Veritabanı güdümlü akışı-sitometresi kemik iliği Myeloid hücre olgunlaşma değerlendirilmesi için
3 Kasım 2018
MDS tanı morfolojik ölçüt veya bilgilendirici sitogenetik yokluğunda zordur. MFC MDS tanı sürecinin rafine yardımcı olabilir. Klinik uygulamalar için faydalı olmak için MFC analiz parametreleri üzerinde yeterli özgüllük ve duyarlılık ile esas almalıdır ve veri arasında farklı operatör tekrarlanabilir olmalıdır.
Bu yöntem miyelodisplazi sendromları veya miyeloid hücre soylarında olgunlaşma anormallikleri ile gelişen diğer hematolojik hastalıklar gibi miyeloid hastalıkların tanısında anahtar soruların cevaplanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, bu analiz ve yorumlamada araştırmacının öznelliğini azaltmasIdır. Bu yöntem, miyelodisplazi için en ayrımcı parametrelerin hangileri olduğunu anlamalarını sağlayabilir.
Normal miyeloid hücre popülasyonlarından farklılıkların ölçülmesine izin verir. Prosedürü gösteren Tiphanie Picot, bizim laboratuvardan doktora sonrası bir adam olacaktır. Birincil hücre örneğinin 600 mikrolitresini, 15 mililitrelik konik bir tüpte 10 mililitre yıkama tamponu yla iki santrifüj ve yıkama başına 10 mililitre taze yıkama tamponu ile karıştırarak başlayın.
İkinci yıkamadan sonra, peleti 400 mikrolitre taze yıkama tamponu yla yeniden askıya alın ve hücre süspansiyonunun 350 mikrolitresini omurga antikorlarının tüm panelini içeren beş mililitrelik polipropilen FACS tüpüne aktarın. Hücreleri iyice karıştırdıktan sonra, pipet hücre antikor çözeltisinin hacimleri üç yeni polipropilen tüplere eşit hacimlerde ve gerektiğinde taze yıkama tamponu ile 200 mikrolitreye kadar her tüpteki son hacmi getirir. Daha sonra, ışıktan korunan oda sıcaklığında 30 dakikalık bir kuluçka için, karıştırma ile ilgi hücre yüzeyi belirteçleri karşı antikorların uygun hacmi ekleyin.
Kuluçka sonunda, ışıktan korunan oda sıcaklığında 10 dakikalık bir kuluçka için karıştırma ile iki mililitre lysing çözeltisi ekleyin. Santrifüj ile lysed hücreleri toplamak ve pelet rahatsız etmeden, her tüpte supernatant son 50 mikrolitre hariç tüm atın. Kalan süpernatantpelet yeniden askıya, nazik karıştırma ile, ve her örnek için taze yıkama tampon iki mililitre ekleyin.
İkinci yıkamadan sonra, her tüpte peleti bozmadan yaklaşık 50 mikrolitre kalıntı hacmi bırakarak süpernatantı atın. Hemen analiz için, karıştırma ile PBS 200 mikrolitre pelet yeniden askıya. Akış sitometresindeki örnekleri okumak için, önce akış sitometre yazılımında yeni bir deneme açın ve denemeyi ada, örnek türüne ve tarihe göre yeniden adlandırın.
Üç tüp için yeni bir örnek oluşturun ve deneme düzeninde her tüpte kullanılan antikorları belirtin. Aylık kurulumda elde edilen değerleri uygulamak için sitometre ayarlarını açın ve uygulama ayarlarını seçin. Yeni bir küresel çalışma sayfası açın ve tek lisit hücrelerinin yanı sıra granülosit, monosit, patlama ve lenfosit popülasyonları için uygun nokta çizimlerini oluşturun.
Telafi denetimleri için yeni bir genel çalışma sayfası oluşturun. Daha sonra, her tüpten 500,000 olay elde edin, orta satın alma oranında, verileri teknik doğrulamalarından sonra fcs 3.0 dosyaları olarak dışa aktarın. Yeni bir analize başlamadan önce, nötrofil, monositik ve çekirdekli kırmızı soylar için normal kemik iliği verilerini içeren cyt dosyalarını ve analiz dosyalarını inp formatında indirin.
Ardından, verileri masaüstünüze kaydedin. Nötrofil olgunlaşmasını veri tabanına kaydetmek için önce Infinicyt yazılımını açın ve ardından nötrofil olgunlaşma verilerine karşılık gelen cyt dosyasını açın. APS grafiğindeki olgunlaşma yolunu çizin ve nötrofilin olgunlaşma yolunu veritabanına kaydedin.
Analiz edilmesi gereken nötrofil soy olgunlaşması için fcs dosyasını açın. Profiller sekmesinden nötrofil olgunlaşma inp dosyasını yükleyin. Bu soy için analiz üç adıma ayrılmıştır.
CD34 pozitif, nötrofil kararlı patlamalar seçimi ile başlayın. Bu amaçla, CD34 pozitif, CD117 pozitif, HLADR düşük, CD10 negatif, CD13 pozitif, CD11 b-negatif olayların seçimine izin vermek için yedi kapının kesişme sini kullanın. CD117 pozitif, CD34 negatif nötrofil öncüllerinin seçimi ile analize devam edin.
Daha olgun nötrofil hücrelerinin seçimi ile analize devam edin. Sonra, monositik soy hücrelerinin analizini gösterin. APS grafiğindeki olgunlaşma yolunu çizin.
Olgunlaşma duygusunu gösteren okun olgunlaşmamış, monositik hücrelerden CD14 negatif, IREM2 negatif, olgun monositler, CD14 pozitif, IREM2 pozitif edoğru olduğunu doğrulayın. Olgunlaşma yolunu monositik soy için veritabanına kaydedin. Analiz edilmesi gereken monositik soy olgunlaşması için fcs dosyasını açın.
Monositik soy analizi için profili yükleyin. Monositik soy hücrelerini tanımlamak için, CD64 pozitif yüksek, CD117 pozitif, CD117 negatif, HLADR pozitif olayların seçimine izin veren dört kapının kesişimini kullanın. Bu olayları nüfus hiyerarşisi ağacındaki monositik sekmeye atayın.
NRC veritabanına kaydedilmesi gereken NRC cyt dosyasını açın. APS grafiğindeki olgunlaşma yolunu çizin ve çekirdekli kırmızı hücrelerin olgunlaşma yolunu veritabanına kaydedin. Analiz edilmesi gereken fcs dosyasını açın.
Profillerden çekirdekli kırmızı hücreler için analiz şablonu yükleyin. Bu soy için çözümleme iki adıma ayrılmıştır. CD34 pozitif seçimi ile başlayarak, eritroid patlamalar taahhüt etti.
Burada, CD34 pozitif, CD117 pozitif, HLADR düşük, CD105 pozitif, CD33 negatif, CD36 pozitif, CD71 pozitif olayların seçimine izin vermek için yedi kapının kesişimini kullanın. Bu olayları nüfus hiyerarşisindeki NRK sekmesine atayın. CD34 pozitif eritroid taahhüt patlamaları görünürlükten çıkarın.
Daha olgun eritroid hücreleri tanımlamak için, CD45 negatif ve CD45 pozitif düşük, yan dağılım düşük, CD36 pozitif yüksek ve CD71 pozitif yüksek ayrımcılık sağlayan dört kapı bir kesişme kullanın. Ardından, CD36 yüksek yan dağılım düşük trombositlerini çekirdekli kırmızı hücrelerden çıkarın ve bu popülasyonu NRK sekmesine atayın. Kemik iliği bölmesindeki miyeloid olgunlaşmayı değerlendirmek için, değerlendirilmesi gereken davadan alınan ilgi soyundan gelen sit dosyasını açın.
Yalnızca nüfus hiyerarşisi ağacında nötrofil sekmesine atanan olayları görünür tutun. APS grafiğindeki olgunlaşma yolunu çizin ve nötrofilin normal kemik iliğindeki olgunlaşmasına karşılık gelen veritabanını yükleyin ve verileri karşılaştırın. Veriler en azından kısmen uyumluysa, yazılım olgunlaşma farklılıklarını görselleştirmek için normalleştirilmiş bir olgunlaşma farkları diyagramı ve bir parametre bandı oluşturur.
Kemik iliği bölmesi monosit olgunlaşma karşılaştırmak için, monositveritabanı da dahil olmak üzere normal kemik iliği verileri ile yeni bir durumda, monositik hücre soyu karşılık gelen sit dosyasını açın. Yalnızca popülasyonlar hiyerarşisi ağacında monositler sekmesine atanan olayları görünür tutun ve APS grafiğinde olgunlaşma yolunu çizin. Normal kemik iliklerinde monosit olgunlaşmasına karşılık gelen veritabanını yükleyin ve verileri karşılaştırın.
Kemik iliği bölmesi çekirdekli kırmızı hücrelerin olgunlaşmakarşılaştırmak için, yeni bir durumda, normal kemik ilikleri verileri ile, NRC veritabanında dahil, NRC soyundan karşılık gelen sit dosyasını açın. Yalnızca nüfus hiyerarşisi ağacında NRK sekmesine atanan olayları görünür tutun. Ve APS grafiğindeki olgunlaşma yolunu çizin.
Normal kemik iliklerinde NRC olgunlaşmasına karşılık gelen veritabanını yükleyin ve verileri karşılaştırın. Ardından, yeni dosya ile veritabanında bulunan veriler arasındaki farkların önemini görselleştirmek için normalleştirilmiş olgunlaşma farklarını tıklatın ve yakınlaştırın. Akış sitometrik veri analizinde hiyerarşik sınıflandırma algoritmalarını kullanan yöntemlerin son derece öznel ve doğal olarak yanlış olduğunu unutmayın, çünkü hücre popülasyonu çakışması için sayılmazlar.
Miyeloid normal olgunlaşma veritabanlarına karşı MDS olduğundan şüphelenilen yeni sitopeni olgularının değerlendirilmesi, sitolojik veya sitojenik anormallikleri olmayan olgularda bile nötrofil, monosit ve NRC soylarının anormal ifade edilmiş olgunlaşma antijenlerinin belirlenmesine olanak sağlar. Bu yordamı denerken, akış sitometrik verileri standart bir şekilde elde etmeyi, aylık sitometre ayarını, günlük kontrolleri, kullanmadan önce antikorları titizlikle pipetleme yi ve boyama sürelerine saygı göstermeyi unutmamak önemlidir. Bu yordamı takiben, pusula gibi başka bir yöntem, farklı olgu grubunu karşılaştırmak ve belirli bir vaka grubu için son tipobik künyenin ne olduğu gibi ek sorulara yanıt vermek için gerçekleştirilebilir.
Bu teknik, geliştirildikten sonra, displastik süreçle güvenilir bir şekilde ilişkili son typic değişiklikleri belirlemek için belirsiz potansiyelklonal hematopoezis durumlarında, miyeloid hücre olgunlaşma desenleri keşfetmek isteyen araştırmacılar için yol açtı. Veritabanını sağlıklı bağışçılardan gelen veri sayısıyla güncellemenin analizin sağlamlığını artırabileceğini lütfen unutmayın.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, miyelodisplastik sendromların (MDS) tanı sürecini geliştirmek için çok parametreli akış sitometrisinin (MFC) kullanımını tartışmaktadır. Klinik uygulamalar için MFC analizinde özgüllüğün ve duyarlılığın önemini vurgulamaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hematoloji
- Miyeloid hastalıklar
- Tanı teknikleri
Arka Plan
- Morfolojik kriterler olmadan MDS tanısı koymak zordur.
- Bilgi vermeyen sitogenetik bulgular tanı sürecini karmaşıklaştırır.
- MFC, MDS tanı sürecini potansiyel olarak iyileştirebilir.
- Operatörler arasındaki verilerin tekrarlanabilirliği kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Amacı
- Miyeloid hastalıkların tanısında MFC'nin etkinliğini değerlendirmek.
- Miyelodisplazi için en ayırt edici parametreleri belirlemek.
- Analiz ve yorumlamadaki sübjektifliği azaltmak.
Kullanılan Yöntemler
- Primer hücre örneklerinin yıkama tamponu ile karıştırılması.
- Örnek hazırlama için santrifüj işlemlerinin gerçekleştirilmesi.
- Normal myeloid hücre popülasyonlarından olan farklılıkların nicelendirilmesi.
- Prosedürün bir doktora sonrası araştırmacı tarafından gösterilmesi.
Temel Sonuçlar
- MFC, miyeloid hücre popülasyonu farklılıklarına ilişkin bilgiler sağlar.
- Bu teknik, araştırmacı öznelliğini azaltır.
- Ayırt edici parametrelerin nicelleştirilmesine olanak tanır.
- Klinik fayda için veri tekrarlanabilirliği vurgulanmaktadır.
Sonuçlar
- MFC, MDS için tanısal doğruluğu artırabilir.
- Spesifite ve sensitivite klinik uygulama için hayati önem taşır.
- Yaygın klinik kullanım için daha fazla validasyon gereklidir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Miyeloid maturasyon için standartlaştırılmış akış sitometrisi veritabanları, hematolojik displazinin objektif ve kantitatif değerlendirmesine olanak tanıyarak tanısal yorumlamadaki araştırmacı öznelliğini azaltır. Bu yaklaşım, sağlıklı donör baz hatlarından fenotipik sapmaları belirleyerek miyelodisplastik sendromların erken tespitini destekler ve preklinik ile translasyonel hematoloji araştırmalarında tanısal güveni artırır. Bu yöntem, miyeloid malignitelere yönelik ilaç keşif süreçlerinde biyobelirteç validasyonu ve analiz transferi için kritik bir faktör olan laboratuvarlar arası tekrarlanabilirliği kolaylaştırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Hücre olgunlaşma profillerinin yerleşik normal bazal değerlerle kantitatif karşılaştırması aracılığıyla miyeloid diferansiyasyon yollarının incelenmesine olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Akış sitometrik kapılama ve yorumlamadaki öznelliği minimize ederek hedef doğrulama çalışmalarındaki analitik değişkenliği azaltır.
- Öngörücü Değer: Hematopoetik bozuklukların preklinik modellerinde erken olgunlaşma kusurlarını tanımlayarak mekanistik risk azaltmaya destek olur.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Tarama kampanyaları boyunca tutarlı fenotipik sonuçlar elde etmek amacıyla, soy hattına özgü maturasyon veri tabanlarını kullanarak analiz standardizasyonu için bir çerçeve sunar.
- Operasyonel Değer: Miyeloid diferansiyasyonu üzerindeki bileşik etkilerinin değerlendirilmesi için güçlü kantitatif çıktılar sağlayarak hit-to-lead (hit'ten öncü bileşiğe) ilerlemesini destekler.
- Analiz Hazırlığı: Normalize edilmiş maturasyon yörüngeleri oluşturarak, alt uygulamalar için valide edilmiş biyolojik sistemlerin hazırlanmasını kolaylaştırır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Deneysel modellerin sağlıklı insan miyeloid maturasyon referanslarıyla doğrudan karşılaştırılmasına olanak tanıyarak keşif ve preklinik aşamalar arasında köprü kurar.
- Biyobelirteç Uyumu: Miyeloid hastalık modellerinde translasyonel biyobelirteçler olarak hizmet edebilecek soy hattına özgü fenotipik anomalilerin tanımlanmasını destekler.
- Riske Göre Ayarlanmış İlerleme: Preklinik etkinlik çalışmalarında, maturasyon sapma eşiklerine (örneğin normalden 2SD) dayalı, veri odaklı ilerleme/durdurma (go/no-go) kararları alınmasını sağlar.
İş Akışı ve Boru Hattı Entegrasyonu
Bu yöntem, miyeloid hedefli terapötikler için hedef doğrulaması, assay geliştirme ve preklinik model kalifikasyonuna temel teşkil eden standartlaştırılmış fenotipik okumalar sağlayarak keşif iş akışına entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: Veritabanı referanslı, objektif olgunlaşma analizi yoluyla miyeloid farklılaşma yollarının hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Bileşik kaynaklı fenotipik değişiklikleri, belirlenmiş normal olgunlaşma baz çizgilerine sabitleyerek assay standardizasyonunu ve tekrarlanabilirliğini sağlar.
- Analitik: Deneysel koşulların sağlıklı donör verileriyle istatistiksel karşılaştırmasına olanak tanıyan kantitatif olgunlaşma farkı diyagramları ve parametre bantları oluşturur.
- Translasyonel Araştırma: In vitro veya in vivo bulguları insanla ilgili miyeloid olgunlaşma standartlarıyla ilişkilendirerek preklinikten kliniğe geçişi destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla proje ve merkezde tutarlı miyeloid olgunlaşma değerlendirmesi için yeniden kullanılabilir bir analitik çerçeve oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Miyeloid farklılaşma değerlendirmelerindeki mekanistik belirsizliği azaltarak hedef doğrulamadaki öngörü güvenilirliğini artırır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış veri tabanı odaklı analiz yoluyla akış sitometrisi assaylerinin tekrarlanabilirliğini ve ölçeklenebilirliğini geliştirir.
- Stratejik Değer: Preklinik modellerde miyeloid displazi riskinin objektif ve kantitatif değerlendirmesine olanak tanıyarak portföy karar alma süreçlerini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Bileşiklerin miyeloid maturasyon seyirleri üzerindeki etkilerine dayalı olarak, riske göre ayarlanmış önceliklendirmeyi destekler.
Uygulama Hususları
- Miyeloid soy tanımlaması için çok parametreli akış sitometrisi ve hematolojik belirteç panelleri konusunda uzmanlık gerektirir.
- Tekrarlanabilir veri edinimi için valide edilmiş antikor panellerine ve standardize edilmiş cihaz kurulum protokollerine erişime bağlıdır.
- Veri tabanı karşılaştırılabilirliğini sağlamak için numune hazırlama, boyama ve edinim protokollerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Yöntemin insan dışı model sistemlere veya alternatif maturasyon belirteçlerine uygulanması durumunda adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- Özellikle hibridoma teknolojilerinden türetilenlerin antikor performansındaki laboratuvarlar arası değişkenliklerle sınırlıdır ve bu durum veri harmonizasyonunu etkileyebilir.
