Yüksek frekanslı stimülasyon tarafından fare dentat Gyrus aktivasyonu için invaziv bir yöntem

Bu deneyin genel amacı, yüksek frekanslı stimülasyonun nörogenezdeki nöronal aktivite üzerindeki etkisini gözlemlemektir. Bu yöntem, nöron aktivitesinin indüksiyonu ve hipokampustaki nörojenez gibi yüksek frekanslı derin beyin stimülasyonunun hizalanmış hücresel ve moleküler mekanizmalarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin avantajı, yüksek frekanslı TBS'nin nöron aktivitesi ve yetişkin beynindeki nörojenez üzerindeki güçlü etkisini göstermesidir.

Bu yöntem, yüksek frekanslı TBS'nin fare dentat girusu üzerindeki etkileri hakkında fikir verebilse de, klinikteki beyin bozuklukları için bazal gangliyonlar ve subtalamik bölgeler gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu işleme başlamak için, anestezi uygulanmış bir fareyi stereotaktik çerçeveye yerleştirin. Kulak bantlarını başıyla hizalayın ve ortalanmış kafayı desteklemek için hafifçe sıkın.

Kulaklarının önündeki cildi kavrayın ve kafatasının üzerinden yaklaşık bir santimetre kare çıkarın. Ardından, kafatası yüzeyini ortaya çıkarmak için kafatasının üzerindeki kası ve diğer ekleri pamuklu çubukla çıkarın. Ardından, sagital ve lambda sütür çizgilerini belirlemek için kafatasını kurutmak için hidrojen peroksit solüsyonu uygulayın.

Ardından, bregma ve lambda'yı tanımlayın. Bregma noktası, çekirdek konumunu ayarlamak için orijinal nokta olarak kullanılacaktır. Bundan sonra, bu iki noktayı kullanarak kafatasını yatay düzlemde düzleştirin.

Bu iki noktanın yüksekliklerinin dorsal ventral düzlemde hemen hemen aynı olduğundan emin olun. Ek olarak, kafatasının medial lateral düzlemde hizalandığından emin olun. Ardından, stereotaktik cerrahi çerçeve üzerindeki dönen elektrot tutucusuna ev yapımı iki kanallı bakır mikro telli bir elektrot monte edin.

Elektrodu doğrudan bregmanın üzerine yerleştirin ve orijinal yeri olarak ayarlayın. Ardından, elektrodu kafatasına dokunmadan nazikçe kafatasının üzerindeki doğru konuma getirin. Anterior, posterior, medial, lateral ve dorsoventral pozisyonları belirtmek için stereotaktik cerrahi çerçeve üzerindeki dijital ekranı kullanın.

Elektrot yerleştirilmesi için istenen bölge belirlendiğinde, konumu siyah bir işaretleyici ile işaretleyin. Daha sonra, elektrot tutucuyu kaldırmak için dorsoventral stereotaktik ayarlamaları kullanın. Ardından matkap ucunu %70 etanol ile sterilize edin.

El tipi bir mikromanipülatör destekli matkap kullanın, tam olarak işaretli konumda bir çapak deliği açın. Operasyon sırasında herhangi bir kanamayı durdurmak için steril bir pamuklu çubuk kullanın. Dura açığa çıkana kadar delmeye devam edin.

Delme sırasında oluşan kemik artıklarını çıkarmak için bükülmüş bir iğne kullanın ve alttaki yumuşak beyin dokusuna zarar vermeden dura üzerinde bir iğne deliği açın. Çapak deliğinin istenen konumda düzgün bir şekilde yapıldığını doğrulamak için, herhangi bir engele dokunmadan çapak deliğinden düzgün bir şekilde geçtiğinden emin olmak için elektrodu indirin. Herhangi bir direnç tespit edilmezse, elektrodu kafatasının yüzeyinden hedef derinliğe yavaşça yerleştirin.

Ardından, elektrodu yerinde tutmak için küçük bir spatula kullanarak diş çimentosu uygulayın. Çimento kalınlaştıkça, güzel ve pürüzsüz bir kapak oluşturmak için yerleştirilen elektrot ve diğer kemik vidalarının etrafına kalıplayın. Ardından, elektrodu elektrot tutucusundan ayırın.

Fareyi stereotaktik çerçeveden çıkarın ve sıcak bir kafese geri koyun. Farenin serbestçe hareket etmesine izin verin ve kafeste iki gün boyunca iyileşmesine izin verin. Stimülasyon sağlamak için, implante edilmiş elektrodu kablolar aracılığıyla programlanabilir bir stimülatöre bağlayın.

Yazılım arayüzünü ayarlayın. Ardından, HFS parametrelerini 400 Hertz'de altı darbeli altı diziden oluşan altı seri ve 200 miliamperlik stimülasyon yoğunluğu olarak ayarlayın. HFS'yi ayarlandığı gibi istenen süre boyunca teslim edin.

Kontrol grubu için, herhangi bir stimülasyon sağlamadan farelere elektrotlar implante edin. CFAS boyama için, deney farelerini bir gün boyunca iki kez uyarın. BrdU etiketlemesi için hem akut stimülasyon grubuna hem de kronik stimülasyon grubuna uygun stimülasyonlar uygulayın.

Stimülasyon sırasında farenin uyanık olduğundan emin olun. Kabloların bükülmediğinden emin olmayı unutmayın. Stimülasyon tamamlandığında, elektrot pimini kayıt sisteminin konektöründeki elektrot tutucusundan dikkatlice ayırın.

CFAS ve çentik bir boyama için, son HFDBS'den yaklaşık üç saat sonra, cerrahi bir anestezi düzlemi elde etmek için pentobarbital enjekte ederek fareleri uyuşturun. BrdU etiketlemesi için, son HFDBS stimülasyonundan yaklaşık 12 saat sonra, kontrole ve uyarılan farelere iki saatlik aralıklarla altı BrdU enjeksiyonu yapın. Son enjeksiyondan 36 saat sonra, fareleri pentobarbital ile derinlemesine uyuşturun ve transkardiyal olarak 50 mililitre soğuk PBS ve ardından 50 mililitre soğuk% 4 paraformaldehit ile doldurun.

Beceriyi ortaya çıkarmak için kafasını çıkarın ve cilt üzerinde bir kesi yapın. Forseps kullanarak kafatasını hafifçe kesin ve tüm beyni dikkatlice çıkarın. Daha sonra, beynin iki gün daha% 4 paraformaldehit olduğunu düzeltin ve gece boyunca dört santigrat derecede% 30 sükroz çözeltisine aktarın.

Bir kriyostat kullanarak beyni 20 mikronluk koronal bölümlere ayırın. Bölümleri bir fırça ile cam sürgüne aktarın ve monte edin ve eksi 20 santigrat derecede saklayın. Daha sonra, slaytları sabitleyici içermeyen normal PBS'ye aktarın.

Fazla sabitleyicileri çıkarmak için bölümleri PBS ile üç ila dört kez, her biri beş dakika boyunca yıkayın. BrdU etiketli grup için, bölümleri iki molar HCL'de 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin ve 0.1 molar borat tamponunda durulayın. 10 dakika sonra, bölümleri PBS'de her seferinde beş dakika boyunca iki kez yıkayın.

Daha sonra, bölümleri oda sıcaklığında bir saat boyunca bloke edici çözelti içinde inkübe edin. Daha sonra, bölümleri anti-CFAS poliklonal antikor, çentik önleyici bir antikor veya anti-BrdU antikoru ile gece boyunca dört santigrat derecede bir bloke edici çözelti içinde inkübe edin. Bölümler her seferinde 10 dakika boyunca PBS'de üç kez yapıldı, daha sonra bunları Alexa Fluor 568 konjuge anti-kuduz, Alexa Fluor 488 konjuge anti-keçi veya Alexa Fluor 488 konjuge anti-sıçan ikincil antikoru ile oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe etti.

Her seferinde 10 dakika boyunca PBS'de üç kez bölümler oldu. Daha sonra, DAPI içeren bir antifade reaktif montaj ortamı kullanarak immüno-etiketli beyin bölümlerini kapatın. Bölümleri kurumaya bırakın ve dört santigrat derecede ışıktan koruyarak saklayın.

Burada, DG'de BrdU etiketli proliferatif nöronların üretilmesinde HFS tedavisi için deneysel bir paradigma gösterilmiştir. Hayvanlar, farklı stimülasyon paternleri almak için akut ve kronik bir gruba ayrıldı. Daha sonra, her iki gruptaki hayvanlara altıncı günde BrdU enjekte edildi. Sekizinci günde, hayvanlar uyuşturuldu ve kriyostat bölümlerinin hazırlanması için bol miktarda tüketildi.

İşte DG'deki HFDBS sonrası BrdU immünofloresan boyamanın görüntüleri. Nöronal üretimin kantitatif bir analizi, DG'deki akut stimülasyonun nörojenezi artıramadığını gösterdi. DG'deki kronik stimülasyon nörojenezi önemli ölçüde düzenlerken. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, kronik grupta hem ipsilateral hem de kontralateral hemisferde BrdU etiketleme hücrelerinin sayısı önemli ölçüde artmıştır.

Bunlar, PP alt bölgesindeki HFDBS sonrası BrdU immünofloresan boyamanın görüntüleridir. Nöronal üretimin kantitatif bir analizi, PP'deki akut veya kronik stimülasyonun nörojenezi önemli ölçüde artıramadığını gösterdi. BrdU etiketleme hücrelerinin sayısı, HFS tedavisi olsun ya da olmasın nispeten stabildi.

Bu prosedürü denerken, elektrodu doğru bir şekilde yerleştirmeyi ve stimülasyonu başarılı bir şekilde iletmeyi unutmamak önemlidir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, modellere kayıtlı nörobilim yüksek frekanslı stimülasyon alanındaki araştırmacıların önünü açtı. Bu videoyu izledikten sonra, derin beyin çekirdeğine yüksek frekanslı stimülasyonun nasıl sağlanacağını iyi anlamış olmalısınız.