Name: Veritabanı güdümlü akışı-sitometresi kemik iliği Myeloid hücre olgunlaşma değerlendirilmesi için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 5 s
Description: Öğrenin kemik iliği miyeloid hücre olgunlaşmasını veritabanı güdümlü akış sitometresi ile değerlendirmeyi. Bu yöntem, miyelodisplastik sendrom tanısında araştırmacı özneliğini azaltır ve normal hücre popülasyonlarından farkları nicelleştirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmada kullanılan antikor BD Biosciences tarafından temin edilmiştir. Yazarlar kendi meslektaşı Dr Pascale Flandrin-Gresta, düşük moleküler biyoloji bölümü, Hematoloji Laboratuvarı, Üniversitesi Hastanesi Saint-Etienne, ikinci NGS verilerin yorumlanması için uzmanlık sağlayan Fransa, teşekkür etmek istiyorum MDS durumda. Yazarlar için klinisyen hematolog ve hastalar ve sağlıklı bağış bu çalışmaya katılmak onların anlaşma için ilgi ve bu çalışma katılımı için müteşekkiriz. Yazarlar ayrıca "Les Amis de Rémi" Vakfı yayını için finansal destek için teşekkür etmek istiyorum.

<ol><li>Orfao, A., Ortuño, F., de Santiago, M., Lopez, A., San Miguel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotyping+of+Acute+Leukemias+and+Myelodysplastic+Syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Immunophenotyping of Acute Leukemias and Myelodysplastic Syndromes.</a> Cytometry Part A. 58, 62-71 (2004).</li>
<li>Porwit, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24919805">Revisiting guidelines for integration of flow cytometry results in the WHO classification of Myelodysplastic Syndromes - proposal from the International/European LeukemiaNet Working Group for Flow Cytometry in MDS (IMDSFlow).</a> Leukemia. 28 (9), 1793-1798 (2014).</li>
<li>Westers, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+flow+cytometry+in+the+diagnostic+work-up+of+myelodysplastic+syndromes+in+a+multicenter+approach%3A+Report+from+the+Dutch+Working+Party+on+Flow+Cytometry+in+MDS%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Research%22%5BJournal%5D)">Implementation of flow cytometry in the diagnostic work-up of myelodysplastic syndromes in a multicenter approach: Report from the Dutch Working Party on Flow Cytometry in MDS.</a> Leukemia Research. 36, 422-430 (2012).</li>
<li>Meehan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AutoGate%3A+automating+analysis+of+flow+cytometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Immunologic+Research%22%5BJournal%5D)">AutoGate: automating analysis of flow cytometry data.</a> Immunologic Research. 58, 218-223 (2014).</li>
<li>Greenberg, P. L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21233243">NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology: myelodysplastic syndromes.</a> Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 9, 30-56 (2011).</li>
<li>Greenberg, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelodysplastic+Syndromes%2C+Version+2.2017%2C+Clinical+Practice+Guidelines+in+Oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Comprehensive+Cancer+Network%22%5BJournal%5D)">Myelodysplastic Syndromes, Version 2.2017, Clinical Practice Guidelines in Oncology.</a> Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 15, (2017).</li>
<li><a target="_blank" href="https://www.amazon.com/Classification-Tumours-Haematopoietic-Lymphoid-Tissues/dp/928324494X">WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. Revised 4th Edition</a>. Swerdlow, S. H., et al. (2), IARC Press. Lyon, France. 86-128 (2017).</li>
<li>https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html">https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html</a> (2018).</li>
<li><a target="_blank" href="NULL">Composition of EuroFlow panels and technical information on reagents Version 1.5</a>. , (2017).</li>
<li><a target="_blank" href="NULL">EuroFlow Standard Operating Procedure (SOP) for sample preparation and staining Version 1.2.1</a>. , (2015).</li>
<li>Kalina, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EuroFlow+standardization+of+flow+cytometer+instrument+settings+and+immunophenotyping+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols.</a> Leukemia. 26, 1986-2010 (2012).</li>
<li>http;//www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-flow-cytometry/reagents/antibodies-and-dyes/recombinant-antibodies.aspx. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http;//www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-flow-cytometry/reagents/antibodies-and-dyes/recombinant-antibodies.aspx">http;//www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-flow-cytometry/reagents/antibodies-and-dyes/recombinant-antibodies.aspx</a> (2018).</li>
<li>van Dongen, J. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EuroFlow+antibody+panels+for+standardized+n-dimensional+flow+cytometric+immunophenotyping+of+normal%2C+reactive+and+malignant+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes.</a> Leukemia. 26, 1908-1975 (2012).</li>
<li>Matarraz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+the+Diagnosis+and+Classification+of+Monocytic-Lineage+Leukemias+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+B+%28Clinical+Cytometry%29%22%5BJournal%5D)">Introduction to the Diagnosis and Classification of Monocytic-Lineage Leukemias by Flow Cytometry.</a> Cytometry Part B (Clinical Cytometry). 92 (3), 218-227 (2015).</li>
<li>Westers, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotypic+analysis+of+erythroid+dysplasia+in+myelodysplastic+syndromes.+A+report+from+the+IMDSFlow+working+group%29%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Immunophenotypic analysis of erythroid dysplasia in myelodysplastic syndromes. A report from the IMDSFlow working group).</a> Haematologica. 102, 308-319 (2017).</li>
<li>Shen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+immunophenotypic+findings+in+chronic+myelomonocytic+leukemia+and+its+utility+in+monitoring+treatment+response%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry immunophenotypic findings in chronic myelomonocytic leukemia and its utility in monitoring treatment response.</a> European Journal of Haematology. 95, 168-176 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin. Akış Sitometresi bölümü, Saint-Etienne Üniversitesi Hastanesi Hematoloji Laboratuvarı EuroFlow Konsorsiyumu bir üyesidir.

BM aspiratı kalitesini final sonuçlarına etkisi olabilir. BM aspiratı hemodilution hücrelerin CSF'den olgunlaşma olmaması nedeniyle, farklı evrelerinde veya öncül hücrelerin dağıtım deforme. Muhtemelen bir toplu yöntemi lysing istihdam hemodilution akış sitometrik analizlerde için BM boğulmadan normalleştirme yardımcı olabilir. Ayrıca, BM miyeloid displazi değerlendirilmesi için kritik adımlar akış sitometresi tarafından işleme ve boyama örnek, veri toplama ve yorumu2,...

Fenotipik işaretleri myeloid hücrelerin MDS başlama ve ilerleme sırasında meydana gelen displastik değişiklikler için belirli yokluğunda, olgunlaşma yolları (değiştirilmiş ifade değerlendirmesine dayanarak son yıllarda yeni bir yaklaşım önerilmiştir myeloid antijenleri olgun myeloid hücrelerin üretimi sırasında) veya kemik iliği (BM) içinde farklı hücre türleri anormal dağılımı bölmeleri1,2hücre.
Bu makale myelodisplastik sendrom (MDS) veya diğer myeloid hematolojik hastalıklar ile ilgili BM myeloid hücre bölmeleri displastik değişiklikleri algılamak için MFC standart uygulanması için yeni bir yöntem sunar. Bu çalışma aynı zamanda MFC veri analizi için olgunlaşma veritabanları kullanmanın yardımcı programını gösterir.
Örnek hazırlama yordamı, veri toplama ve Analizi veritabanlarını kullanarak standardizasyon BM myeloid hücrelerin displastik değişiklikler ile ilgili en alakalı fenotipik anormallikler tanımlaması sağlayacak. Bu nedenle, iyi etiketli ve iyi tanınan biçimlerinin (otomatik popülasyon ayırıcı (APS) diyagramları, çubuk grafikler ve nokta araziler) dayalı istatistiksel olarak seçilen alt kümeleri sonraki analizinde kullanılan bir analizi strateji geliştirmek için gerekli olan yuvarlar. MDS sağlam fenotipik anormallikleri keşfi ile veya minimal morfolojik displazi ve sitogenetik aberrancies olmadan durumlarda tanı hafifletir miydi. İmmunophenotypic panelleri azaltılması için izin ayrımcı parametreleri tanımlaması onların uygulanabilirliği klinik patoloji laboratuarlarında izin geçerli puanları2, kolaylaştırmak.
Bu yöntem sitometresi veri, öznel yorumlarını MDS tanı3' te sinyal olarak sınırlar. Bu adım işleme ve akış veri4analiz otomatik araçları geliştirilmesi için bir önkoşuldur.
MDS klonal hematopoetik kök hücre (HSC) bozuklukları spliceosome mutasyonlar MDS fenotip vermeye belirli epigenetik değiştiriciler ile işbirliği heterojen bir grup oluşur. Şimdi HSC mutasyonlar ile birlikte diğer mekanizmaları anormal Bağışıklık-aracılı inflamasyon ve malign HSCs ve BM stromal microenvironment arasındaki etkileşimler gibi MDS patofizyolojisi katılmaktadırlar, bilinen. Ancak, bu mekanizmalar kötü anlaşılır kalır. MDS geniş klinik ve biyolojik heterojen tanı ve en uygun tedavi yelpazesi bir meydan okuma yapar. Son on yılda birden fazla çalışmalar MFC kez daha olduğunu göstermiştir içinde hafiye displazi2 morfoloji ama teknik ve ekonomik kısıtlamaları daha duyarlı olun bu teknik, sonuçlar genellikle bağlı olarak standart hale getirmek zor Tercüman3deneyim. Ayrıca, nasıl MFC minimal morfolojik displazi olgularının ve sitogenetik anomali yokluğu veya hypocellular MDS, düşük patlama sayısı, olan gibi sınırda durumlarda denge MDS doğru klonal olmayan diğer BM ipucu belli değil kemik iliği yetmezliği gibi bozukluklar (i.e., aplastik anemi). Ayrıca akut miyeloid lösemi (AML) MDS sınırda durumlarda patlamalar bir fazlalığı ile ayırt etmek zor kalır. Tüm bu nedenlerden dolayı MFC MDS son tanı test klinik yönergeleri entegre değil. 2011 yılında ABD Ulusal kapsamlı kanser ağ (NCCN) CD34 + hücre yüzdesi, paroksismal nokturnal hemoglobinuria klonlar tespiti ve sitotoksik T Hücre klonlar hypocellular MDS5varlığı tahmini için MFC önerilir. Klinik veri immünsüpresif tedavi6bu hastaların iyi bir tepki göstermiştir olduğundan bu iki ikinci durum terapötik bir hedef de içerir. Uluslararası çalışma grubu (IWG) öneriler, gerekçe göstererek 2017 NCCN yönergeleri MFC tarafından anormal immunophenotyping algılama MDS tanı için ama herhangi bir özellikleri6yapmadan Co kriterlerin yanında listelenir. Buna ek olarak, kısa bir süre önce WHO sınıflandırma MFC bulgular yalnız MDS birincil tanısı kesin morfolojik ve/veya sitogenetik veri7yokluğunda kurmak için yeterli değildir öngörülüyor. Ancak, MFC olgunlaşma desenleri myeloid hücre bozukluk gösteren ve "mesafe"--dan normal bir hasta için hastalık sahası içinde belirli bir zamanda miktarının ek bir test olarak kullanılabilir.
Bu yöntem klinik laboratuvarlarında çalışan BM myeloid hücrelerin MDS veya displastik anormallikler ile diğer myeloid bozuklukları tanı iyileştirmek için MFC immunophenotyping, kullanarak displazi değerlendirilmesi ile ilgilenen geçerlidir.

<table><tbody><tr><td>BD FACSCanto II akış sitometresi</td><td>BD Biosciences, CA, ABD</td><td>SN:</td> V33896301336 <td>3 lazer, 4-2-2 konfigürasyonu, Filtreler ve ayna detayları: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf</td></tr><tr><td>Awel C48-R Santrifüj</td><td>AWEL Industries, FR</td><td>SN: 910120016; model numarası: 320002001</td><td>düşük hızlı santrifüj; kapasite 60 FACS tüp</td></tr><tr><td>10 ve mikro pipetler; L ve 200 & mikro; L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipetleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon tüpleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fare Anti-İnsan HLA-DR</td><td>BD Biosciences, CA, ABD</td><td>için</td> polipropilen tüp 655874 <td>klon L243 Fare BALB/c IgG2a, & kappa; Florokrom Horizon V450 (Ex max 404 nm/ Em max 448 nm)</td></tr><tr><td>Mouse Anti-Human CD45</td><td>BD Biosciences, CA, ABD</td><td>560777</td><td>klonu HI30 Fare IgG1, &kappa; Florokrom Horizon V500 (Ex max 415 nm/ Em max 500 nm)</td></tr><tr><td>Mouse Anti-Human CD16</td><td>BD Biosciences, CA, ABD</td><td>656146</td><td>klon CLB/fcGran1 Fare BALB/c IgG2a, &kappa; Florokrom FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)</td></tr><tr><td>Fare Anti-İnsan CD13</td><td>BD Biosciences, CA, ABD</td><td>347406</td><td>klonu L138 Fare BALB/c X C57BL/6 IgG1, &kappa; Florokrom PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)</td></tr><tr><td>Mouse Anti-Human CD34</td><td>BD Biosciences, CA, ABD</td><td>347222</td><td>klonu 8G12 Fare BALB/c IgG1, &kappa; Florokrom PerCP-Cy5.5 (Ex max 482 nm/ Em max 678 nm)</td></tr><tr><td>Fare Anti-İnsan CD117</td><td>BD Biosciences, CA, ABD</td><td>339217</td><td>klonu 104D2 Fare BALB/c IgG1 Florokrom PE-Cy7 (Ex max 496 nm/ Em max 785 nm)</td></tr><tr><td>Fare Anti-İnsan CD11b</td><td>BD Biyolojik Bilimler, CA, ABD</td><td>333143</td><td>klonu D12 Fare BALB/c IgG2a, &kappa; D12, Florokrom APC (Ex max 650 nm/ Em max 660nm</td></tr><tr><td>Fare Anti-İnsan CD10</td><td>BD Biosciences, CA, ABD</td><td>646783</td><td>klonu HI10A Fare BALB/c IgG1, &kappa; Florokrom APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)</td></tr><tr><td>Fare Anti-İnsan CD35</td><td>BD Biosciences, CA, ABD</td><td>555452</td><td>klonu E11 Fare IgG1, &kappa; Florokrom FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)</td></tr><tr><td>Fare Anti-İnsan CD64</td><td>BD Biosciences, CA, ABD</td><td>644385</td><td>klonu 10.1 Fare BALB/c IgG1, &kappa; Florokrom PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)</td></tr><tr><td>Fare Anti-İnsan CD300e</td><td>Immunostep</td><td>IREM2A-T100</td><td>klonu UP-H2 Fare BALB/c IgG1, k Florokrom APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)</td></tr><tr><td>Fare Anti-İnsan CD14</td><td>BD Biyolojik Bilimler, CA, ABD</td><td>641394</td><td>klon MoP9 Fare BALB/c IgG2b, &kappa; Florokrom APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)</td></tr><tr><td>Fare Anti-İnsan CD36</td><td>BD Biosciences, CA, ABD</td><td>656151</td><td>klonu CLB-IVC7 Fare IgG1, &kappa; Florokrom FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)</td></tr><tr><td>Mouse Anti-Human CD105</td><td>BD Biosciences, CA, ABD</td><td>560839</td><td>klonu 266 Fare BALB/c IgG1, &kappa; Florokrom PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)</td></tr><tr><td>Fare Anti-İnsan CD33</td><td></td><td>345800</td><td>klonu P67.6 Mouse BALB/c IgG1, &kappa; Florokrom APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)</td></tr><tr><td>Mouse Anti-Human CD71</td><td>BD Biosciences, CA, ABD</td><td>655408</td><td>klonu M-A712 Fare BALB/c IgG2a, &kappa; Florokrom APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)</td></tr><tr><td>Lizasyon Çözeltisi 10x Konsantre (IVD)</td><td>BD Biosciences, CA, ABD</td><td>349202</td><td></td></tr><tr><td>FACSFlow Sheath Sıvısı</td><td>BD Biosciences, CA, ABD</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva CS& T IVD boncukları</td><td>BD Biosciences, CA, ABD</td><td>656046</td><td></td></tr><tr><td>GÖKKUŞAĞI KALIBRASYON PARÇACIKLARI, 8 TEPE</td><td>Cytognos, Salamanca, İspanya</td><td>SPH-RCP-30-5A</td><td>çok EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01</td></tr><tr><td>Kompanzasyon Parçacıkları Çok Renkli CompBeads (CE / IVD)</td> <td>BD Biosciences, CA, ABD</td><td>Referans #51-90-9001229 + #51-90-9001291</td><td></td></tr><tr><td>Diva yazılım sürümleri 6.1.2 ve 6.1.3</td><td>BD Biosciences, CA, ABD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu su tabletleri</td><td>R& D Systems, Minneapolis, ABD</td><td>5564</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini&nbsp;( BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich, Fransa</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum azid% 99</td> <td>Sigma-Aldrich, Fransa</td><td>199931</td><td></td></tr><tr><td>Infinicyt yazılım sürümü 1.8.0.e</td><td>Cytognos, Salamanca, İspanya</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

veritabanı güdümlü akışı-sitometresi kemik iliği myeloid hücre olgunlaşma değerlendirilmesi için

Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation

Fransızca sitometresi Derneği (AFC) içinde başlatılan bir çalışma grubu miyeloid hastalık tanı Fransa multiparameter akış sitometresi (MFC) uygulama uyum amacıyla geliştirilmiştir. Burada sunulan protokolü üzerinde anlaşılan ve Eylül 2013 ve Kasım 2015 yılları arasında uygulanan altı Fransız tanı Laboratuarı (Üniversite Hastaneleri Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Nice ve Lille ve Institut Paoli-Calmettes oldu Marsilya) ve kemik iliği örnek hazırlama ve veri toplama standardizasyon izin verdi. Üç olgunlaşma veritabanı nötrofil, Monositik, ve erythroid soy "sağlıklı" donör bireyler (bireyler hematopoetik hastalık herhangi bir kanıt olmadan) kemik iliği ile geliştirilmiştir. Analiz sağlam bir yöntem her miyeloid lineage için rutin tanı kullanım için uygulanabilir olmalıdır. Yeni olgu aynı şekilde analiz ve her zamanki veritabanlarının karşı karşılaştırıldığında. Böylece, nicel ve nitel fenotipik anormallikler tespit edilmesi ve bu normal kemik iliği örnekleri verilerle karşılaştırıldığında 2SD yukarıda gösterge patolojisi düşünülmelidir. Daha yüksek değişkenlik Hibridoma teknolojilerini temel alan ve şu anda klinik tanıda kullanılan yöntemleri ile elde edilen monoklonal antikor kullanılarak elde veriler arasında büyük kısıtlamadır. Alınan veri teknik doğrulama ölçütlerini ayar MFC yardımcı programı için MDS diagnostics artırmanıza yardımcı olabilir. Bu kriterler kurulması bir veritabanıyla analiz gerektirir. Veri Analizi araştırmacı öznellik azalma bu yöntemin önemli bir avantajdır.

K-EDTA antikoagülan hasat 54 BM örnekleri çalışmaya dahil. MFC veri yokluğunda hastalar hakkında herhangi bir bilgi, analiz edildi. Retrospektif çalışma BM örnekleri (5 erkek ve 47.4 [35-48] 2 kadın bir Medyan yaş ile hematopoetik hastalığı (8 ve 57,9 [35-72] bir Medyan yaş ile 3 erkek) kanıtı yok ile 11 kişi ve 36 olgu çeşitli ile 7 sağlıklı bağışçılardan olduğunu gösterdi patolojik koşullar: 1 durumda anemi ve düşük kreatinin düzeyi, anemi ve yüksek kreatinin düzeyi, inflamasyon, anemi...

MDS tanı morfolojik ölçüt veya bilgilendirici sitogenetik yokluğunda zordur. MFC MDS tanı sürecinin rafine yardımcı olabilir. Klinik uygulamalar için faydalı olmak için MFC analiz parametreleri üzerinde yeterli özgüllük ve duyarlılık ile esas almalıdır ve veri arasında farklı operatör tekrarlanabilir olmalıdır.

Veritabanı güdümlü akışı-sitometresi kemik iliği Myeloid hücre olgunlaşma değerlendirilmesi için

A working group initiated within the French Cytometry Association (AFC) was developed in order to harmonize the application of multiparameter flow ...

Bu yöntem miyelodisplazi sendromları veya miyeloid hücre soylarında olgunlaşma anormallikleri ile gelişen diğer hematolojik hastalıklar gibi miyeloid hastalıkların tanısında anahtar soruların cevaplanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, bu analiz ve yorumlamada araştırmacının öznelliğini azaltmasIdır. Bu yöntem, miyelodisplazi için en ayrımcı parametrelerin hangileri olduğunu anlamalarını sağlayabilir.Normal miyeloid hücre popülasyonlarından farklılıkların ölçülmesine izin verir. Prosedürü gösteren Tiphanie Picot, bizim laboratuvardan doktora sonrası bir adam olacaktır. Birincil hücre örneğinin 600 mikrolitresini, 15 mililitrelik konik bir tüpte 10 mililitre yıkama tamponu yla iki santrifüj ve yıkama başına 10 mililitre taze yıkama tamponu ile karıştırarak başlayın.İkinci yıkamadan sonra, peleti 400 mikrolitre taze yıkama tamponu yla yeniden askıya alın ve hücre süspansiyonunun 350 mikrolitresini omurga antikorlarının tüm panelini içeren beş mililitrelik polipropilen FACS tüpüne aktarın. Hücreleri iyice karıştırdıktan sonra, pipet hücre antikor çözeltisinin hacimleri üç yeni polipropilen tüplere eşit hacimlerde ve gerektiğinde taze yıkama tamponu ile 200 mikrolitreye kadar her tüpteki son hacmi getirir. Daha sonra, ışıktan korunan oda sıcaklığında 30 dakikalık bir kuluçka için, karıştırma ile ilgi hücre yüzeyi belirteçleri karşı antikorların uygun hacmi ekleyin.Kuluçka sonunda, ışıktan korunan oda sıcaklığında 10 dakikalık bir kuluçka için karıştırma ile iki mililitre lysing çözeltisi ekleyin. Santrifüj ile lysed hücreleri toplamak ve pelet rahatsız etmeden, her tüpte supernatant son 50 mikrolitre hariç tüm atın. Kalan süpernatantpelet yeniden askıya, nazik karıştırma ile, ve her örnek için taze yıkama tampon iki mililitre ekleyin.İkinci yıkamadan sonra, her tüpte peleti bozmadan yaklaşık 50 mikrolitre kalıntı hacmi bırakarak süpernatantı atın. Hemen analiz için, karıştırma ile PBS 200 mikrolitre pelet yeniden askıya. Akış sitometresindeki örnekleri okumak için, önce akış sitometre yazılımında yeni bir deneme açın ve denemeyi ada, örnek türüne ve tarihe göre yeniden adlandırın.Üç tüp için yeni bir örnek oluşturun ve deneme düzeninde her tüpte kullanılan antikorları belirtin. Aylık kurulumda elde edilen değerleri uygulamak için sitometre ayarlarını açın ve uygulama ayarlarını seçin. Yeni bir küresel çalışma sayfası açın ve tek lisit hücrelerinin yanı sıra granülosit, monosit, patlama ve lenfosit popülasyonları için uygun nokta çizimlerini oluşturun.Telafi denetimleri için yeni bir genel çalışma sayfası oluşturun. Daha sonra, her tüpten 500,000 olay elde edin, orta satın alma oranında, verileri teknik doğrulamalarından sonra fcs 3.0 dosyaları olarak dışa aktarın. Yeni bir analize başlamadan önce, nötrofil, monositik ve çekirdekli kırmızı soylar için normal kemik iliği verilerini içeren cyt dosyalarını ve analiz dosyalarını inp formatında indirin.Ardından, verileri masaüstünüze kaydedin. Nötrofil olgunlaşmasını veri tabanına kaydetmek için önce Infinicyt yazılımını açın ve ardından nötrofil olgunlaşma verilerine karşılık gelen cyt dosyasını açın. APS grafiğindeki olgunlaşma yolunu çizin ve nötrofilin olgunlaşma yolunu veritabanına kaydedin.Analiz edilmesi gereken nötrofil soy olgunlaşması için fcs dosyasını açın. Profiller sekmesinden nötrofil olgunlaşma inp dosyasını yükleyin. Bu soy için analiz üç adıma ayrılmıştır.CD34 pozitif, nötrofil kararlı patlamalar seçimi ile başlayın. Bu amaçla, CD34 pozitif, CD117 pozitif, HLADR düşük, CD10 negatif, CD13 pozitif, CD11 b-negatif olayların seçimine izin vermek için yedi kapının kesişme sini kullanın. CD117 pozitif, CD34 negatif nötrofil öncüllerinin seçimi ile analize devam edin.Daha olgun nötrofil hücrelerinin seçimi ile analize devam edin. Sonra, monositik soy hücrelerinin analizini gösterin. APS grafiğindeki olgunlaşma yolunu çizin.Olgunlaşma duygusunu gösteren okun olgunlaşmamış, monositik hücrelerden CD14 negatif, IREM2 negatif, olgun monositler, CD14 pozitif, IREM2 pozitif edoğru olduğunu doğrulayın. Olgunlaşma yolunu monositik soy için veritabanına kaydedin. Analiz edilmesi gereken monositik soy olgunlaşması için fcs dosyasını açın.Monositik soy analizi için profili yükleyin. Monositik soy hücrelerini tanımlamak için, CD64 pozitif yüksek, CD117 pozitif, CD117 negatif, HLADR pozitif olayların seçimine izin veren dört kapının kesişimini kullanın. Bu olayları nüfus hiyerarşisi ağacındaki monositik sekmeye atayın.NRC veritabanına kaydedilmesi gereken NRC cyt dosyasını açın. APS grafiğindeki olgunlaşma yolunu çizin ve çekirdekli kırmızı hücrelerin olgunlaşma yolunu veritabanına kaydedin. Analiz edilmesi gereken fcs dosyasını açın.Profillerden çekirdekli kırmızı hücreler için analiz şablonu yükleyin. Bu soy için çözümleme iki adıma ayrılmıştır. CD34 pozitif seçimi ile başlayarak, eritroid patlamalar taahhüt etti.Burada, CD34 pozitif, CD117 pozitif, HLADR düşük, CD105 pozitif, CD33 negatif, CD36 pozitif, CD71 pozitif olayların seçimine izin vermek için yedi kapının kesişimini kullanın. Bu olayları nüfus hiyerarşisindeki NRK sekmesine atayın. CD34 pozitif eritroid taahhüt patlamaları görünürlükten çıkarın.Daha olgun eritroid hücreleri tanımlamak için, CD45 negatif ve CD45 pozitif düşük, yan dağılım düşük, CD36 pozitif yüksek ve CD71 pozitif yüksek ayrımcılık sağlayan dört kapı bir kesişme kullanın. Ardından, CD36 yüksek yan dağılım düşük trombositlerini çekirdekli kırmızı hücrelerden çıkarın ve bu popülasyonu NRK sekmesine atayın. Kemik iliği bölmesindeki miyeloid olgunlaşmayı değerlendirmek için, değerlendirilmesi gereken davadan alınan ilgi soyundan gelen sit dosyasını açın.Yalnızca nüfus hiyerarşisi ağacında nötrofil sekmesine atanan olayları görünür tutun. APS grafiğindeki olgunlaşma yolunu çizin ve nötrofilin normal kemik iliğindeki olgunlaşmasına karşılık gelen veritabanını yükleyin ve verileri karşılaştırın. Veriler en azından kısmen uyumluysa, yazılım olgunlaşma farklılıklarını görselleştirmek için normalleştirilmiş bir olgunlaşma farkları diyagramı ve bir parametre bandı oluşturur.Kemik iliği bölmesi monosit olgunlaşma karşılaştırmak için, monositveritabanı da dahil olmak üzere normal kemik iliği verileri ile yeni bir durumda, monositik hücre soyu karşılık gelen sit dosyasını açın. Yalnızca popülasyonlar hiyerarşisi ağacında monositler sekmesine atanan olayları görünür tutun ve APS grafiğinde olgunlaşma yolunu çizin. Normal kemik iliklerinde monosit olgunlaşmasına karşılık gelen veritabanını yükleyin ve verileri karşılaştırın.Kemik iliği bölmesi çekirdekli kırmızı hücrelerin olgunlaşmakarşılaştırmak için, yeni bir durumda, normal kemik ilikleri verileri ile, NRC veritabanında dahil, NRC soyundan karşılık gelen sit dosyasını açın. Yalnızca nüfus hiyerarşisi ağacında NRK sekmesine atanan olayları görünür tutun. Ve APS grafiğindeki olgunlaşma yolunu çizin.Normal kemik iliklerinde NRC olgunlaşmasına karşılık gelen veritabanını yükleyin ve verileri karşılaştırın. Ardından, yeni dosya ile veritabanında bulunan veriler arasındaki farkların önemini görselleştirmek için normalleştirilmiş olgunlaşma farklarını tıklatın ve yakınlaştırın. Akış sitometrik veri analizinde hiyerarşik sınıflandırma algoritmalarını kullanan yöntemlerin son derece öznel ve doğal olarak yanlış olduğunu unutmayın, çünkü hücre popülasyonu çakışması için sayılmazlar.Miyeloid normal olgunlaşma veritabanlarına karşı MDS olduğundan şüphelenilen yeni sitopeni olgularının değerlendirilmesi, sitolojik veya sitojenik anormallikleri olmayan olgularda bile nötrofil, monosit ve NRC soylarının anormal ifade edilmiş olgunlaşma antijenlerinin belirlenmesine olanak sağlar. Bu yordamı denerken, akış sitometrik verileri standart bir şekilde elde etmeyi, aylık sitometre ayarını, günlük kontrolleri, kullanmadan önce antikorları titizlikle pipetleme yi ve boyama sürelerine saygı göstermeyi unutmamak önemlidir. Bu yordamı takiben, pusula gibi başka bir yöntem, farklı olgu grubunu karşılaştırmak ve belirli bir vaka grubu için son tipobik künyenin ne olduğu gibi ek sorulara yanıt vermek için gerçekleştirilebilir.Bu teknik, geliştirildikten sonra, displastik süreçle güvenilir bir şekilde ilişkili son typic değişiklikleri belirlemek için belirsiz potansiyelklonal hematopoezis durumlarında, miyeloid hücre olgunlaşma desenleri keşfetmek isteyen araştırmacılar için yol açtı. Veritabanını sağlıklı bağışçılardan gelen veri sayısıyla güncellemenin analizin sağlamlığını artırabileceğini lütfen unutmayın.

database-guided-flow-cytometry-for-evaluation-bone-marrow-myeloid

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Süzülen makrofajlar dolaşımdaki öncüllerden yetişkin dokulara sürekli olarak işlenirken, yerleşik makrofajlar, gelişme sırasında dokularını tohumlamakta ve burada progenitörlerden başka girdiler almadan korunmaktadırlar. Yerleşik makrofajların öncüleri yakın zamanda tanımlandı. Burada, yerleşik makrofaj öncüllerinin genetik kader haritalaması için yöntemleri sunuyoruz.

Akım Sitometresi ile Fare Embriyosunda Eritromiyeloid Progenitörlerin Ve Döllerinin Belirlenmesi

En küçük veya ölçülebilir rezidüel hastalığı (MRD) tespiti risk değerlendirme rafine ve Relaps Akut Miyeloid Lösemi (AML) içinde tahmin için önemli bir prognostik biyomarker olduğunu. Bu sõnõrlar ve önerileri ile tutarlı ve doğru kimlik ve MRD, tespiti için en iyi yöntemler yardımcı etkili AML tedavi karar verme.

Örnek ve işlem kemik iliği ölçülebilir artık hastalık ve akut Myeloid lösemi lösemik kök hücre ölçmek için kapsamlı iletişim kuralı

Biz aynı anda ifade birincil akut myeloid lösemi hücreleri üzerinde lösemi kök hücre işaretlerinin Akış Sitometresi tarafından tespit etmek için bir protokol anahat. Biz üç yaratıcı nüfus ve artan olgunlaşma derecesi ile sözde bir LSC nüfus ölçmek için nasıl gösterir. Biz bu nüfus içinde karşılık gelen hasta-türetilen-xenografts varlığını doğruladı.

Akış Sitometresi lösemi kök hücre birincil Akut Miyeloid Lösemi ve hasta-türetilen-xenografts, tanı ve takip yukarı tahmin etmek için

Biz nasıl tanımlanmasını ve yalıtılmasını miyeloid ataları fare kemik iliği bir manyetik kombinasyonu ve floresan (MAC'ler ve FACS) sıralama kullanarak üzerinden 6 alt kümelerini göstermek. Bu iletişim kuralı vitro kültürü deneyleri (methylcellulose ya da sıvı kültürleri), in vivo evlat edinen transfer deneyler ve RNA/protein analizleri için kullanılabilir.

Kimlik ve yalıtım Oligopotent ve Lineage için kabul edilen miyeloid ataları fare kemik iliği dan

Burada periton, dalak ve kemik iliği dokularındaki murin immün B hücre bölmesinin akış sitometrisine göre heterojenliğinin basit bir analizinde açıklanmaktadır. Protokol diğer fare dokularına uyarlanabilir ve genişletilebilir.

Murine B Hücre Gelişiminin Akış Sitometrik Karakterizasyonu

Burada, murin kemik iliği hücrelerinin fenotip hemopoietik kök ve progenitör hücrelere izolasyonu ve boyanması ile destekleyici niş endotel ve mezenkimal kök hücrelere yönelik basit bir protokol tanımlanmıştır. Endosteal ve santral kemik iliği bölgelerinde bulunan hücreleri zenginleştirmek için bir yöntem de dahil edilmiştir.

Murin Kemik İliği Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücrelerin ve Stromal Niş Hücrelerin Akış Sitometri Analizi

Burada sunulan, hücre bölünmelerinin sayısını, yüzey hücresi fenotipini ve hücresel akrabalığı aynı anda ölçmeye izin veren akış sitometrisine dayalı bir tekniktir. Bu özellikler, permütasyon tabanlı bir çerçeve kullanılarak istatistiksel olarak test edilebilir.

Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücreler için Akış Sitometrisi ile Akrabalık, Bölünme Sayısı ve Fenotipin Eşzamanlı Değerlendirilmesi

Burada, miyelodisplastik sendromlar ve akut miyeloid löseminin murin modellerinden kemik iliği mikroçevre popülasyonlarını izole etmek ve karakterize etmek için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Bu teknik, endotelyal ve mezenkimal stromal hücreler dahil olmak üzere hematopoietik olmayan kemik iliği nişindeki değişiklikleri hastalık ilerlemesi ile tanımlar.

Miyelodisplastik Sendrom ve Akut Miyeloid Lösemide Kemik İliği Mikroçevresel Popülasyonlarının Belirlenmesi

Mevcut protokol, farelerden yüksek oranda homojen kemik iliği mezenkimal kök hücrelerini (BMSC'ler) saflaştırmak, genişletmek ve karakterize etmek için uygun maliyetli bir yöntemi tanımlamaktadır. Bu yaklaşım, yüksek proliferasyon ve farklılaşma potansiyeline sahip büyük miktarlarda BMSC'lerin elde edilmesini kolaylaştırır, fare modellerini destekler ve klinik öncesi araştırmaları ilerletir.

Fare Kaynaklı Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücrelerinin Saflaştırılması, Genişletilmesi ve Akış Sitometrisi Tabanlı Fenotiplendirilmesi

Bu myeloid türevi bastırıcı hücreler (MDSC) işaretleyicidir ve Gr-1 zenginleştirmek için hızlı ve kapsamlı bir...

Akım Sitometri ve Otomatik Manyetik Aktif Hücre Sıralama (AutoMACS) kullanarak Naive ve Pankreas Tümör taşıyan fareler ile myeloid türevi bastırıcı hücreler (MDSC) hazırlanması

Öğrenin kemik iliği miyeloid hücre olgunlaşmasını veritabanı güdümlü akış sitometresi ile değerlendirmeyi. Bu yöntem, miyelodisplastik sendrom tanısında araştırmacı özneliğini azaltır ve normal hücre popülasyonlarından farkları nicelleştirir.

Veritabanı güdümlü akışı-sitometresi kemik iliği Myeloid hücre olgunlaşma değerlendirilmesi için

Daha fazla video keşfet