Histotipik Doku Kültürü

Histotipik doku kültürü, hücrelerin üç boyutlu olarak büyütülmesine izin verir, böylece doku onarımı için uygun yapılar olarak kullanılabilecek gerçekçi doku fonksiyonunu yakından taklit eden in vitro doku morfolojileri oluşturur. Bu kültürler tipik olarak yüksek yoğunlukta büyütülen tek bir hücre tipinden oluşan üç boyutlu yapılardır. İskele olarak da bilinen üç boyutlu yapı, doğal hücre dışı matrisi taklit eder. Kullanılan hücre tipine bağlı olarak, iskeleler belirli bir uygulama için tasarlanabilir ve tipik olarak biyo-mimetik doku için bir şablon görevi görür. Bu video, histotipik doku kültürlerinin temellerini, hücrelerin izolasyonu için bir prosedürü ve kalp dokusunu taklit etmek için gözenekli bir ipek doku iskelesinin üretimini ve hücreselleştirilmesini tanıtacaktır.

Tüm dokular, hücre dışı matriks ve içinde yaşayan dokuya özgü hücreler olmak üzere iki temel bileşenden oluşur. Hücre dışı matris, hücrelerin işgal etmesi için üç boyutlu bir ortam yaratan bir yapısal proteinler ağıdır ve içindeki hücreler, dokunun doğal fizyolojik süreçlerini özetlemek içindir. Şu anda, dokuyu modellemek için kullanılan yaygın bir teknik, hücrelerin düz bir substrat üzerine dağıtıldığı ve ince bir film oluşturmasına izin verilen iki boyutlu doku kültürüdür. Genel olarak, bu yöntem bir in vivo fenotip, organa özgü işlevler ve hücreden hücreye veya hücreden substrata bağlamsal etkileşimleri sürdürmek için güvenilir değildir. Histotipik doku kültürü, hücrelerin büyümesi için 3 boyutlu bir iskele sağlayarak bu sınırlamaları hafifletir, bu da doğal hücre morfolojilerini daha yakından taklit eden ve gerçekçi hücreler arası ağların ve iletişim yollarının geliştirilmesini kolaylaştıran yoğun bir hücre ağı ile sonuçlanır. Hidrojeller ve elektrospun ipek paspaslar dahil olmak üzere çeşitli 3D polimer ağları, dokuya özgü hücreleri üç boyutlu olarak kültürlemek için uygun yollar sunar. Bu iskeleleri doldurmak için hücrelerin izole edilmesi gerekir. Bu videoda kullanılan birincil hücreler, hedef hücreleri hücre dışı matristen ayırmak için kıyılmış ve daha sonra bir enzim çözeltisi içinde sindirilen canlı dokudan toplanır. Hücreler izole edildikten sonra, iskeleleri tohumlamak için kullanılan iki teknik vardır. Damlacık tekniği, bir hücre çözeltisinin iskeleye yavaş ve sabit bir hızda pipetlenmesini içerir. İkinci veya hücre süspansiyon tekniği, iskeleyi bir hücre süspansiyonuna batırır. Genellikle, iskele ve süspansiyon, matrise hücre göçünü teşvik etmek için çalkalanır. Her iki teknik de yüksek hücre yoğunluklarına sahip biyo-mühendislik yapılarıyla sonuçlanır. Aşağıdaki prosedürler, doğal kalp dokusu morfolojisini koruyacağı için, kardiyak hücrelerin izolasyonunu ve kardiyak hücreye özgü bir iskele oluşturmak için hücre süspansiyon tekniğini içerecektir.

Hücreleri donör dokudan izole etme işlemine başlamak için, çalışma alanının ve diseksiyon aletlerinin sterilize edildiğinden emin olarak başlayın. Ardından, biyo-güvenlik kabinindeki çalışma yüzeyine steril bir örtü yerleştirin. Steril cerrahi aletleri hiç dokunmadan örtünün üzerine yerleştirin ve ardından steril 20 numara neşter bıçağını açın. Numuneyi ötenazi yaptıktan sonra, cerrahi alanı betadin ile ıslatılmış bir gazlı bezle sterilize edin. Hazır olduğunda, numuneyi sabitleyin ve ilgilenilen dokuyu izole etmek için cerrahi prosedüre başlayın. Bu durumda, kalp olacaktır. Eksize edildikten sonra, dokuyu PBS glikozu içeren Petri kabındaki buzun üzerine yerleştirin. Kalan kanı veya bağ dokusunu çıkarın ve ardından dokuyu taze PBS glikozlu bir Petri kabına aktarın. Daha sonra steril mikro makas ve forseps kullanarak doku örneklerini dikkatlice kabaca 1 milimetreküp parçalar halinde doğrayın. Bir pipet kullanarak parçaları ve tamponu konik bir tüpe aktarın. Ardından, 10 mililitre hariç tüm tamponları çıkarın. 7 mililitre kollajenaz çözeltisi ekleyin ve ardından karışımı 37 santigrat derecede 7 dakika çalkalayın. Ardından, doku parçalarını parçalamak için 10 kez hafifçe pipetleyin. Parçaların çökmesine izin verin ve ardından sıvıyı aspire edin ve atın. Daha sonra, sindirimi tekrarlayın ve doku parçalarını parçalamak için çözeltiyi nazikçe pipetleyin. Parçalar yerleştikten sonra, süpernatanı çekin ve ayrı bir 50 mililitrelik konik tüpte toplayın. Ardından, sindirimi durdurmak için süpernatan içeren her bir konik tüpe 10 mililitre STOP çözeltisi ekleyin.

Artık birincil hücreler izole edildiğine göre, gözenekli bir ipek doku iskelesi üretelim. Başlamak için, 30 mililitre ipek çözeltisini bir kalıba dökün. Daha sonra, 60 gram elenmiş sodyum klorürü çözeltinin üzerine eşit olarak dağıtın. Ardından, ipeğin oda sıcaklığında 48 saat boyunca rahatsız edilmeden polimerize olmasına izin verin. Ardından, çapraz bağlamayı sonlandırmak ve kalan sıvıyı buharlaştırmak için kalıbı 1 saat boyunca 60 derecelik bir fırına koyun. Polimerize edildikten sonra, tuzu dışarı atmak için kalıbı 48 saat boyunca damıtılmış su dolu bir behere daldırın. Daha sonra iskeleyi kalıptan çıkarın ve 5 milimetrelik biyopsi zımbası ile küçük diskler kesin. Diskleri 2 milimetre yüksekliğe kadar kesin ve son olarak, bir halka oluşturmak için her parçanın merkezlerini 2 milimetrelik bir biyopsi zımbası ile çıkarın. Son olarak, iskeleleri 20 dakika boyunca ıslak bir döngüde otoklavlayın.

İskele hazırlandıktan sonra hücre tohumlama işlemine başlayalım. İlk olarak, 96 oyuklu bir plakaya kuyucuk başına bir steril iskele yerleştirin. Daha sonra, iskeleleri daldırmak için hücre kültürü ortamı ekleyin ve en az 30 dakika dengelemek için bir doku kültürü inkübatöründe 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyonun ardından, fazla ortamı aspire edin ve ardından izole edilmiş birincil hücre süspansiyonunu iskelelere ekleyin. Daha sonra, plakayı inkübatöre geri koyun ve hücrelerin iskelelere yapışması için gece boyunca bırakın. Ertesi sabah, bağlanmamış hücreleri dikkatlice aspire edin ve oyuk başına 200 mikrolitre taze hücre kültürü ortamı ile değiştirin. Ortaya çıkan iskele, kullanıma hazır yüksek hücre yoğunluğuna sahip gözenekli bir yapıdır.

Artık histotipik doku kültürünü nasıl yapacağınızı öğrendiğinize göre, bu malzemelerin bazı pratik uygulamalarına bakalım. Histotipik doku kültürü, doğal dokuları taklit eden hücresel mikro ortamlar oluşturabilir ve sonuç olarak tek bir hücre tipi ile ilgili hücresel davranışın incelenmesi için uygun bir model sağlayabilir. Örneğin, in vivo bulunan kök hücre nişini daha doğru bir şekilde taklit eden iskelelerdeki 3D fiber, biyolojik ipuçlarını taramak ve kök hücre farklılaşması üzerindeki etkilerini belirlemek için pluripotent kök hücrelerle tohumlanabilir. Bu çalışma nihayetinde kök hücrelerin nasıl farklılaştığına dair daha iyi bir anlayış sağlayabilir ve doku mühendisliği uygulamaları için hücre farklılaşmasını ve yenilenmesini arttırmaya yönelik içgörüler sunabilir. Dinamik kültürler gibi, mekanik koşullandırma da 3D doku iskelesini, doğal dokunun in vivo olarak yaşayabileceği çeşitli mekanik yüklere maruz bırakarak geliştirebilir. Hücre büyümesi sırasında sıkıştırma ve çift eksenli yükler uygulanarak, hücre morfolojisi ve hücre dışı matris bu mekanik yükleri yansıtacak şekilde değiştirilir. Bu, doğal dokuya benzeyen hücresel bir yapıya sahip önceden koşullandırılmış bir biyo-mühendislik doku iskelesi ile sonuçlanır ve bu da onu benzer mekanik kuvvetlere maruz kalabilecek alanlarda implantasyon için ideal hale getirir. Son olarak, doku kusurlarını değiştirmek veya onarmak için tasarlanmış doku yapıları da kullanılabilir. Bunu başarmak için, doku iskelesi önce vaskülarize edilmeli, böylece kanın yapı boyunca serbestçe hareket etmesine izin verilmelidir. Vaskülarize edildikten sonra, iskele onarımı başlatmak için doku defektine aktarılabilir ve implante edilebilir. Başarılı greftleme daha sonra doku yapısının hasarlı bölgeyi tamamen onarıp onarmadığını ortaya çıkaran histoloji yoluyla doğrulanabilir.

Jove'un histotipik doku kültürüne girişini yeni izlediniz. Artık basit 3D yapıların nasıl hazırlandığını, birincil hücrelerin nasıl izole edildiğini ve bir iskele üzerine nasıl tohumlandığını ve bu kültürlerin biyo-mühendislik alanındaki çeşitli uygulamalarını anlamalısınız. İzlediğiniz için teşekkürler.