Veritabanı güdümlü akışı-sitometresi kemik iliği Myeloid hücre olgunlaşma değerlendirilmesi için
November 3rd, 2018
MDS tanı morfolojik ölçüt veya bilgilendirici sitogenetik yokluğunda zordur. MFC MDS tanı sürecinin rafine yardımcı olabilir. Klinik uygulamalar için faydalı olmak için MFC analiz parametreleri üzerinde yeterli özgüllük ve duyarlılık ile esas almalıdır ve veri arasında farklı operatör tekrarlanabilir olmalıdır.
Bu yöntem miyelodisplazi sendromları veya miyeloid hücre soylarında olgunlaşma anormallikleri ile gelişen diğer hematolojik hastalıklar gibi miyeloid hastalıkların tanısında anahtar soruların cevaplanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, bu analiz ve yorumlamada araştırmacının öznelliğini azaltmasIdır. Bu yöntem, miyelodisplazi için en ayrımcı parametrelerin hangileri olduğunu anlamalarını sağlayabilir.
Normal miyeloid hücre popülasyonlarından farklılıkların ölçülmesine izin verir. Prosedürü gösteren Tiphanie Picot, bizim laboratuvardan doktora sonrası bir adam olacaktır. Birincil hücre örneğinin 600 mikrolitresini, 15 mililitrelik konik bir tüpte 10 mililitre yıkama tamponu yla iki santrifüj ve yıkama başına 10 mililitre taze yıkama tamponu ile karıştırarak başlayın.
İkinci yıkamadan sonra, peleti 400 mikrolitre taze yıkama tamponu yla yeniden askıya alın ve hücre süspansiyonunun 350 mikrolitresini omurga antikorlarının tüm panelini içeren beş mililitrelik polipropilen FACS tüpüne aktarın. Hücreleri iyice karıştırdıktan sonra, pipet hücre antikor çözeltisinin hacimleri üç yeni polipropilen tüplere eşit hacimlerde ve gerektiğinde taze yıkama tamponu ile 200 mikrolitreye kadar her tüpteki son hacmi getirir. Daha sonra, ışıktan korunan oda sıcaklığında 30 dakikalık bir kuluçka için, karıştırma ile ilgi hücre yüzeyi belirteçleri karşı antikorların uygun hacmi ekleyin.
Kuluçka sonunda, ışıktan korunan oda sıcaklığında 10 dakikalık bir kuluçka için karıştırma ile iki mililitre lysing çözeltisi ekleyin. Santrifüj ile lysed hücreleri toplamak ve pelet rahatsız etmeden, her tüpte supernatant son 50 mikrolitre hariç tüm atın. Kalan süpernatantpelet yeniden askıya, nazik karıştırma ile, ve her örnek için taze yıkama tampon iki mililitre ekleyin.
İkinci yıkamadan sonra, her tüpte peleti bozmadan yaklaşık 50 mikrolitre kalıntı hacmi bırakarak süpernatantı atın. Hemen analiz için, karıştırma ile PBS 200 mikrolitre pelet yeniden askıya. Akış sitometresindeki örnekleri okumak için, önce akış sitometre yazılımında yeni bir deneme açın ve denemeyi ada, örnek türüne ve tarihe göre yeniden adlandırın.
Üç tüp için yeni bir örnek oluşturun ve deneme düzeninde her tüpte kullanılan antikorları belirtin. Aylık kurulumda elde edilen değerleri uygulamak için sitometre ayarlarını açın ve uygulama ayarlarını seçin. Yeni bir küresel çalışma sayfası açın ve tek lisit hücrelerinin yanı sıra granülosit, monosit, patlama ve lenfosit popülasyonları için uygun nokta çizimlerini oluşturun.
Telafi denetimleri için yeni bir genel çalışma sayfası oluşturun. Daha sonra, her tüpten 500,000 olay elde edin, orta satın alma oranında, verileri teknik doğrulamalarından sonra fcs 3.0 dosyaları olarak dışa aktarın. Yeni bir analize başlamadan önce, nötrofil, monositik ve çekirdekli kırmızı soylar için normal kemik iliği verilerini içeren cyt dosyalarını ve analiz dosyalarını inp formatında indirin.
Ardından, verileri masaüstünüze kaydedin. Nötrofil olgunlaşmasını veri tabanına kaydetmek için önce Infinicyt yazılımını açın ve ardından nötrofil olgunlaşma verilerine karşılık gelen cyt dosyasını açın. APS grafiğindeki olgunlaşma yolunu çizin ve nötrofilin olgunlaşma yolunu veritabanına kaydedin.
Analiz edilmesi gereken nötrofil soy olgunlaşması için fcs dosyasını açın. Profiller sekmesinden nötrofil olgunlaşma inp dosyasını yükleyin. Bu soy için analiz üç adıma ayrılmıştır.
CD34 pozitif, nötrofil kararlı patlamalar seçimi ile başlayın. Bu amaçla, CD34 pozitif, CD117 pozitif, HLADR düşük, CD10 negatif, CD13 pozitif, CD11 b-negatif olayların seçimine izin vermek için yedi kapının kesişme sini kullanın. CD117 pozitif, CD34 negatif nötrofil öncüllerinin seçimi ile analize devam edin.
Daha olgun nötrofil hücrelerinin seçimi ile analize devam edin. Sonra, monositik soy hücrelerinin analizini gösterin. APS grafiğindeki olgunlaşma yolunu çizin.
Olgunlaşma duygusunu gösteren okun olgunlaşmamış, monositik hücrelerden CD14 negatif, IREM2 negatif, olgun monositler, CD14 pozitif, IREM2 pozitif edoğru olduğunu doğrulayın. Olgunlaşma yolunu monositik soy için veritabanına kaydedin. Analiz edilmesi gereken monositik soy olgunlaşması için fcs dosyasını açın.
Monositik soy analizi için profili yükleyin. Monositik soy hücrelerini tanımlamak için, CD64 pozitif yüksek, CD117 pozitif, CD117 negatif, HLADR pozitif olayların seçimine izin veren dört kapının kesişimini kullanın. Bu olayları nüfus hiyerarşisi ağacındaki monositik sekmeye atayın.
NRC veritabanına kaydedilmesi gereken NRC cyt dosyasını açın. APS grafiğindeki olgunlaşma yolunu çizin ve çekirdekli kırmızı hücrelerin olgunlaşma yolunu veritabanına kaydedin. Analiz edilmesi gereken fcs dosyasını açın.
Profillerden çekirdekli kırmızı hücreler için analiz şablonu yükleyin. Bu soy için çözümleme iki adıma ayrılmıştır. CD34 pozitif seçimi ile başlayarak, eritroid patlamalar taahhüt etti.
Burada, CD34 pozitif, CD117 pozitif, HLADR düşük, CD105 pozitif, CD33 negatif, CD36 pozitif, CD71 pozitif olayların seçimine izin vermek için yedi kapının kesişimini kullanın. Bu olayları nüfus hiyerarşisindeki NRK sekmesine atayın. CD34 pozitif eritroid taahhüt patlamaları görünürlükten çıkarın.
Daha olgun eritroid hücreleri tanımlamak için, CD45 negatif ve CD45 pozitif düşük, yan dağılım düşük, CD36 pozitif yüksek ve CD71 pozitif yüksek ayrımcılık sağlayan dört kapı bir kesişme kullanın. Ardından, CD36 yüksek yan dağılım düşük trombositlerini çekirdekli kırmızı hücrelerden çıkarın ve bu popülasyonu NRK sekmesine atayın. Kemik iliği bölmesindeki miyeloid olgunlaşmayı değerlendirmek için, değerlendirilmesi gereken davadan alınan ilgi soyundan gelen sit dosyasını açın.
Yalnızca nüfus hiyerarşisi ağacında nötrofil sekmesine atanan olayları görünür tutun. APS grafiğindeki olgunlaşma yolunu çizin ve nötrofilin normal kemik iliğindeki olgunlaşmasına karşılık gelen veritabanını yükleyin ve verileri karşılaştırın. Veriler en azından kısmen uyumluysa, yazılım olgunlaşma farklılıklarını görselleştirmek için normalleştirilmiş bir olgunlaşma farkları diyagramı ve bir parametre bandı oluşturur.
Kemik iliği bölmesi monosit olgunlaşma karşılaştırmak için, monositveritabanı da dahil olmak üzere normal kemik iliği verileri ile yeni bir durumda, monositik hücre soyu karşılık gelen sit dosyasını açın. Yalnızca popülasyonlar hiyerarşisi ağacında monositler sekmesine atanan olayları görünür tutun ve APS grafiğinde olgunlaşma yolunu çizin. Normal kemik iliklerinde monosit olgunlaşmasına karşılık gelen veritabanını yükleyin ve verileri karşılaştırın.
Kemik iliği bölmesi çekirdekli kırmızı hücrelerin olgunlaşmakarşılaştırmak için, yeni bir durumda, normal kemik ilikleri verileri ile, NRC veritabanında dahil, NRC soyundan karşılık gelen sit dosyasını açın. Yalnızca nüfus hiyerarşisi ağacında NRK sekmesine atanan olayları görünür tutun. Ve APS grafiğindeki olgunlaşma yolunu çizin.
Normal kemik iliklerinde NRC olgunlaşmasına karşılık gelen veritabanını yükleyin ve verileri karşılaştırın. Ardından, yeni dosya ile veritabanında bulunan veriler arasındaki farkların önemini görselleştirmek için normalleştirilmiş olgunlaşma farklarını tıklatın ve yakınlaştırın. Akış sitometrik veri analizinde hiyerarşik sınıflandırma algoritmalarını kullanan yöntemlerin son derece öznel ve doğal olarak yanlış olduğunu unutmayın, çünkü hücre popülasyonu çakışması için sayılmazlar.
Miyeloid normal olgunlaşma veritabanlarına karşı MDS olduğundan şüphelenilen yeni sitopeni olgularının değerlendirilmesi, sitolojik veya sitojenik anormallikleri olmayan olgularda bile nötrofil, monosit ve NRC soylarının anormal ifade edilmiş olgunlaşma antijenlerinin belirlenmesine olanak sağlar. Bu yordamı denerken, akış sitometrik verileri standart bir şekilde elde etmeyi, aylık sitometre ayarını, günlük kontrolleri, kullanmadan önce antikorları titizlikle pipetleme yi ve boyama sürelerine saygı göstermeyi unutmamak önemlidir. Bu yordamı takiben, pusula gibi başka bir yöntem, farklı olgu grubunu karşılaştırmak ve belirli bir vaka grubu için son tipobik künyenin ne olduğu gibi ek sorulara yanıt vermek için gerçekleştirilebilir.
Bu teknik, geliştirildikten sonra, displastik süreçle güvenilir bir şekilde ilişkili son typic değişiklikleri belirlemek için belirsiz potansiyelklonal hematopoezis durumlarında, miyeloid hücre olgunlaşma desenleri keşfetmek isteyen araştırmacılar için yol açtı. Veritabanını sağlıklı bağışçılardan gelen veri sayısıyla güncellemenin analizin sağlamlığını artırabileceğini lütfen unutmayın.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, miyelodisplastik sendromların (MDS) teşhis sürecini geliştirmek için çok parametreli akış sitometrisinin (MFC) kullanımını ele almaktadır. Klinik uygulamalar için MFC analizinin özgüllük ve hassasiyetinin önemini vurgulamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hematoloji
- Miyeloid hastalıklar
- Teşhis teknikleri
Arka Plan
- MDS tanısı morfolojik kriterler olmadan zordur.
- Bilgisayarlı sitogenetik verilerin bilgi verici olmaması teşhis sürecini karmaşıklaştırır.
- MFC potansiyel olarak MDS tanı sürecini rafine edebilir.
- Verilerin operatörler arasındaki tekrarlanabilirliği kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Amacı
- Miyeloid hastalıkların teşhisinde MFC'nin etkinliğini değerlendirmek.
- Miyelodizis için en ayrımcı parametreleri belirlemek.
- Analizlerde ve yorumlamada öznelliği azaltmak.
Kullanılan Yöntemler
- Birincil hücre örneklerini yıkama tamponu ile karıştırmak.
- Numune hazırlığı için santrifüjlemeler yapmak.
- Normal miyeloyd hücre popülasyonlarından farklılıkları kantifiye etmek.
- Yöntemi doktora sonrası bir araştırmacı tarafından göstermek.
Ana Sonuçlar
- MFC, miyeloyd hücre popülasyonlarındaki farklılıklar hakkında bilgiler sağlar.
- Teknik, araştırmacıların öznelliğini azaltır.
- Ayrımcılık parametrelerinin kantifiye edilmesini sağlar.
- Verilerin tekrarlanabilirliği klinik yararlılık için vurgulanmaktadır.
Sonuçlar
- MFC, MDS için teşhis doğruluğunu artırabilir.
- Özgüllüğü ve hassasiyet klinik uygulama için hayati öneme sahiptir.
- Yaygın klinik kullanım için daha fazla doğrulama gerekmektedir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Standardized flow cytometry databases for myeloid maturation enable objective, quantitative assessment of hematologic dysplasia, reducing investigator subjectivity in diagnostic interpretation. This approach supports early detection of myelodysplastic syndromes by identifying phenotypic deviations from healthy donor baselines, enhancing diagnostic confidence in preclinical and translational hematology research. The method facilitates cross-laboratory reproducibility, a critical factor for biomarker validation and assay transfer in drug discovery pipelines targeting myeloid malignancies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of myeloid differentiation pathways through quantitative comparison of cell maturation profiles against established normal baselines.
- Operational Value: Reduces analytical variability in target validation studies by minimizing subjectivity in flow cytometric gating and interpretation.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by identifying early maturation defects in preclinical models of hematopoietic disorders.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a framework for assay standardization using lineage-specific maturation databases to ensure consistent phenotypic readouts across screening campaigns.
- Operational Value: Enables robust quantitative outputs for compound effect assessment on myeloid differentiation, supporting hit-to-lead progression.
- Assay Readiness: Facilitates preparation of validated biological systems for downstream applications by establishing normalized maturation trajectories.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical stages by allowing direct comparison of experimental models to healthy human myeloid maturation benchmarks.
- Biomarker Alignment: Supports identification of lineage-specific phenotypic abnormalities that may serve as translational biomarkers in myeloid disease models.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables data-driven go/no-go decisions based on maturation deviation thresholds (e.g., 2SD from normal) in preclinical efficacy studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery workflow by providing standardized phenotypic readouts that inform target validation, assay development, and preclinical model qualification for myeloid-targeted therapeutics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of myeloid differentiation pathways through objective, database-referenced maturation analysis.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility by anchoring compound-induced phenotypic changes to established normal maturation baselines.
- Analytics: Generates quantitative maturation difference diagrams and parameter bands that allow statistical comparison of experimental conditions against healthy donor data.
- Translational Research: Connects in vitro or in vivo findings to human-relevant myeloid maturation standards, supporting preclinical-to-clinical translation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable analytical framework for consistent myeloid maturation assessment across multiple projects and sites.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in myeloid differentiation assessments.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability of flow cytometry assays through standardized database-driven analysis.
- Strategic Value: Improves portfolio decision-making by enabling objective, quantitative evaluation of myeloid dysplasia risk in preclinical models.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds based on their effects on myeloid maturation trajectories.
Implementation Considerations
- Requires expertise in multiparameter flow cytometry and hematologic marker panels for myeloid lineage identification.
- Depends on access to validated antibody panels and standardized instrument setup protocols for reproducible data acquisition.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation, staining, and acquisition protocols to ensure database comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the method to non-human model systems or alternative maturation markers.
- Limited by inter-laboratory variability in antibody performance, particularly those derived from hybridoma technologies, which may affect data harmonization.
