Name: Vivo Microdialysis beyin interstisyel sıvı yüksek moleküler ağırlık kesme ile gelen büyük hücre dışı proteinler toplamak için yöntem probları (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Öğrenin in vivo mikrodiyaliz yöntemiyle yüksek moleküler ağırlık kesmeli problar kullanarak uyanık ve serbest hareket eden hayvanlardan beyin interstisyel sıvısındaki büyük hücre dışı proteinleri toplama tekniğini.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser tarafından desteklenen '' Grant-in-Aid bilimsel araştırma yenilikçi alanlarda (Beyin Protein eskime ve demans Control)(15H01552) MEXT ve Grant-in-Aid için genç bilim adamları (B) (16K 20969). Yazar Dr David M. Holtzman ve Dr. John R. Cirrito bu yöntem geliştirme sırasında teknik tavsiye için teşekkürler.

Tüm hayvan çalışmaları gözden geçirilmiş ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi lisansüstü Tıp Fakültesi Tokyo Üniversitesi tarafından onaylanmış.
1. önceden cerrahi müdahale
<ol><li>Ameliyat başlamadan önce Steril koşullar korumak için % 70 etanol ile her şeyi silin. Bir ısıtma yastığı kullanan termal desteği önerilir.</li>
	<li>Fareler kloral hidrat (400 mg/kg) mayi enjeksiyonu ile anestezi. Anesthetization bir ayak çimdik gerçekleştirerek onaylayın. Meloksikam SR indüksiyon ve kurtarma teklifi üzerine buprenorfin kullanımı en az 24 saat için önerilir.</li>
	<li>Cerrahi bir kesme makinesi ile saç tıraş. Bir fare fare ve neonatal sıçan adaptör kulak çubukları ve burun kıskacı kullanma düzeltmek. Not: Bu fare kafa bu aşamada sabitlenir ve yan yana hareket etmeyen emin olmak önemlidir.</li>
	<li>Veteriner merhem gözleri kuruluk anestezi iken altında önlemek için uygulayın.</li>
</ol>2. stereotaksik cerrahi Kılavuzu kanül implantasyon için
<ol><li>Fare ve neonatal sıçan adaptör stereotaksik cihazları üzerinde ayarlayın. Bir kesik sagittally neşter kullanarak kafatası üzerinde cilt üzerinde yapmak.　Kan ve nemli pamuk bez kullanarak kafatasındaki bağ dokusu yok etmek.</li>
	<li>Beyin bölgesi beyin atlas kullanarak ilgi için koordinat belirleme. Ölçümler başlamadan önce böylece matkap olabilir o orta hat düz olduğundan emin olun A-P taşındı ve orta hat dikiş süre boyunca kalır. Not: Bu makale koordinat kullanır (A / P:-3.1 mm, M/L:-2.5 mm, D/V:-1.2 mm, 12 derece) posterior hipokampus hedeflemek için.</li>
	<li>Level kafatasını A-P<ol>
<li>Bir manipülatör stereotaksik çerçeve üzerinde bir tatbikat iliştirin. Lambda hafifçe dokunana dek matkap indirin ve onun ventral koordinat kaydedin. Bregma için bu yordamı yineleyin. Not: kafatası fırlattı, bregma dikey ölçüm lambda eşit olur. Aksi takdirde, burun kıskacı yüksekliğini buna göre ayarlayın. Kafatası tesviye sonra bregma ön/arka, lateral koordinatı kaydedin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Düzey kafatası-sol<ol>
<li>Matkap bregma taşımak için koordinat (A / P:-3.1 mm, M/l + 2.0 mm), kafatası matkabı daha düşük ve Dikey koordinatı kaydetmek. Koordinat için bu yordamı yineleyin (A / P:-3.1 mm, M/l-2,0 mm). Not: Bu dikey ölçümleri midline iki eşit uzaklıkta puan kafatası fırlattı, eşittir. Eğer değilse, kulak çubuklarının yüksekliğini ayarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Burr hedef koordinat dikkatle Hole'da matkap (A / P:-3.1 mm, M/L:-2.5 mm) Kılavuzu kanül implant. Burr deliği çapını Kılavuzu kanül implantasyon için yeterince büyük değilse, ilki ile örtüşen başka bir delik. Başka bir delik sağ (kontralateral yan) paryetal kemikte ve 1,10 (bkz: Şekil 1B) diş betona güvenliğini sağlamak için yardımcı olur kemik vidası ekleyin.</li>
	<li>Bir tıraş bıçağı tarafından 1.5 mL santrifüj tüpü kapağı arka taraftan dairesel bir kilitleme parça kesme ve bir '' taç '' olun. Bu taç diş çimento cilde yayılmasını önlemek için kullanılır. 2.5. adımda yapılan burr deliği (bkz: Şekil 1) Daire içinde kalmak böylece kafatasında yer.</li>
	<li>Stereotaksik adaptör kısa kolunda bir Kılavuzu kanül koyarak stereotaksik bir derleme ayarlayın ve bir kap fındık kullanarak bağlayın. Stereotaksik adaptör uzun kol elektrot kelepçe üzerinde ayarlayın. (Bkz: Şekil 1A) stereotaksik aparatı manipülatör üzerinde ekleyin.</li>
	<li>D-V stereotax derleme manipülatör kolundaki 12 derece (bkz: Şekil 1B) döndürür. Kılavuzu kanül 1,6 olarak yapılan burr deliği için hareket ettirin. Kılavuzu kanül 1,2 mm tarafından düşürerek beynin içine yavaş yavaş ekleyin. Not: Prob açısı hipokampus için özeldir; diğer bölgeler diğer açıları veya hiçbir açı hiç gerektirebilir. Bir beyin atlas kesin koordinatları için başvurun. Kafatası yüzeyini kuru çünkü değil çimento sopa olacak ve çimento kapağı yerinden olmak</li>
	<li>Tam kılavuzu kanül ve onları korumak için yeterli kemik vidası her iki metal parçası kapsayacak şekilde taç içinde diş çimento ekleyin. Maruz Kafatası parçası ise ek diş çimento uygulanır.</li>
	<li>Diş çimento tamamen kurumuş kadar bekleyin (~ 12-20 dk). Stereotaksik adaptörü elektrot kelepçe çıkarın. Cap somun kaldırmak ve stereotaksik adaptör kukla bir sonda ile değiştirin ve kap somun tutturmak.</li>
	<li>Stereotaksik gelen fare düğmesini bırakın ve bireysel bir kafeste tek başına fare evi. Not: sternal recumbency korumak için yeterli kendine geldi kadar fareyi katılımsız bırakılmamalıdır. Fare her gün microdialysis gün kadar kontrol edin. O acı içinde görünüyorsa fare NSAİİ gibi carprofen alır. 2 hafta bekliyor bu yüzden fare için yeni ortam10yerleşir ama çalışmalar diğer türleri daha kısa kurtarma dönemleri (Örneğin, 1-2 gün) gerektirebilir uyku-uyanıklık çalışmaları için gereklidir.</li>
</ol>3. Microdialysis Kur
<ol><li>Kalite-kontrol probları: dolgu distile ayve tek kullanımlık 1ml şırınga byton tüp kullanarak bir sonda çıkış (kısa bağlantı noktası) için izleyin. Havalandırma delikleri parmak ile kapak ve yavaşça sonda su demleyin şırınga pistonu düşürmek. Su--dan sonda giriş görünür ve microdialysis membran yüzeyinde hiçbir sızıntı olduğundan emin olun.<ol>
<li>Probları aktivasyonu: etanol (70-%100) bir soruşturma zarı iki saniyeliğine daldırın. O zaman, distile su sonda yine bir şırınga tekrar süzülür.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Perfüzyon arabellek hazırlanması: yapışma makaronlar için hedef moleküllerin önlemek amacıyla, BSA tarafından eklemek yapay CSF (1.3 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO4, 3 mM KCl, 0.4 mM KH2PO4, 25 mM NaHCO3 ile % %4 30 BSA çözüm sulandrarak , 122 mM NaCl, pH 7,35 =), hangi iyi uyan CSF, kullanmak için hemen önceki elektrolit konsantrasyonu. Bir şırınga filtre ünitesi ile 0,1 µm gözenek boyutu ile perfüzyon arabellek filtre. Not: % 4 BSA proteinler yapışmasını için kurtarma geliştirir ancak ciddi bir şekilde teslim bileşikleri, özellikle yüksek BSA-bağlama var bileşikler için sınırlayabilirsiniz. BSA (%0,15) gibi düşük yoğunluklu belirli örnekleri3kullanmanın bir avantajı bu. Not BSA girdap ya da heyecan plaka heyecanlı zaman çok kolayca toplayabilirsiniz. Bu toplamları probları veya membran gözenekleri yapışmasına neden olabilir. Bu toplama sınırlamak için BSA çözüm hazırlarken dikkatli olun</li>
	<li>Giriş ve çıkış (bkz: Şekil 1 c) için iki ayrı hat hazırlamak ve bir bağlantı iğne ile her iki hattı bağlayın. Perfüzyon arabellek ile dolu bir tek kullanımlık 3 mL şırıngaya doldur ve künt uçlu iğne kullanarak hortumu giriş sonu ile bağlayın. Tüm boru ile perfüzyon arabellek şırınga pompa çalıştırarak doldurun.</li>
	<li>Enjektör pompa durdurmak ve bir harekete geçirmek microdialysis sonda gelen adım 3.3 (bkz: Şekil 1 c) giriş çizgi ile çıkış çizgi arasındaki bağlantı iğne yerine. Bu değiştirme önce sonda üzerinde kap somunu koymuş.</li>
	<li>Çıkış boru silindir pompa üzerinde silindir tüpte bağlayın. Enjektör pompa 10 µL/dk ve daha sonra biraz daha yavaş akış hızı (9,5-9,8 µL/dak), silindir pompa başlatmak. Sonda girdiğinizde kurtarma etkileyebilecek tüm boru içinde tüm hava kabarcıkları kaldırdığınızdan emin olun.</li>
	<li>Adım 1.2 olduğu gibi aynı şekilde adım 1.12 fareden anestezi. Fare yaka boynuna koy. Cap somun ve kukla yoklama kaldırmak ve yavaş yavaş 3.4 Kılavuzu kanül aracılığıyla gelen bir microdialysis sonda Ekle ve kap somun tutturmak.</li>
	<li>Yer içinde belgili tanımlık kafes fare bir ücretsiz taşıma sistemi ve urgan fare yaka ile bağlı. Enjektör pompa ve silindir pompa en az 1 h 3.5. adımda belirtilen akış hızında çalıştırmaya devam. Not: ISF koleksiyonu uyanık hayvanlardan elde etmek için bu makalede bir ücretsiz taşıma sistemi, nereye belgili tanımlık kafes büküm üzerinden makaronlar tutmak için bir hayvanın hareket yanıt verir kullanılmaktadır. Alternatif olarak, sıvı swivels çeşitli şirketler için de kullanılabilir.</li>
	<li>Silindir pompa ilk durağı ve şırınga pompa. İstenen akış hızını ayarlayın. Şırınga pompa %20 silindir pompa daha hızlı koşmak. Not: 1 µL/dk çalıştırırsanız, örneğin, şırınga pompa 1,2 çalıştırmak µL/dak en iyi akış hızı kararlı ampirik olarak her molekül için.</li>
	<li>ISF örnekleri toplama: ücretsiz çıkış boru sonuna buzdolabında kesir toplayıcı yerleştirmek. Not: Uygun numune hacmi deneyleri çözümlemesi için kullanılan bağlı olarak değişir.</li>
	<li>Deneme tamamlanmasından sonra sonda kaldırın. (Fare gerektiği gibi anestezi.)  Fare kurtarma adım 2.11 olduğu gibi işlemek. HPLC veya ELISA gibi yöntemler tarafından toplanan ISF analiz.</li>
	<li>Tüm boru microdialysis sonra yıkamak için giriş bağlayın ve tekrar bağlantı ile sonda değiştirerek çıkış makaronlar iğne ve sulandırılmış çamaşır suyu tüm boru çalıştırmak ve daha sonra su ile yıkayın. Kuru ve tekrar tekrar kullanmak üzere saklamak. Not: Makaronlar diğer türleri kabul edilir, ancak, BSA perfüzyon arabelleği küçük çaplı makaronlar yapışmasına neden olabilir, böylece bu makaronlar tek kullanımlık kabul edilir. Makaronlar yıpranmış ya da birden fazla kullanım sonra tıkanmış yani akış hızı kullanmadan önce her zaman tutarlı olduğundan emin olun.</li>
</ol>

<ol><li>Lei, Y., Han, H., Yuan, F., Javeed, A., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+interstitial+system%3A+Anatomy%2C+modeling%2C+in+vivo+measurement%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">The brain interstitial system: Anatomy, modeling, in vivo measurement, and applications.</a> Progress in Neurobiology. 157, 230-246 (2017).</li>
<li>Kushikata, T., Hirota, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropeptide+microdialysis+in+free-moving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Neuropeptide microdialysis in free-moving animals.</a> Methods in Molecular Biology. 789, 261-269 (2011).</li>
<li>Cirrito, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+assessment+of+brain+interstitial+fluid+with+microdialysis+reveals+plaque-associated+changes+in+amyloid-beta+metabolism+and+half-life%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo assessment of brain interstitial fluid with microdialysis reveals plaque-associated changes in amyloid-beta metabolism and half-life.</a> The Journal of Neuroscience. 23 (26), 8844-8853 (2003).</li>
<li>Emmanouilidou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+%CE%B1-synuclein+secretion+in+mouse+and+human+brain+parenchyma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Assessment of α-synuclein secretion in mouse and human brain parenchyma.</a> PLoS One. 6 (7), 1-9 (2011).</li>
<li>Yamada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+microdialysis+reveals+age-dependent+decrease+of+brain+interstitial+fluid+tau+levels+in+P301S+human+tau+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo microdialysis reveals age-dependent decrease of brain interstitial fluid tau levels in P301S human tau transgenic mice.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (37), 13110-13117 (2011).</li>
<li>Ulrich, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+measurement+of+apolipoprotein+E+from+the+brain+interstitial+fluid+using+microdialysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">In vivo measurement of apolipoprotein E from the brain interstitial fluid using microdialysis.</a> Molecular Neurodegeneration. 8 (1), 13(2013).</li>
<li>Emmanouilidou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+transmission+via+ATP-dependent+K%2B+channels+regulates+%CE%B1-synuclein+secretion+in+mouse+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">GABA transmission via ATP-dependent K+ channels regulates α-synuclein secretion in mouse striatum.</a> Brain. 139 (3), 871-890 (2016).</li>
<li>Takeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seed-competent+high-molecular-weight+tau+species+accumulates+in+the+cerebrospinal+fluid+of+Alzheimer%27s+disease+mouse+model+and+human+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Seed-competent high-molecular-weight tau species accumulates in the cerebrospinal fluid of Alzheimer's disease mouse model and human patients.</a> Annals of Neurology. 80 (3), 355-367 (2016).</li>
<li>Yamada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Microdialysis+of+brain+interstitial+fluid+for+the+determination+of+extracellular+tau+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo Microdialysis of brain interstitial fluid for the determination of extracellular tau levels.</a> Methods in Molecular Biology. 1523, 285-296 (2017).</li>
<li>Kang, J. -E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-%CE%B2+dynamics+are+regulated+by+orexin+and+the+sleep-wake+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Amyloid-β dynamics are regulated by orexin and the sleep-wake cycle.</a> Science. 326 (November), 1005-1008 (2009).</li>
<li>Cirrito, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+activity+regulates+interstitial+fluid+amyloid-beta+levels+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic activity regulates interstitial fluid amyloid-beta levels in vivo.</a> Neuron. 48 (6), 913-922 (2005).</li>
<li>Bero, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+regulates+the+regional+vulnerability+to+amyloid-%CE%B2+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity regulates the regional vulnerability to amyloid-β deposition.</a> Nature Neuroscience. 14 (6), 750-756 (2011).</li>
<li>Yamada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+regulates+extracellular+tau+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity regulates extracellular tau in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (3), 387-393 (2014).</li>
<li>Pooler, A. M., Phillips, E. C., Lau, D. H. W., Noble, W., Hanger, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+release+of+endogenous+tau+is+stimulated+by+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Physiological release of endogenous tau is stimulated by neuronal activity.</a> EMBO Reports. 14 (4), 389-394 (2013).</li>
<li>Castellano, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+apoE+isoforms+differentially+regulate+brain+amyloid-%CE%B2+peptide+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human apoE isoforms differentially regulate brain amyloid-β peptide clearance.</a> Science Translational Medicine. 3 (89), 89ra57(2011).</li>
<li>Yamada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+in+vivo+turnover+of+tau+in+a+mouse+model+of+tauopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Analysis of in vivo turnover of tau in a mouse model of tauopathy.</a> Molecular Neurodegeneration. 10 (1), 55(2015).</li>
<li>Taylor, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+local+and+long-range+neuronal+network+dynamics+by+simultaneous+optogenetics%2C+reverse+microdialysis+and+silicon+probe+recordings+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Investigating local and long-range neuronal network dynamics by simultaneous optogenetics, reverse microdialysis and silicon probe recordings in vivo.</a> Journal of Neuroscience Methods. 235, 83-91 (2014).</li>
</ol>

Yazar ifşa etmek hiçbir şey vardır.

Microdialysis yüksek molekül ağırlıklı membranlar kesim ile bir itme-çekme modu tarafından ameliyat olmak zorunda, böylece akış hızı doğru ve sürekli önemlidir. Yanlışlık içinde akış oranları hava kabarcık üretimi ve örnek konsantrasyon tutarsızlığına neden olabilir. Akış tutarsız ise, sızıntı için tüm bağlantılarını kontrol edin. Sorun hala devam ederse, yeni probları ve Bacalar ile yeniden başlatmak gerekli olabilir.
Microdilaysis sondalar sürekli perfüzyon arabellek tarafından periosteum. B...

ISF toplam beyin hacmi 15-%20 oluşur ve sinyal iletimi, substrat taşıma ve atık temizleme1için kritik bir microenvironment sunmaktadır. Bu nedenle, yaşayan hayvanlardan ISF toplama yeteneği büyük etkileri çeşitli biyolojik süreçlerin yanı sıra hastalığı mekanizması için sağlayacaktır. İn vivo microdialysis birkaç yöntemden birini bu örnek ve serbestçe hareket hayvan hücre dışı molekülleri ISF üzerinden gelen uyanık, ölçmek ve böylece nörolojik araştırma alanı2,3yararlı bir araç olarak hizmet vermektedir. Bu yöntemde, microdialysis sonda semipermeable Membranlar ile beyinde eklenen ve perfüzyon arabelleği nispeten yavaş akış oranı ile periosteum (0,1-5 µL/dak). Bu perfüzyon sırasında ISF ekstraselüler molekülleri pasif konsantrasyon gradyanı göre soruşturma içine diffüz ve diyalizat toplamak. Bu makale örnek ISF beyinde yöntemine üzerinde duruluyor olsa da, ilke ve yöntemi diğer organlara uygun değişikliğe göre gerekirse uygulanabilir.
O zaman yoğun amino asitler veya nörotransmitter beyinde de dahil olmak üzere küçük moleküller toplamak için kullanılan Microdialysis 1960'ların ve beri ilk istihdam edildi. Ancak, microdialysis probları yüksek moleküler ağırlığı membranlar (100 kDa-3 MDa) kesme son ticari durumu4,5,6 yanı sıra ISF nispeten daha büyük proteinler için uygulama genişletti ,7. Bu sonda kullanarak çalışmaları için bulma açmıştır bu proteinler tau veya α-synuclein gibi uzun olması düşünülen özel sitoplazmik Ayrıca ISF4,5,8' fizyolojik olarak mevcut.
Membranlar (genellikle üzerinde 1.000 kDa) büyük kesik ile microdialysis sonda kullanarak zorluklar Ultrafiltrasyon sıvı kaybı sondalar içinde birikmiş basınç nedeniyle daha duyarlı oldukları biridir. Burada kullanılan Microdialysis sondalar bu sorunu önlemek için benzersiz bir yapıya sahip. Böylece bu sonda ile microdialysis (= Itme) prob ve diyalizat geliyor sonda prizinden toplamak için bir silindir/peristaltik pompa sıvı için bir şırınga pompa kullanarak bir "itme-çekme" modunda ameliyat, basınç bu yapısı sayesinde yerleşik değil (= çekme) 9 (her ne kadar itme ve çekme pompalar, havalandırma delikleri sonda, mevcut iptal baskısı yüzünden ihtiyacı sistem teknik olarak sadece çekme pompası tarafından tahrik edilmektedir). Bu makale kılavuzu kanül implantasyon stereotaksik cerrahi ile başlar ve ISF microdialysis probları ile 1.000 kDa kesme membranlar yoluyla toplamak için microdialysis satırlarını ayarlamak nasıl açıklar.

<table><tbody><tr><td>Univentor 820 Mikro Numune Alma Cihazı</td><td>Univentor</td><td>8303002</td><td>Soğutmalı fraksiyon toplayıcı</td></tr><tr><td>Şırınga pompası</td><td>KD scientific</td><td>KDS-101</td><td></td></tr><tr><td>Makaralı pompa</td><td>Eicom mikrodiyaliz</td><td>ERP-10</td><td></td></tr><tr><td>Ratürn Bağımsız Sistem</td><td>BASi</td><td>MD-1409</td><td>Serbest hareket sistemi</td></tr><tr><td>Çift tür kafes kiti</td><td>BASi</td><td>CX-1600</td><td></td></tr><tr><td>AtmosLM Mikrodiyaliz probu (şaft uzunluğu 8 mm, membran uzunluğu 2 mm)</td><td>Eicom mikrodiyaliz</td><td>PEP-8-02</td><td>Bir prob, bir kılavuz, bir manken prob ve bir stereotaksik adaptör için şaft uzunluğu aynı olmalıdır.</td></tr><tr><td>Mikrodiyaliz kılavuzu (şaft uzunluğu 8 mm)</td><td>Eicom mikrodiyaliz</td><td>PEG-8</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodiyaliz manken probu (şaft uzunluğu 8 mm)</td><td>Eicom mikrodiyaliz</td><td>PED-8</td><td></td></tr><tr><td>Kemik vidası</td><td>BASi</td><td>MD-1310</td><td></td></tr><tr><td>Süper bağ C& B seti</td><td>Sunmedical</td><td></td><td>Diş çimentosu</td></tr><tr><td>Dijital ekran konsollu küçük hayvan Stereotaksik Alet</td><td>Kopf</td><td>Model 940</td><td>Stereotaksik aparat</td></tr><tr><td>Fare ve yenidoğan sıçan adaptörü</td><td>Çalma</td><td>51625</td><td></td></tr><tr><td>Fare Stereotaksik Çalma için Standart Kulak Çubukları ve Kauçuk Uçlar</td><td></td><td>51648</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serumu Sigma'dan</td><td></td> <td>albümin çözeltisiA7284-50ML</td><td>%30 BSA çözeltisi</td></tr><tr><td>FEP boru (70 cm)</td><td>Eicom mikrodiyaliz</td><td>JF-10-70</td><td>İç hacim = 0,5 &mikro; L/cm</td></tr><tr><td>Teflon boru (50 cm)</td><td>Eicom mikrodiyaliz</td><td>JT-10-50</td><td>İç hacim = 0.08 &mikro; L / cm</td></tr><tr><td>Byton tüpü</td><td>Eicom mikrodiyaliz</td><td>JB-30</td><td></td></tr><tr><td>Intramedic luer bıçak adaptörü 23G</td><td>BD</td><td>427565</td><td>Künt uçlu iğne</td></tr><tr><td>Rulo tüp</td><td>Eicom mikrodiyaliz</td><td>RT-5S</td><td>İç hacim = 4 &mikro; L</td></tr><tr><td>Başlık somunu</td><td>Eicom mikrodiyaliz</td><td>AC-5</td><td></td></tr><tr><td>0.25 mL kapaklı mikrosantrifüj tüpü</td><td>QSP</td><td>503-Q</td><td>Fraksiyon toplayıcı için tüpler</td></tr><tr><td>Sterotaksik adaptör (şaft uzunluğu 8 mm)</td><td>Eicom mikrodiyaliz</td><td>PESG-8</td><td></td></tr><tr><td>Bağlantı iğnesi</td><td>Eicom mikrodiyaliz</td><td>RTJ</td><td></td></tr><tr><td>Fare hayvan tasması</td><td>BASi</td><td>MD-1365</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Hızlı Döner Mikromotor kiti</td><td>FOREDOM</td><td>K.1070</td><td>Matkap</td></tr><tr><td>Pikrotoksin</td><td>Sigma</td><td>P1675</td><td></td></tr><tr><td>Kemik vidaları</td><td></td><td></td><td></td>için tornavida</tr><tr><td>Neşter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pamuklu çubuk</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi kesme makinesi</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

vivo microdialysis beyin interstisyel sıvı yüksek moleküler ağırlık kesme ile gelen büyük hücre dışı proteinler toplamak için yöntem probları

In Vivo Microdialysis Method to Collect Large Extracellular Proteins from Brain Interstitial Fluid with High-molecular Weight Cut-off Probes

Vivo microdialysis bir diyaliz ilkesine dayanarak uyanık, özgürce davranmaya hayvanlardan ISF toplamak için güçlü bir tekniktir. Microdialysis amino asitler veya nörotransmiterler gibi nispeten küçük moleküller ölçer kurulan bir yöntem olmakla birlikte, bu son zamanlarda da büyük moleküllerin probları yüksek molekül ağırlıklı kesilmiş ile kullanarak ISF dinamikleri değerlendirmek için kullanılmıştır membranlar. Bu tür sondalar kullanarak üzerine microdialysis sondalar içinde birikmiş basınç önlemek için bir itme-çekme modunda çalışmak zorundadır. Bu makalede stereotaksik cerrahi ve proteinler ISF toplamak için microdialysis satırlarını ayarlamak nasıl da dahil olmak üzere adım adım iletişim kurallarını sağlar. Microdialysis sırasında ilaçların sistemik veya ISF içine doğrudan infüzyon tarafından yönetilebilir. Ters microdialysis doğrudan bileşikler ISF demlemek için bir tekniktir. Uyuşturucu microdialysis perfüzyon arabellekte eklenmesi ISF sonda aynı anda ISF toplarken diffüz almalarını sağlar. Tau protein örnek olarak ölçerek, yazar nasıl kendi düzeyleri uyarıcı nöronal aktivite picrotoxin ters microdialysis tarafından değiştirilmiş gösterir. Avantajları ve microdialysis sınırlamaları genişletilmiş uygulama ile birlikte diğer vivo içinde yöntemleri birleştirerek anlatılmaktadır.

Teşvik veya ters microdialysis11,12,13, picrotoxin, GABAA reseptör antagonisti veya Tetradotoksin nöronal aktivite etkisizleştirmek için Na+ kanal engelleyici kullanılmıştır. Tau yayın nöronal aktivite13,14artış tarafından uyarılır gösterilmiştir. Bunlar ile tutarlı 50 µM picrotoxin (PTX) (daha fazla ayrıntı için kon...

Vivo microdialysis molekülleri uyanık, özgürce davranmaya hayvanlardan beyin interstisyel sıvı (ISF) mevcut topluluğu sağlamıştır. ISF nispeten büyük molekülleri çözümlemek amacıyla geçerli madde özellikle probları yüksek molekül ağırlıklı membranlar kesim ile microdialysis iletişim kuralı'nı odaklanır.

Vivo Microdialysis beyin interstisyel sıvı yüksek moleküler ağırlık kesme ile gelen büyük hücre dışı proteinler toplamak için yöntem probları

In vivo microdialysis is a powerful technique to collect ISF from awake, freely-behaving animals based on a dialysis principle. While microdialysis is an ...

Bu yöntem, sinyal transdüksiyon substrat taşıma ve atık temizleme beyin hücre dışı alanlarda meydana nasıl hakkında nörolojik araştırma alanında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, interstisyel sıvı veya isf serbestçe hareket eden hayvanların büyük hücre dışı moleküllerin örnekleme ve niceliksel sağlar. Ayak ucurlemeye yanıt eksikliğini doğruladıktan sonra, anestezili bir farenin kafatasındaki saçı çıkarın ve kulağı ve burun kelepçesini kullanarak hayvanı bir adaptöre sabitleştirin.Merhemi hayvanın gözlerine uygulayın ve adaptörü stereotaksik cihaza yerleştirin. Kafatası üzerinde sagittally bir deri kesi yapmak ve stereotaksik çerçeve manipülatör üzerine bir matkap eklemek için bir neşter kullanın. Lambda'ya hafifçe dokunana kadar matkabı düşürün ve matkabın DV koordinatını sıfırlayın.Daha sonra, AP ve ML koordinatlarının sıfırlanması için matkabı bregma'ya sıfıra taşıyın. Matkabı bregma'dan dikey koordinata taşıyın. Matkabı kafatasına indirin ve DV koordinatını tekrar sıfıra ayarlayın.Üçüncü bir koordinat için prosedürü tekrarladıktan sonra, hedef koordinatında dikkatlice bir çapak deliği delin ve ardından parietal kemiğin kontralateral tarafında ikinci bir delik açıl. İkinci deliğe bir kemik vidası yerleştirin ve kilit parçasını 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüp kapağından kafatasının üzerine yerleştirin, böylece çapak delikleri dairenin içinde dir. Daha sonra, stereotaksik bağdaştırıcının kısa koluna bir kılavuz kanül yerleştirin ve kanülü bir kap somunla sabitle.Stereotaksik adaptörün uzun kolunu elektrot kelepçesi üzerine ayarlayın ve kolu stereotaksik aygıtın manipülatöre takın. Manipülatör kolundaki DV stereotaksik tertibatını 12 derece döndürün ve kılavuz kanüllerini çapak deliğine taşıyın. Sonra, yavaşça beyne kılavuz kanül 1.2 milimetre indirin.Kılavuz kanül, kemik vidası ve herhangi bir maruz kafatası metal parçası kaplı ve güvenli ve çimento kurumasını sağlar kadar taç diş çimento ekleyin. 12 ila 20 dakika sonra stereotaksik adaptörü elektrot kıskaçından çıkarın, kapak somunu çıkarın ve stereotaksik adaptörü sahte bir sondayla değiştirin. Daha sonra, kapak somunu yeniden bağlayın, fareyi stereotaksik cihazdan bırakın ve fareyi tek bir kafeste tek başına barındırın.Mikrodiyaliz kurmadan önce, distile su ile tek kullanımlık bir mililitreşile şırınga doldurun ve bir mikrodiyaliz prob çıkışına şırınga bağlamak için bir viton tüp kullanın. Havalandırma deliklerini manuel olarak kapatın ve sondayı suyla aşılamak için şırınga pistonuna hafifçe bastırın. Sonda girişinde suyun göründüğünü ve mikrodiyaliz membranının yüzeyine sızıntı olduğunu doğrulayın.Sondayı etkinleştirmek için, sonda membranlarını iki saniye boyunca %70-100 etanolle batırın ve ardından ikinci bir distile su infüzyonu yapın. Bir giriş ve bir çıkış hattına bir bağlantı iğnesi takın ve tek kullanımlık üç mililitrelik şırıngayı taze hazırlanmış perfüzyon tamponuyla yükleyin. Borunun girişine künt uçlu bir iğne yle donatılmış bir şırınga bağlayın ve tüm tüpü perfüzyon tamponuyla doldurmak için bir şırınga pompası kullanın.Tüp dolduğunda, giriş ve çıkış hatları arasındaki bağlantı iğnesini aktif mikrodiyaliz sondası ve kapak somunu ile değiştirin ve bir silindir pompası üzerindeki çıkış borusuna bir rulo tüp monte edin. Dakikada 10 mikrolitre ve dakikada 9,5-9,8 mikrolitre de silindir pompası şırınga pompası başlatın. Şimdi anestezi kılavuzu kanül implante hayvan boynuna yaka yerleştirin ve kapak somun ve kukla sonda kaldırın.Mikrodiyaliz sondasını yavaşça kılavuz kanüle takın ve kapak somunu sabitle. Daha sonra fareyi serbest hareket sistemine bağlı bir kafese yerleştirin ve fareyi yakayla bağlayın. En az bir saat sonra, sırayla silindir pompası ve şırınga pompası durdurmak, şırınga pompası ile pompaları yeniden başlatArak 20% daha hızlı silindir pompası daha ve beyin ISF toplamak için bir soğutmalı fraksiyon toplayıcı üzerinde çıkış boru serbest ucunu yerleştirin.Uygun deneysel hacim elde edildiğinde, sondayı çıkarın ve fare kurtarmayı az önce gösterildiği gibi ele alın. Önceki gözlemlerile tutarlı, uyanık C57B6J farelerde gösterildiği gibi ters mikrodiyaliz ile 50 mikromolar Picrotoksin uygulandığında, interstisyel endojen tau düzeylerinde bir artış bir araç kontrolü ile tedavi edilen hayvanlarda ölçülen seviyelere göre gözlenmektedir. İlaç yönetimlerine ek olarak, mikrodiyaliz EEG kayıt veya optogenetik gibi diğer in vivo yöntemleri ile nöronal aktivite NIN SUBSTRAT konsantrasyonunu nasıl etkilediği ne kadar ek soruları yanıtlamak için kombine edilebilir.

in-vivo-microdialysis-method-to-collect-large-extracellular-proteins

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Hayvanların serbestçe hareket eden, farklı beyin bölgeleri ekstrasellüler nörotransmitter düzeylerinin izlenmesi nörotransmitter salınımı ve davranış arasındaki bağlantıyı irdeliyoruz. Ve bazal nörotransmisyon farmakolojik veya fizyolojik manipülasyonlar nasıl değiştirdiğini hakkında bilgi; in vivo mikrodiyaliz elektrokimyasal algılama ile birleştiğinde mükemmel anatomik ve kimyasal çözünürlük sağlar.

Kemirgenler içinde Kurtarılabilir Stereotaksik Cerrahi

Doğrudan intrahippocampal mikroenjeksiyon ile hipokampal bağımlı uzaysal çalışma belleği Modülasyon, eşlik ve...

Hipokampal İnsülin Mikroenjeksiyon ve<em&gt; In vivo</emMekansal Bellek Test sırasında&gt; mikrodivaliz

Video, bir fare beyninin interstisyel sıvısından (ISF) hücre dışı proteinleri toplamak için bir mikrodiyaliz probu kullanma sürecini göstermektedir. Yüksek moleküler ağırlıklı kesik yarı geçirgen bir membran ile donatılmış bir mikrodiyaliz probu, implante edilmiş bir kılavuz kanül aracılığıyla anestezi uygulanmış bir farenin beynine yerleştirilir. Pompalara bağlı prob, fizyolojik bir tamponun beyin dokusunu perfüze etmesine ve İDF ile karışmasına izin verir. İDF'deki proteinler yarı geçirgen...

Hücre Dışı Proteinleri İzole Etmek için Bir Fare Beyninden İnterstisyel Sıvının Mikrodiyalizi

İnsan ve fare beyin dokusu için üre / tiyoüre / SDS tamponu kullanılarak ortak bir protein ekstraksiyon protokolü sağlar: 2D-dige ve mini 2DE immunoblotting kendi müteakip özellik tayini ile protein indentification. Bu yöntem, insan biyopsi ve deneysel modellerden gerçekleştirilen daha güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için bir olanak sağlar.

Konsensus Beyin kaynaklı protein, 2D-DIGE ve Mini 2DE İmmünoblotting Hem kullanma İnsan ve Kemirgen Beyin proteomun Çalışmaları Ekstraksiyon Protokolü

Mikrodiyaliz sinirbilim araştırmalarında yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Bu nedenle ticari sondalar Büyük demand.In bir sonda düzeneği az 10 $ için güvenilir, eş, ısmarlama Mikrodiyaliz probu oluşturmak için ayrıntılı olarak açıklanmıştır, bu çalışma vardır.

Ismarlama Mikrodiyaliz Probe Tasarım

Burada, sıçan beyin yüzdeki yalıtım ve membran örnekleri hazırlanması için bir yöntemi açıklanmıştır. Bu iletişim kuralı örnekleri kabul edilebilir protein ile bireysel hayvanlardan verim zenginleştirilmiş microvessel üreten açık avantajı vardır. Örnekleri daha sonra beyin mikrovasküler endotel, sağlam protein analizleri için kullanılabilir.

Membran örnekleri taze izole sıçan beyin yüzdeki hazırlamak için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem

Burada, in vivo microdialysis EEG kayıtları ile birlikte epileptik ve sigara-epileptik sıçan ventral hipokampus glutamat ve aspartat sürümde analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Ekstraselüler glutamat ve aspartat konsantrasyonu hastalık farklı aşamalarında ile ilişkili.

Microdialysis fareler serbestçe hareket EEG kayıtları sırasında eksitatör Amino asit

Buradaki protokol, bir mikrodiyaliz sistemi kullanarak uyanık sıçanların hipokampüsünden hücre dışı sıvının ayrıntılı bir gerçek zamanlı dinamik örneklemesini sağlar.

Bir Mikrodiyaliz Sistemi Kullanarak Bilinçli Sıçanlardan Hipokampal Hücre Dışı Sıvının Gerçek Zamanlı Dinamik Toplanması

In vivo, glioblastoma (GBM) gibi birçok merkezi sinir sistemi hastalığının temelini oluşturan hücreler arası iletişim, ölçülmesi ve karakterize edilmesi ile ünlüdür. Burada, GBM'nin uzunlamasına hayvan modelinde interstisyel sıvı bileşenlerini örneklemek için kullanılabilecek serebral açık akış mikroperfüzyon (cOFM) prosedürlerini açıklıyoruz.

Glioblastoma hayvan modelinde interstisyel sıvının boylamasına koleksiyonu için beyin açık akışlı mikroperfüzyonun kullanımı

Silikon sondalar anestezi sıçan kullanarak nöronal aktivitenin Ekstrasellüler kayıtları açıklanacaktır. Bu teknik, aynı anda 100 den fazla nöron birden çok beyin bölgelerinin daha fazla bilgi almak sağlar. Bu tek hücre çözünürlük ile, birden fazla yerel devrelerin nöronal toplulukları dinamikleri hakkında bilgi sağlar.

Anestezi Rat Silikon Probları Büyük ölçekli Nöronal Toplulukları Kaydı

Öğrenin in vivo mikrodiyaliz yöntemiyle yüksek moleküler ağırlık kesmeli problar kullanarak uyanık ve serbest hareket eden hayvanlardan beyin interstisyel sıvısındaki büyük hücre dışı proteinleri toplama tekniğini.

Vivo Microdialysis beyin interstisyel sıvı yüksek moleküler ağırlık kesme ile gelen büyük hücre dışı proteinler toplamak için yöntem probları (Video) | JoVE Journal

Vivo Microdialysis beyin interstisyel sıvı yüksek moleküler ağırlık kesme ile gelen büyük hücre dışı proteinler toplamak için yöntem probları

Daha fazla video keşfet