic yaklaşımlar için bilinen bir hastalık ilgisiz bulunabilir, ancak taksonomik tür ve cins atanabilir çevre, mevcut virüs dizileri ortaya çıkarmak için istihdam olduğunu 2 , 3 , 4. bulma ve ayrı bir ortamda genetik materyallerin sınıflandırılması böyle yaklaşımlar virüs çeşitlilik doğanın ya da varlığı belirli bir ekosistem tanımlamak için bir yol sağlar, ancak mutlaka tanımlamak için bir çerçeve için onaylamak değil nedensel maddeleri için belirgin bir hastalık.
Badnavirus cins Caulimoviridae pararetroviruses ailesine ait. Bu virüsler bacilliform şekli ile dairesel Çift Kişilik iplikçik DNA genleri yaklaşık 7-9 KB vardır. Tüm pararetroviruses bir RNA orta yineler. Pararetroviruses episomes mevcut ve bitki kromozom DNA5,6bağımsız çoğaltmak. Saha çalışmaları virüs nüfusun bu virüs nüfus genetiği karmaşık olduğunu gösteriyor. Buna ek olarak, bir bitki genom aralığında yüksek işlem hacmi sıralama tarafından elde edilen bilgileri gayri meşru tümleştirme olaylar tarafından bitki genleri eklenen badnavirus genom parçaları sayısız örnekleri ortaya. Bu endojen badnavirus dizilere mutlaka enfeksiyon7,8,9,10,11ile ilişkili değildir. Daha sonra yeni badnaviruses hastalığı nedensel ajan olarak tanımlamak için NGS kullanımı episomal genleri subpopulation çeşitliliği yanı sıra endojen dizileri12,13oluşumunu karmaşıktır.
Roman pararetrovirus genleri keşfi için değil bir en uygun potansiyel varken, bu virüs hastalığı için nedensel ajanı olarak tanımlamak için iki genel yaklaşım vardır. Virüslü yaprakları küçük RNA sıralarının zenginleştirmek ve virüs genome(s)14,15,16,17yeniden oluşturmak için bu dizilere araya bir yöntemdir. Çalışırken daire amplifikasyon (RCA) dairesel DNA virüs genleri18yükseltmek için başka bir yaklaşımdır. RCA başarısı yaş yaprak ve virüs titresi seçilen doku bağlıdır. RCA ürünleri kısıtlama sindirim için tabi ve plazmidler için19,20,21sıralama doğrudan içine klonlanmış.
Canna sarı mottle virüs (CaYMV) bir badnavirus olduğunu ve sadece bir 565 bp parçası genom virüslü cannas22daha önce izole olmasına rağmen canna, sarı mottle hastalığının etyolojik neden olarak tanımlanıyor. Çağdaş bir çalışma Alpinia purpurata (çiçekli zencefil; CaYMV tespit CaYMV-Ap)23. Bu çalışmanın amacı tam badnavirus genom dizileri virüslü canna lilyum kurtarmak için oldu. Biz virüs--dan bitki kirletici arındırıcı ve bu hazırlık üzerinden viral DNA izole eden bir protokol tanımlamak ve DNA kitaplığa NGS kullanmak için hazırlamak. Bu yaklaşım ara moleküler amplifikasyon adımları gereksinimini ortadan kaldırır. Biz de RNA-seq. NGS için virüslü bitkilerden mRNA izole olan RNA-seq içerir her nükleik asit hazırlık kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Monte contigs Badnavirus takson nükleik asit (BLASTn) için Biyoteknoloji ve bilgi (NCBI) temel yerel hizalama arama aracı için Ulusal Merkezi kullanarak her iki DataSet'lerdeki ile arasında bir ilişki bulunamadı. Biz iki badnavirus türler24genleri tespit.

<table><tbody><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich St. Louis MO</td><td>S5976</td><td>Virüs saflaştırması için öğütme tamponu</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>S0751</td><td>Virüs saflaştırması için öğütme tamponu</td></tr><tr><td>Na2SO3</td><td>Thermo-Fisher Waltham, MA</td><td>28790</td><td>Virüs saflaştırma üre için öğütme tamponu</td></tr><tr><td></td><td>Thermo-Fisher</td><td>PB169-212</td><td>Homojenat ekstraksiyonu&nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>X-100</td><td>Homojenat ekstraksiyonu&nbsp;</td></tr><tr><td>Tülbent</td><td>VWR Radnor, PA</td><td>21910-107</td><td>Filtre homojenatı&nbsp;</td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP152-5</td><td>Pelet süspansiyonu ve DNA resüspansiyon tamponları&nbsp;</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Spectrum, Gardena, CA</td><td>M1035</td><td>Pelet yeniden süspansiyon tamponu</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Spectrum</td><td>E1045</td><td>Enzim reaksiyonlarını durdurur</td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Thermo-Fisher</td><td>25530</td><td>DNA yeniden süspansiyon tamponu</td></tr><tr><td>fenol: kloroform: izoamilalkol ve nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2069</td><td>Virion proteinlerini çözün</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>Ekstraktlardan hücresel DNA'yı bozun</td></tr>% <tr><td>95 etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6B-100</td><td>Virüs DNA çökeltme</td></tr><tr><td>Laboratuvar blenderi</td><td>VWR</td><td>58984-030</td><td>Öğütme yaprağı örnekleri</td></tr><tr><td>Zemin modeli ultrasantrifüj & nbsp; & Ti70 rotor</td><td>Beckman Coulter, Irving TX&nbsp;</td><td>A94471</td><td>Hücresel ekstraktların ayrılması</td></tr><tr><td>Zemin modeli santrifüj ve JA-14 rotor</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>369001</td><td>Hücresel ekstraktların ayrılması</td></tr><tr><td>Manyetik karıştırma plakası</td><td>VWR</td><td>75876-022</td><td>Ürenin gece boyunca numunelere karıştırılması</td></tr><tr><td>Kauçuk polis memuru</td><td>VWR</td><td>470104-462</td><td>Virüs peletini çözün</td></tr> <tr><td>ve nbsp; 2100 biyoanalizör Enstrüman</td><td>Agilent Genomics, Santa Clare, CA</td><td>G2939BA</td><td>DNA ve RNA kalite ve miktarının hassas tespiti</td></tr><tr><td>2100 Biyoanalizör RNA-Picochip</td><td></td><td>5067-1513</td><td>2100 Biyoanalizörde RNA kalitesini taşımak, lekelemek ve ölçmek için kullanılan mikroakışkanlar çipi 2100 Biyoanalizör</td></tr><tr><td>DNA-Yüksek Hassas çip</td><td></td><td>5067-4626</td><td>2100 Biyoanalizörde DNA kalitesini taşımak, lekelemek ve ölçmek için kullanılan mikroakışkanlar çipi</td></tr><tr><td>Nanodrop spektrofotometresi</td><td>Thermo-Fisher</td><td>ND-2000</td><td>Prosedürlerin ara adımlarında DNA/RNA kalitesinin analizi</td></tr><tr><td>Bitki toplam RNA izolasyon kiti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>STRN50-1KT</td><td>RNA-seq</td></tr><tr><td>RNaz içermeyen su için RNA'yı izole edin&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10128-514</td><td>NGS için DNA ve RNA'nın yeniden süspansiyonu</td></tr><tr><td>RNA yoğunlaştırıcı spin sütunu</td><td>Zymo Research, Irvine, CA</td><td>R1013</td><td>RNA-seq</td></tr><tr><td>rRNA çıkarma kiti</td> için RNA'yı hazırlayın <td>Illumina, San Diego, CA</td><td>MRZPL116</td><td>RNA-seq için RNA'yı hazırlayın</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>ThermoFisher</td><td>12321D</td><td>RNA'yı RNA dizisi için hazırlayın</td></tr><tr><td>&nbsp; RNA&nbsp; zenginleştirme sistemi</td><td>Roche</td><td>7277300001</td><td>RNA'yı RNA-seq Agarose için hazırlayın</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Thermo-Fisher</td><td>16500100</td><td>Prosedürlerin ara adımlarında DNA/RNA kalitesinin jel analizi</td></tr><tr><td>Etidyum bromür</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15585011</td><td>Agaroz jel boyama</td></tr><tr><td>pGEM-T +JM109 yetkin hücreler</td><td>Promega, Madison, WI</td><td>A3610</td><td>Klon genom fragmanları</td></tr><tr><td>pFU Taq polimeraz</td><td>Promega</td><td>M7741</td><td>PCR virüs genomu</td></tr><tr><td>dNTP'leri</td><td>Promega çoğaltır</td><td>U1511</td><td>PCR virüs genomunu çoğaltır</td></tr><tr><td>PCR oligonükleotidleri</td><td>IDT, Coralvill, IA</td><td>Özel sipariş</td><td>PCR virüs genomunu çoğaltır</td></tr><tr><td>Miniprep DNA saflaştırma kiti</td><td>Promega</td><td>A1330</td><td>Dizileme öncesi Plazmid DNA saflaştırması</td></tr><tr><td>PCR temizleme kiti</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td>PCR ürünlerini klonlamak için hazırlayın</td></tr><tr><td>pDRAW32 yazılımı</td><td>ACAClone</td><td></td><td>Dairesel DNA ve motiflerin bilgisayar analizi</td></tr><tr><td>MEGA6.0 yazılımı</td><td>MEGA</td><td></td><td>Moleküler evrimsel genetik analiz</td></tr><tr><td>Primer 3.0</td><td>Simgene.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT&trade; RiboGreen ve ticaret; RNA Test</td><td>Kiti Thermo-Fisher</td><td>R11490</td><td>RNA miktarının florometrik tayini</td></tr><tr><td>GS Junior & pyrosequencing Sistemi</td><td>Roche</td><td>5526337001</td><td>Sıralama platformu</td></tr><tr><td>GS Junior Titanium EmPCR Kiti (Lib-A)</td><td>Roche</td><td>5996520001</td><td>Emülsiyon PCR için Reaktifler</td></tr><tr><td>GS Jr EmPCR Boncuk Geri Kazanım Reaktifleri</td><td>Emülsiyon PCR</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>için Roche 5996490001 ReaktifleriGS Junior EmPCR Reaktifleri (Lib-A)</td><td>Emülsiyon için</td> <td>Roche</td><td>5996538001</td> Reaktifleri</tr><tr><td>PCR GS Jr EmPCR Oil & Kırma Kiti</td><td>Roche</td><td>5996511001</td><td>Emülsiyon için reaktifler PCR</td></tr><tr><td>GS Jr Titanyum Dizileme kiti*</td><td>Roche</td><td>5996554001</td><td>Sıralama reaktifleri, enzimler, tamponlar ve paketleme boncukları içerir</td></tr><tr><td>GS Jr. Titanyum Pikotiter Plaka Kiti</td><td>Roche</td><td>5996619001</td><td>İlgili reaktifler ve contalarla birlikte sıralama plakası</td></tr><tr><td>IKA Turrax karıştırıcı</td><td></td><td>3646000</td><td>Turrax ile kullanılan özel karıştırıcı Tüpler</td></tr><tr><td>IKA Turrax Tüp (özel karıştırıcı)</td><td></td><td>20003213</td><td>Emülsiyon oluşturmak için iç rotorlu özel karıştırma tüpleri</td></tr><tr><td>GS Nebulizatörler Kiti</td><td>Roche</td><td>5160570001</td><td>Kütüphane hazırlıkları sırasında kullanım için nükleik asit boyutu fraksiyonatörü</td></tr><tr><td>GS Junior emPCR Boncuk Sayacı</td><td>Roche</td><td>05 996 635 001</td><td>Kütüphane boncuk sayacı</td></tr><tr><td>GS Junior Boncuk Biriktirme Cihazı</td><td>Roche</td><td>05 996 473 001</td><td>Santrifüjleme sırasında Picotiter plakası için tutucu</td></tr><tr><td>Karşı ağırlık & Boncuk Biriktirme Cihazları için Adaptör</td><td>Roche</td><td>05 889 103 001</td><td>Pikotiter plaka santrifüjlemeli biriktirme cihazını dengelemek için kullanılır</td></tr><tr><td>GS Junior Software</td><td>Roche</td><td>05 996 643 001</td><td>Cihazı kontrol etmek, veri toplamak ve analiz etmek için yazılım paketi</td></tr><tr><td>GS Junior Sequencer Control v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td><td>(Yukarıdaki 05 996 643 001 maddesine dahildir)</td></tr><tr><td>GS Run Processor v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td><td>(Yukarıdaki 05 996 643 001 numaralı maddeye dahildir)GS</td></tr> <tr><td>De Novo Assembler v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td><td>(Yukarıdaki 05 996 643 001 numaralı ürüne dahildir)GS</td></tr> <tr><td>Reference Mapper v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td><td>(Yukarıdaki 05 996 643 001 numaralı ürüne dahildir)GS</td></tr> <tr><td>Amplicon Variant Analyzer v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td><td>(Yukarıdaki 05 996 643 001 numaralı ürüne dahildir)</td></tr></tbody></table>

ham virion ayıklama dna analizi yeni virüs genleri keşfetmek için virüslü yaprakları gelen rna analizi ile birleştirerek

Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

Bu metagenome yaklaşım dairesel DNA genleri ile bitki virüs ve onların transkript tanımlamak için kullanılır. Ev sahibi olarak düşük titreleri meydana veya mekanik olarak başka bir ana bilgisayara aşılamak değil sık sık bitki DNA virüsler bulaşıcı malzeme büyük bir titresi elde etmek için yaymak zordur. En uygun pH ve çoğu bacilliform Para retrovirüsler arıtma için önerilen iyonik bileşimi ile hafif bir tampon toprağa virüslü yapraklar. Üre virions tuzak dahil cesetleri kırmaya ve hücresel bileşenleri dağıtmak için kullanılır. Fark Santrifüjü daha fazla virions ayrılması bitki kirletici üzerinden sağlar. Sonra İndinavir K tedavi capsids kaldırır. Sonra viral DNA konsantre ve yeni nesil sıralama (NGS) için kullanılır. NGS veri virüs dizileri oluşturulan veri kümesi kümesini tanımlamak için NCBI-BLASTn için hangi gönderilmektedir contigs birleştirmek için kullanılır. Paralel bir boru hattı, RNA bir standart sütunlara göre RNA ayıklama yöntemi kullanarak enfekte yapraklarından izole edilmiştir. MRNA ve virüs tutanaklar bir alt için zenginleştirmek için ribozom tükenmesi sonra gerçekleştirilir. Birleştirilmiş dizileri (RNA-seq) sıralama RNA türetilmiş virüs serilerinde bu veri kümesi kümesini tanımlamak için NCBI-BLASTn için sunuldu. Bizim çalışmada, iki veri kümeleri içinde iki ilgili tam uzunlukta badnavirus genleri tespit edilmiştir. Bu yöntem bitki virüs genom dizileri reconstitute için toplam nüfusun küçük RNA dizilerinin ayıklayan başka bir ortak yaklaşım tercih edilir. Bu ikinci metagenomic boru hattı kurtarır virüs ile ilgili diziler bu retro transkripsiyonu öğeleri bitki genom eklenir. Bu daha da aktif enfeksiyöz ajanlar ayırt etmek biyokimyasal veya moleküler deneyleri için birleştirilmiştir. Bu çalışmada, belgelenen yaklaşım dizileri büyük olasılıkla etkin virüs enfeksiyonu gösteren virüsler çoğaltılıyor temsilcisi kurtarır.

Bu değiştirilmiş virüs arıtma yöntemi virüs DNA'lar NGS ve Biyoinformatik iki virüs türü tanımlamak için yararlı bir zenginleştirme sağlanan. Homogenate 40.000 x g 2,5 h için de centrifuged sonra tüp altındaki yeşil bir pelet ve uzunluğu boyunca beyaz bir Pelet vardı. Yeşil Pelet bir microcentrifuge tüp içine resuspended ve beyaz Pelet iki microcentrifuge tüpler içine resuspended. PCR standart CaYMV PCR tanılama primerler kullanılarak gerçekleştirildiği ve ürünleri solubilized beyaz Pelet ve değil yeşil Pelet (Şekil 1A) tespit edildi. Ham hazırlama örneği transmisyon elektron mikroskobu tarafından incelenmiş ve 124-133 nm uzunluğundadır (Şekil 1B) ölçme bacilliform partikülleri görülmektedir. Çoğu badnaviruses öngörülen kalıcı uzunluğu içinde bu. DNA beyaz ve yeşil çökeltilerini çıkarılan ve ayrı ayrı resuspended. Şekil 1C, biz 5 µL yeşil çıkarılan DNA'ın yüklü ve beyaz Pelet örnek (yeşil kısmı için DNA'ın 1.6 µg) ve DNA 3,1 µg beyaz kısmı için % 0,8 özel Elektroforez jel ve etidyum bromür takip DNA analiz boyama. Beyaz kesir daha yüksek molekül ağırlıklı DNA, hem de daha düşük moleküler ağırlıklı DNA (Şekil 1C) iki grup üretilen ise yeşil kesir düşük moleküler ağırlıklı DNA içerdiği. Şekil 1' deC sunulan jel 100 V 40 min için çalıştırıldı ve jel gerilim daha net bantları üretmek için düşürülmelidir şeritte 3 smear öneriyor. Bu verileri beyaz Pelet virions için zenginleştirilmiş göstermektedir. Beyaz örneğinden çıkarılan DNA (0.6 µg/mL) konsantrasyonu düşük ama yeterli için en az 10 gerektirir NGS ng devam etmek için DNA'ın. Parçalanmış DNA'lar bir kütüphane NGS için hazırlamak için kullanıldı.
Buna paralel olarak, RNA virüslü canna bitkilerden (Şekil 1D) yüksek üretilen iş RNA-devamı için ayıklandı Standart bir iş akışı için Kütüphane hazırlık, contigs oluşturma ve viral genom dizileri (Şekil 1E) tanımlayan NGS yapılmıştır. DNA ve RNA malzemeleri başlangıç olarak kullanarak çıkış sonuçları karşılaştırıldı.
Biz 188,626 ham DNA okuma NGS tarafından ham virüs hazırlık izole DNA'yı kullanarak elde. Okuma 13,269 contigs monte ve BLASTn NCBI veri kümesi nükleotit dizileri aramak için kullanılan (Viridplantae TaxID kullanarak: 33090 ve virüs TaxID: 10239 sınırlayıcı organizmalar olarak) (resim 1E). NCBI-BLASTn sonuçları monte de novo contigs % 93 hücresel dizileri vardı, % 22 bilinmeyen ve virüs contigs (resim 2A) % 0,3 olduğunu ortaya koydu. Contigs hücresel dizileri olarak mitokondriyal tespit edilmiştir olarak kategorize veya kloroplast DNA çoğunluğu. Virüs contigs veri kümesi içinde virüs contigs % 32 (yani Badnavirus dizileri edilmiştir), üyelerine Caulimoviridae ilgili olduğunu ve bunların % 58'i için ile ilgili Badnavirus. Virüs contigs, % 29 yaşına geldiğinde son derece benzer (e < 1 x 10-30)'e CaYMV izole V17 ORF3 gen (EF189148.1), şeker kamışı bacilliform virüs izole Batavia D, komple genom (FJ439817.1), ve muz çizgi CA virüs genomu (tamamlamak KJ013511). Bu nüfus içinde iki tam uzunlukta genleri andıran uzun contigs vardı.
Yüksek üretilen iş RNA-seq üretilen 153,488 temizlenmiş bireysel sıra okuma okuma < 500 bp. dokunma derleme uzunluğu ortalama ile bu 8,243 contigs için azaltılmış. Bunlar NCBI-BLASTn için sunuldu (Viridplantae TaxID kullanarak: 33090 ve virüs TaxID: 10239 sınırlayıcı organizmalar olarak) contigs % 76'bitki hücre dizileri, % 23 kategoride yer çıkışlarını bilinmeyen ve % 0.1 virüs contigs () kategorize Resim 2 B). virüs contigs % 0.1 nüfusunun nüfusun daha yakından incelendiğinde belirlenen bunlar % 68'i Caulimoviridae için (Şekil 2B) ayrıldı. Bu nüfus içinde üç büyük contigs yüksek benzerliği ile tespit edildi (e < 1 X 10-30) CaYMV ayrı tut moduyla V17 ORF3 gen için (EF189148.1), şeker kamışı bacilliform virüs izole Batavia D, komple genom (FJ439817.1) ve muz çizgi CA virüs komple genom (KJ013511). Üç contigs incelenmesi, biz el ile bu bir tam uzunlukta virüs genomu üretmek için iki katıldı.
Biz iki tam uzunlukta virüs genleri varlığını doğrulamak için karşılıklı bir iskele olarak DNA ve RNA sıralama tarafından üretilen virüs genomu uzunluğu contigs göre. 6,966 bir tam uzunlukta virüs genomu bp Canna sarı mottle ilişkili virüs 1 (CaYMAV-1) (Şekil 3A) geçici olarak seçildi. İkinci genom 7,385 yapıldı bp ve Alpinia purpurata (CaYMV-Ap01) (Şekil 3A) hastalık CaYMV bir türevi.
Son olarak, her virüs klon ~ 1000 bp parçası için tasarlanmış PCR astar differentially nüfusu 9 ticari türü temsil eden 227 canna bitkiler her iki genleri tespit etmek için kullanılmıştır. Birçok durumda bireysel bitkiler ile her iki virüs bulaşmış. Biz 12 bitkilerde CaYMAV-1 ve CaYMV-Ap01 RT-PCR tespiti için bir örnek sağlar. Bunlardan üçüydü sadece CaYMV-Ap01 için olumlu ve dokuz her iki virüs (Şekil 3B) olumlu idi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig1.jpg"> Resim 1 : Virüs nükleik asit ürünleri ve NGS iş akışı. (A)özel (% 1.0) Jel Elektroforez, 565 bp PCR parçacıkları CaYMV genleri. İki PCR ürünleri Beyaz Pelet (şerit 1, 2) hazırlanan örnekleri ama yeşil Pelet örnek (lane 3) tespit edildi. Pozitif kontrol (+) virüslü bitki standart paramagnetic selüloz parçacıkları içeren otomatik bir yöntem kullanarak izole DNA güçlendirilmiş bir PCR ürünü temsil eder. Lane L örnek yolları doğrusal DNA bantlarında boyutunu ölçmek için standart olarak kullanılan DNA merdiven içerir. (B) örneği virüs parçacık transmisyon elektron mikroskobu içinde virüslü canna yaprakları ham ayırma tarafından kurtarılan beyaz pelet tarafından görüldü. (C) özel (% 0.8) yeşil (lane 1) kurtarılan DNA'ın Elektroforez jel ve beyaz (lane 2) A. panelinde o test pozitif-PCR tarafından granül Lane 2 yanındaki kırmızı ve sarı nokta beyaz kesir ortaya iki yüksek molekül ağırlıklı DNA grup tanımlayın. (D) özel (% 1) jel elektroforez toplam RNA sütunlara göre RNA arıtma tarafından kurtarıldı. Lane L örnek Lanes doğrusal bantları boyutunu ölçmek için standart olarak kullanılan DNA merdiven içerir. Lane 1-6 dan havuza alınmış ribo tükenmesi ve nükleik asit izolasyonları, Kütüphane hazırlık, sıralama, dokunma derleme ve virüs genomu RNA-devamı (E) şematik boru hattı için tek bir örnek için virüslü canna yaprakları izole RNA içerir bir keşif. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig2.jpg"> Resim 2 : Contigs taksonomik kategorilerini görselleştirme Kronu grafikler. (A) grafik üzerinde bereket ve contigs taksonomik dağıtımı ham virüs hazırlık monte sol gösterir. Doğru grafik Caulimoviridae Aile, Badnavirus cins ve üç yakından ilişkili tür ile ilişkili virüs contigs oranlarını gösteriyor. (B) sol panelde RNA-seq türetilmiş contigs bolluk taksonomik dağılımı üzerinde merkezli gösterir. Sağ tarafta contigs Caulimoviridae Aile, Badnavirus cins ve üç yakından ilişkili tür ile ilişkili virüs contigs nüfusu içinde bolluk gösteren grafiktir. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig3.jpg"> Şekil 3 . CaYMAV-1 ve CaYMV-Ap01 genleri karakterizasyonu. Canna sarı mottle ilişkilendirmek virüs 1 (CaYMAV) ve Canna sarı mottle virüs --dan izole genom benzer grafiksel gösterimi(a) Alpinia purpurata (CaYMV-Ap01). Nükleotit konumları 1-10 genom başlangıç olarak tanımlanır ve bir tRNAtanışmadan antikodon sitesi en badnavirus genleri tipik içerir. Açık okuma çerçevesi (ORF) 1 ve 2 çeviri için durdurma ve başlangıç pozisyonları bitişiktir. Bu proteinler bilinmeyen var işlevleri. ORF3 çinko parmak (ZnF), proteaz (Pro), ters transkriptaz (RT) ve RNAse H etki alanlarını içeren bir polyprotein var. 3' Poli(a) sinyal sıra her iki virüs genleri için korunmuş. (B) RT-PCR analiz virüs bulaşmış yaprakları ve CaYMAV ve CaYMV-Ap01 tespit astar izole RNA kullanılarak gerçekleştirildi. Kalan enfekte ise CaYMAV ve CaYMV-Ap01 ile 12 bitkiler aynı topluluk içinde CaYMV-Ap01 ile üç sadece, bulaşmış. (+) pozitif kontrol gösterir ve (-) negatif kontrol gösterir. Bu rakam çoğaltılamaz/değiştirilmiş Wijayasekara vd. 24 iznine sahip. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Burada iki iplikçikli DNA genleri ile bitki virüsleri tanımlamak için yeni bir yaklaşım mevcut. DNA ve RNA virüslü yaprakları ayıklamak ve yeni nesil sıralama dışarı taşımak için standart yöntemleri kullanın. Bioinformatic araçları dizileri contigs monte, virüs genleri temsil eden contigs tanımlamak ve genleri taksonomik gruplara atamak.

Ham Virion ayıklama DNA analizi yeni virüs genleri keşfetmek için virüslü yaprakları gelen RNA analizi ile birleştirerek

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low ...

Bu yöntem, yeni hastalıkların ortaya çıkması gibi çevre virolojisine dair temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemin temel avantajı, varyantların hücresel bileşenlerden saflaştırılması ve bu varyantların sekanslama için DNA ekstraksiyonunda kullanılmasıdır. Bu fikirle ilk kez, seralarımızdaki bitkilerin bir veya daha fazla bilinmeyen Badnavirus ile enfekte olduğunu fark ettiğimizde karşılaştım. Bu yöntemde yeni olan kişiler üç nedenden dolayı zorluk yaşayabilirler. Birincisi, kaliteli verim elde etmek için homojenizasyon kritik bir adımdır. İkincisi, diferansiyel santrifüjleme birden fazla pelet oluşturabilir ve bu peletlerin nasıl tanımlanıp ayrıştırılacağını bilmeniz gerekir. Üçüncüsü, biyoanalizör sonuçlarının yorumlanması da zor olabilir.Bu prosedürün tüm aşamalarında laboratuvar önlüğü ve eldiven giyilmelidir. İşleme, daha önce -20 °C'de dondurulmuş hastalıklı bitkilerden 80 ila 100 gram yaprak keserek başlayın. Ardından yaprakları, 200 mL öğütme tamponu ve %0,5 sodyum sülfit kullanarak bir Waring blenderında öğütün. Homojenatı bir litrelik bir behere aktarın.Uygun kişisel koruyucu ekipmanlar hala giyiliyorken, homogenata 18 gram üre ve 25 mililitre %10 non-iyonik deterjan ekleyin ve beheri folyo ile kapatın. Bir manyetik karıştırıcı ile gece boyunca karıştırın. Ertesi gün, homogenatı 250 mililitrelik santrifüj rotor şişelerine aktarın ve sabit açılı bir rotorda 4 °C'de 4000 ×g'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatantı geri kazanın ve dört katlı peynir bezinden süzün. Geri kazanılan sıvı homogenatın hacmini ölçün ve ardından homogenatı 38,5 mililitrelik polipropilen santrifüj tüplerine paylaştırın. Homogenatı 4 °C'de 40.000 ×g'de 2,5 saat santrifüjleyin. Santrifüj işlemi tamamlandığında, tüpün dibinde yeşil bir pelet ve tüp boyunca beyaz bir pelet olup olmadığını kontrol edin. Her iki peleti de muhafaza ederek süpernatantı dökün ve örnekleri buza yerleştirin.Beyaz ve yeşil peletin birbirinden ayrılması, prosedürün en zorlayıcı adımlarından biridir. Bu işlem sabır ve beceri gerektirir.Kimyasal çeker ocakta çalışırken, peletleri ayırmak için bir kauçuk polis (rubber policeman) kullanın. Peletleri sıyırarak farklı rotor şişelerine aktarın. Beyaz peletleri içeren rotor şişelerini buza yerleştirin. Her şişeye bir mililitre su ekleyin ve pipetle çekip bırakarak karıştırın. Bir ila iki saatlik süre boyunca, her beş dakikada bir, peleti yeniden süspansiyon haline getirmek için karışımı pipetle çekip bırakarak karıştırın. Beyaz peletler yeniden süspanse edildikten sonra, süspansiyonları gece boyunca dört derece santigrat sıcaklıkta saklayın.Ertesi gün, kalan döküntüleri uzaklaştırmak için süspansiyonu 4 °C'de 6000 ×g'de 10 dakika santrifüjleyin. Konsantre süspansiyonları yeni tüplere aktarın ve virionları çöktürmek için 4 °C'de 136,000 ×g'de iki saat boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırın ve pelletini 1 mL tampon içerisinde yeniden süspanse edin.Bu prosedüre viriyonları parçalayarak başlayın. Pellet süspansiyonlarına 2 µg/µL proteinaz K çözeltisinden 40 µL ekleyin ve 37 °C'de 15 dakika inkübe edin. Her örneğe bir hacim fenol kloroform izoamil alkol ekleyin ve 20 saniye boyunca elle çalkalayın.Oda sıcaklığında 16.000 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Üstteki sulu fazı uzaklaştırın ve yeni bir tüpe aktarın. Bu ekstraksiyon işlemini iki veya daha fazla kez tekrarlayın.DNA'yı etanol çöktürme yöntemiyle konsantre edin. 0.3 molar sodyum asetat pH 5.2 ve 2,5 hacim %95 etanol kullanın. Numuneleri -20 °C'de 30 ila 60 dakika bekletin. Ardından, DNA'yı çöktürmek için 13.000 ×g'de 10 ila 20 dakika santrifüjleyin.Laboratuvar tezgahında çalışarak, DNA peletini bir mililitre 0.1 milimolar TE tamponu içerisinde yeniden süspande edin. Süspansiyonu, santrifüjasyon yoluyla ticari bir jel filtrasyon kolonundan süzün. Hazırlıkların kalitesini görmek ve metinde belirtildiği şekilde DNA kalitesini değerlendirmek için etidyum bromür boyaması kullanarak örnekleri %1 agaroza jel elektroforezi ile analiz edin.Transmisyon elektron mikroskobu ile incelendiğinde, enfekte canna yapraklarının kaba fraksiyonasyonu ile elde edilen beyaz pellet içerisinde virüs partikülleri tespit edilmiştir. Yeşil ve beyaz pelletlerden geri kazanılan DNA'nın agaroz jel elektroforezi, kırmızı ve sarı noktalarla belirtilen beyaz fraksiyonda iki yüksek moleküler ağırlıklı DNA bandı olduğunu belirlemiştir.Enfekte yapraklardan izole edilen RNA'nın bütünlüğü, agaroz jel elektroforezi ile de doğrulanmıştır. Bu grafik, ham virüs preparasyonundan birleştirilen kontiglerin bolluğunu ve taksonomik dağılımını göstermektedir. Ve bu grafik, Caulimoviridae familyası, Badnavirus cinsi ile ilişkili virüs kontiglerinin ve birbiriyle yakından ilişkili üç türle ilişkili kontiglerin oranlarını betimlemektedir.Sıradaki iki grafik, taksonomik dağılımlarına göre RNA dizilemesinden türetilen contiglerin bolluğunu göstermektedir. Sağdaki grafik, Caulimoviridae ailesi Badnavirus cinsi ve birbirleriyle yakından ilişkili üç türe ait virüs contig popülasyonu içindeki contig bolluğunu betimlemektedir. Ortak bir iskele olarak DNA ve RNA dizilemesiyle üretilen virüs genom uzunluğu contiglerinin karşılaştırılması, iki tam uzunluktaki virüs genomunun varlığını doğrulamaktadır.Son olarak, virüsle enfekte olmuş yapraklardan izole edilen RNA kullanılarak yapılan RT-PCR analizi ile her iki virüs genomu da tespit edilmiştir.Bu teknik uzmanlaşıldığında iki gün sürebilirken, yeni başlayan bir kişi için üç gün sürebilir. Bu prosedürü ilk kez gerçekleştirirken, her bir süpernatanttaki homojenat hacminin kayıtlarını tutmanız önemlidir; böylece prosedürün sonunda, nihai DNA verimini başlangıç materyali ile karşılaştırabilirsiniz.Keşfedilmesinden sonra bu yöntem, bitki virolojisi alanında araştırmacıların çevredeki yeni DNA virüslerini tanımlamalarının önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, bitki materyalinin nasıl homojenize edileceği, varyantların nasıl konsantre edileceği ve yeni nesil dizileme için kullanılabilecek yüksek verimli DNA'nın nasıl elde edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Üre ve fenol kloroform ile çalışmanın son derece tehlikeli olduğunu unutmayın; bu kimyasallarla çalışırken her zaman koruyucu gözlük, eldiven, laboratuvar önlüğü ve maske takmak gibi önlemler alınmalıdır. Güvenli ultrasantrifüj işlemi için tüplerin uygun şekilde dengelenmesi önemlidir; bu nedenle tüpleri tartmanız, sallayıcıya karşılıklı olarak yerleştirmeniz ve ağırlık farkının 0,01 arasında olması gerekir.

combining-analysis-dna-crude-virion-extraction-with-analysis-rna-from

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Vaccinia enfeksiyonu HeLa hücrelerinde ve host ve viral gen ekspresyon analizi için protokol. Part 1 3.

Vaccinia Virüs Enfeksiyonu &amp; Virus Gen İfadesi Zamansal Analizi: Bölüm 1

Vaccinia enfeksiyonu HeLa hücrelerinde ve host ve viral gen ekspresyon analizi için protokol. 3 Bölüm...

Vaccinia Virüs Enfeksiyonu &amp; Virus Gen İfadesi Zamansal Analizi: Part 2

Vaccinia enfeksiyonu HeLa hücrelerinde ve host ve viral gen ekspresyon analizi için protokol. Bölüm 3 floresan boyalar amino alil kaplin hem ev sahibi hem viral örnekleri amplifiye RNA etiketleme süreci anlatılmaktadır. 3 Bölüm...

Vaccinia Virüs Enfeksiyonu &amp; Virus Gen İfadesi Zamansal Analizi: Bölüm 3

Biz enfekte hücrelerden yüksek saflıkta herpesvirus nucleocapsid DNA izole süreci tanımlamak. Çözüm yakalanan son DNA ideal, yüksek verimlilik sıralama, yüksek sadakat PCR reaksiyonlar, ve yeni virüs rekombinantlar üretmek için transfections için uygun, yüksek konsantrasyon ve saflık.

Nucleocapsids gelen Viral DNA hazırlanması

Ile bitki hücreleri için birden fazla viral bileşenlerinin teslim senkronize etmek için basit, verimli ve sağlam bir...

Basit ve Sağlam In vivo Ve In vitro</emVirüs Meclisi Öğrenmenin> Yaklaşım

Tek Virüs Genomik (SVG) tek Virons en genom izole etmek ve yükseltmek için bir yöntemdir. Karışık malzeme grubuyla viral süspansiyonları böylece virion yakalama ve alt işleme sırasında genom kesme azaltarak, agaroz içeren ayrık kuyu ile bir mikroskop lamı üzerine akım sitometri kullanılarak sıralanır. Tüm genom amplifikasyonu sekanslama için uygun olan genomik malzeme ile sonuçlanan birden fazla yer değiştirme amplifikasyonu (MDA) kullanılarak elde edilir.

&#39;Tek Virüs Genomik&#39; kullanarak Tek viryonlar İzolasyonu ve Genom Analizi

Burada, Japon ensefalit virüsünün pozitif sarmallı genomik RNA'sının tam uzunlukta bir cDNA'sını içeren bulaşıcı bir bakteriyel yapay kromozom oluşturmak için bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol, diğer pozitif sarmallı RNA virüslerinin işlevsel bir cDNA'sını oluşturmak için kullanılabilir, bu da onu virüs biyolojisini incelemek için güçlü bir genomik araç haline getirir.

Bakteriyel Yapay Kromozom: RNA Virüsler Pozitif iplikli Araştırmaları Fonksiyonel Genomik Aracı

Adenovirüs (Ad) ile enfekte olmuş insan hücrelerinden viral replikasyon kompartmanlarını (RC) izole etmek için yeni bir strateji sunuyoruz. Bu yaklaşım, viral genom replikasyonunu ve ekspresyonunu düzenleyen moleküler mekanizmaların yanı sıra RC'de kurulan viral-konak etkileşimlerinin düzenlenmesine yardımcı olabilecek hücresiz bir sistemi temsil eder.

Adenovirüs ile enfekte Normal İnsan Hücreleri Viral Çoğaltma Bölme zenginleştirilmiş Alt nükleer Kesirler izolasyonu

Bu iletişim kuralı, özellikle etiket ve seçmeli olarak viral genom ilişkili proteinler karakterizasyonu için virüslü hücrelerinden viral DNA izole etmek için hedeftir.

Teşhis edilmesi için kullanılan ilişkili Viral ve hücresel proteinler Viral DNA'ın arıtma

Burada yeni doğmakta olan 3'-termini tarafsız bir belirlenmesi yanı sıra tek iplikçikli DNA moleküllerinin mutational profilleri sağlar bir derin sıralama yaklaşım mevcut. Ana uygulama doğmakta olan retroviral tamamlayıcı DNA'lar (cDNAs), retroviral Ters transkripsiyon işlemi sırasında oluşturulan ara ürün karakterizasyonudur.

Ters transkripsiyon enfekte hücreleri içinde belirleyici 3'-Termini ve HIV-1 sırasında doğmakta olan tek iplikçikli Viral DNA moleküllerinin dizileri

Bu iletişim kuralı, viral enfeksiyon vivo içinde virüs ana bilgisayar etkileşimi analiz için nano-enjeksiyon yöntemi ve temel teknikleri kullanarak Drosophila melanogaster içinde kurmak açıklar.

Viral enfeksiyon ve analiz Drosophila Melanogaster ana bilgisayar virüs etkileşimin kurulması

Keşfedin, bitki virolojisinde yeni DNA virüslerini tanımlamak için enfekte yapraklardan virion saflaştırma ve DNA izolasyonu yöntemini. Bu teknik, yeni virüs genomlarının keşfi için güvenilir bir çerçeve sunar.

Ham Virion ayıklama DNA analizi yeni virüs genleri keşfetmek için virüslü yaprakları gelen RNA analizi ile birleştirerek

Daha fazla video keşfet