Nerede konularda kesme: Bir diseksiyon ve fare Retina mekansal oryantasyon analiz Rehber'den oküler yerler

Bu diseksiyon protokolünün amacı, fare retinasının topografik oryantasyonu için rektus kasları, koroid fissür ve S-opsin gradyanı gibi oküler anatomik işaretlerin kullanımı için standart bir metodoloji sağlamaktır. Bu tekniklerin ana avantajı, izole bir fare retinasının dorsal, ventral, nazal ve temporal kutuplarını doğru bir şekilde tanımlamak için güvenilir bir yol sağlamalarıdır. Dorsal kornea üzerinde kornea sklera sınırına yakın ve nazal ve temporal kantüs arasında bir nokta belirleyerek başlayın.

Oryantasyon amacıyla bir yanık izi oluşturmak için korneaya ısıtılmış bir koter kalemiyle bir saniyeden daha kısa bir süre dokunun. İkinci göz için tekrarlayın. Dorsal yanığın varlığı, superior rektus kasının tanımlanmasına izin verir.

Enükleasyon için, gözü nazikçe yuvasından dışarı itmek ve küreyi alttan kavramak için kavisli forseps kullanın. Ardından, küre yuvasından serbest kalana kadar küreyi yavaşça yuvasından kaldırın ve aynı anda yavaşça soldan sağa hareket ettirin. Bağlı rektus kasları ile küreyi diseksiyon ortamı içeren bir Petri kabına aktarın.

Her iki gözle de çalışıyorsanız, hangi gözün sol göz ve hangisinin sağ göz olduğunu takip ettiğinizden emin olun. Diseksiyon kapsamı altında, dorsal kornea yanığını görsel olarak bulun ve ilişkili olduğu üst rektus kasını tanımlayın. Diseksiyon makası veya 20 gauge iğne kullanarak korneayı yanık izinden delin

Ardından, üst kası ikiye bölmek için optik sinire doğru küreye derin bir rahatlama kesimi yapın. Burada bu kesi ile izole edilmiş bir retina görülüyor ve bu kesi ile rekonstrükte retina burada gösteriliyor. Retinanın bir kısmı açığa çıkana kadar delinme ile açılan deliği nazikçe yırtarak retinayı izole etmeye başlamak için iki set forseps kullanın.

Ardından, sklera tamamen çıkarılana kadar retinayı skleradan ayırın. Retina tamamen izole olana kadar iris, lens, vitreus ve kalan yapıları çıkarın. Dorsal yanığın varlığı, nazal ve temporal koroid fissürün tanımlanmasına izin verir.

Sağ gözle çalışılıyorsa nazal koroid fissür yanığın sağında, temporal koroid fissür ise yanığın solunda yer alır. Bu, sol gözle çalışmanın tersidir. Retina oryantasyonunu belirlemek için koroid fissür dönüm noktasını kullanmak için, gözün arkasındaki koroid fissürünü bulun ve tanımlayın.

Küreyi, sırt yanık izi üst kutupta yer alacak şekilde yönlendirin, sanki göz hala farenin içindeymiş gibi olacaktır. Ardından, önce sırt yanığının bulunduğu yerde, kürede bir delik açmak için diseksiyon makası veya 20 gauge iğne kullanın. Ardından, dorsal kornea yanığının bulunduğu optik sinire doğru sığ bir rahatlatıcı kesim yapın.

Ardından, optik sinire doğru aşağıdaki iki derin rahatlatıcı kesiği yapın. Biri diseksiyon makasının bıçaklarını gözün arkasındaki temporal koroid fissür çizgisi ile hizalayarak, diğeri ise diseksiyon makasının bıçaklarını gözün arkasındaki nazal koroid fissür çizgisi ile hizalayarak. Bu kesikler burada izole edilmiş ve yeniden yapılandırılmış bir retinada gösterilmiştir.

Bu kesimleri yaptıktan sonra, retinanın bir kısmı açığa çıkana kadar delinme deliklerini nazikçe yırtmak için iki set forseps kullanın. Diseksiyon makası kullanarak, retinada düz durması için dört rahatlatıcı kesi yapın. Retinanın her bir köşesini forseps ile zarın üzerine hafifçe bastırarak retinayı, ganglion hücresi yukarı bakacak şekilde nitroselüloz membran üzerine monte edin.

Ardından, monte edilmiş retinayı 24 oyuklu bir plakanın ilk oyuğunda bulunan bir mililitre% 4 paraformaldehite batırmak için forseps kullanın. 24 oyuklu plakayı oda sıcaklığında bir orbital çalkalayıcı üzerine yerleştirin ve retinayı tam olarak 40 dakika sabitleyin. Sabitledikten sonra, retinayı bir mililitre 0.1 molar PBS ile doldurulmuş olan plakanın ikinci kuyucuğuna aktarın ve retinayı oda sıcaklığında 15 dakika boyunca yıkayın.

Yıkama tamamlandığında, monte edilmiş retinayı bir mililitre bloke edici çözelti içeren beşinci kuyucuğa aktarın ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, tavşan anti-S-opsin birincil antikorunu, bir ila 500 konsantrasyonda bloke edici çözeltiye ekleyin ve dört santigrat derecede üç gün boyunca inkübe edin. Üç günlük inkübasyondan sonra, fazla primer antikoru retinadan altı kez yıkayın ve oda sıcaklığında her biri 10 dakika boyunca bir mililitre PBS ile doldurulmuş altı oyuğa sırayla yerleştirin.

Daha sonra yıkanmış retinayı taze bloke edici solüsyon içeren bir kuyuya yerleştirin ve eşek anti-tavşan Alexa 594 ikincil antikoru ekleyin. Retinayı ikincil antikor ile gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyonun ardından, retinayı daha önce olduğu gibi PBS'de altı kez yıkayın.

Forseps kullanarak, monte edilmiş retinayı PBS içeren bir Petri kabına aktarın. Retina artık bağlı kalmayana kadar forseps uçlarını retina ile zar arasına nazikçe sokarak retinayı nitroselüloz zardan serbest bırakın. PBS'ye bir cam mikroskop lamı daldırın ve retinayı lamın üzerine kaydırarak ve retina cama yapışana kadar forseps ile hafifçe iterek lam üzerine monte edin.

Slayttaki retinayı montaj ortamı ile örtün ve 1.5 lamel yerleştirin. Slaytı bir slayt tepsisine koyun ve bir saat oda sıcaklığında bekletin. Bir saat sonra slayt tepsisini dört santigrat dereceye getirin.

Slayt 24 saat boyunca kaydıktan sonra, kurumasını önlemek için sürgünün kenarlarını kapatmak için oje kullanın. Bu, S-opsin'i etiketlemek için immün olarak boyanmış ve bir epifloresan mikroskobu ile görüntülenmiş sağ gözden izole edilmiş bir retina örneğidir. Topografik oryantasyon S-opsin gradyanı ile tanımlanabildiğinden, bu retinadaki kesiklerin keyfi olduğuna dikkat etmek önemlidir.

Retinanın elde edilen görüntüsü daha sonra ReadiStruct yazılımı ile dijital olarak yeniden yapılandırılabilir. Orijinal kesimler bu görüntüde sahte renkli kırmızıdır. Bu programın çıktı dosyasının retinayı doğru şekilde hizalamadığına dikkat edin.

Retina özel mat laboratuvar kodundan geçirildikten sonra, retina döndürülür, böylece en yüksek S-opsin boyama konsantrasyonu en alta yerleştirilir ve ventral retina olarak tanımlanır. Bu görüntüde sol gözden alınan retina görülmektedir. Temporal kutup, ventral kutuptan saat yönünün tersine 90 derece ve burun kutbu, ventral kutuptan saat yönünde 90 derece uzaklıkta bulunur.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu diseksiyon teknikleri, uygun şekilde yapılırsa sadece birkaç dakika içinde oldukça hızlı bir şekilde yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, üstün rektus kası, koroid fissür veya S-opsin gradyanını bir dönüm noktası olarak kullanarak fare retinasını doğru ve güvenilir bir şekilde nasıl yönlendireceğinizi iyi anlamış olmalısınız.