İnflamatuar hücre dinamiği Drosophila pupa içinde uzun vadeli Vivo içinde izleme
14 Haziran 2018
Burada yüksek spatio-zamansal çözünürlük vivo içindecanlı görüntüleme yara onarım ve ilişkili inflamatuar yanıt için bir iletişim kuralı mevcut. Bu yöntem uzun vadeli görüntüleme ve belirli hücre popülasyonlarının zaman içinde izleme etkinleştirmek için Drosophila geliştirme pupa aşaması kullanır ve verimli RNAi aracılı gen inactivation ile uyumludur.
Bu yeni pupa modelinin uzun vadeli görüntüleme potansiyelini, Drosophila'nın genetik izlenebilirliği ile birlikte kullanarak, bu yöntem yara iyileşmesi ve doğuştan gelen bağışıklık alanlarındaki temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir. Pupa aşaması, daha geleneksel Drosophila yara iyileşme modellerine göre canlı görüntüleme için bazı belirgin avantajlar sunar. Örneğin, pupalar çok daha uzun süreler boyunca görüntülenebilir, deneysel manipülasyon için daha fazla doku alanı mevcuttur ve bu aşamada daha fazla hemosit bulunur.
Ek olarak, RNAi aracılı gen inaktivasyonunun etkinliği, bu pupa aşamaları sırasında önemli ölçüde iyileştirilir ve birçok genin dokuya veya zamana özgü bir şekilde parçalanmasına izin verir. Pupa koleksiyonunu kurmak için 20 bakire dişi ve 20 erkekten oluşan şişeler ayarlayın. Daha sonra görüntüleme seansından 18 saat önce şişelerden en az 10 yeni oluşturulmuş beyaz prepupa toplayın.
Bir pupa toplamak için, iç şişe yüzeyinden çıkarmak için forseps veya ince bir boya fırçası kullanın ve dikkatlice yeni bir sinek şişesinin yanına aktarın. Pupalar istenen zaman noktasına geldikten sonra, bunları bir cam slayt üzerine monte edilmiş çift taraflı yapışkan bant parçasına aktarın. Şimdi parlak bir alan diseksiyon mikroskobu altında, pupaları kılıflarından dikkatlice çıkarın.
Pupaları, ventral tarafları banda sıkıca yapışacak şekilde konumlandırın. Forseps kullanarak pupariumun en ön bölgesinde ilk kesiyi yapın. Bu bölgedeki pupa kılıfının içi boş ve pupa dokusundan yoksun olduğundan emin olun çünkü erken pupa gelişimi sırasında pupa kılıf içinde küçülmüş olacaktır.
Daha sonra, pupa kahverengi opak kırılgan kılıftan tamamen kurtulana kadar pupa kılıfını forseps veya mikromakas kullanarak önden arkaya doğru dikkatlice yırtın veya kesin. Dikkatli olun, bu pupalar çok kırılgandır. Şimdi bu adımda forseps ve mikromakasın pupa yüzeyini delmemesi çok önemlidir.
Çevredeki kılıfı çıkarırken pupa'nın kendisine dokunmaktan kaçının. Şimdi hasar görmemiş pupaları heptan tutkalı kullanarak bir cam alt tabağa monte edin. İlk önce 10 mikrolitrelik bir alikottan bir satır hazırlanmış heptan tutkal bırakın.
Daha sonra, beş saniye kuruduktan sonra, disseke edilmiş pupaları tutkal üzerine dikkatlice aktarmak için forseps kullanın. Öğrenirken, beş pupaya kadar sıralayın. Kazanılan deneyim ile daha fazlası hazırlanabilir.
Pupaları monte etmek için forseps kullanarak pupaları yuvarlayın, böylece kanat kapak camı üzerinde düz olur ve kanat yüzeyinin çoğu kapak camı ile doğrudan temas halinde olur. Son olarak, dehidrasyonu önlemek için, cam alt tabağın yan tarafına damıtılmış suya batırılmış bir parça emici filtre kağıdı ekleyin. Ardından tabağı örtün ve lazerle indüklenen yaralama prosedürüne devam edin.
Monte edilmiş pupaları, ayarlanabilir bir lazer ablasyon sistemi ile donatılmış geniş bir alan mikroskobuna aktarın. Darbeli UV hava soğutmalı nitrojen pompalı ablasyon lazerini uygun boya hücresini kullanarak istenen dalga boyuna ayarlayın. Optimum yaralama için nabız tekrarlama oranını 40 hertz'e ayarlayın.
Şimdi 40 kez veya 63 kez objektif ve parlak alan kullanarak, yaralanacak ilk pupa'nın pupa kanadını bulmak için mikroskop aşama kontrollerini ayarlayın. Cam kapak kaymasına en yakın pupa kanat epitelinin düzlemine odaklanın. Yaralanacak alanı ablasyon lazerinin bilinen hedef alanı ile hizalayın.
Bunu yapmak için, mikroskop merceğindeki artı işareti işaretleyicisinden yararlanın. Ardından, mikroskopta enerji yoğunluğu zayıflatıcı slaytını ayarlayarak lazerin gücünü ayarlayın. Ayarı tekrarlanabilir hale getirmek için tıklama duraklarından yararlanın.
Şimdi bir yara yapmak için, hızlı bir manuel kontrol tıklaması ile ablasyon lazerini etkinleştirin. Ardından, yaralanma ile normal olan ablasyon bölgesinde geçici hava kabarcığının görünümünü kontrol edin. Yaralama başarısız olursa, odak düzlemini değiştirmeyi deneyin.
Alternatif olarak, istenen yara boyutlarına ulaşılana kadar zayıflatıcı sürgüyü kullanarak lazer gücünü kademeli olarak artırın. Pupa kanat kenarlarını yaraladıktan sonra, cam tabanlı çanağı hızlandırılmış görüntüleme için hızlı bir şekilde uygun bir mikroskoba aktarın. Ardından uygun görüntü yakalama yazılımını açın.
Yazılımda, uygun lazerleri açın ve piksel doygunluğu olmadan yeterli floresan sinyali elde etmek için güçlerini ve kazançlarını/ofsetlerini ayarlayın. Genel olarak, %5 ila %20 aralığındaki mümkün olan en düşük lazer gücü, foto ağartmayı en aza indirmek için en iyi sonucu verir. Yara onarımını araştırmak için düşük büyütme altında tüm pupa kanadına odaklanın veya yüksek büyütme altında yaraya odaklanın.
Hem onarıcı epiteli hem de enflamatuar hücre alımını yakalamak için, önce mikroskobu, kontrol panelindeki ince odak ayarını kullanarak bir z-yığını kaydedecek şekilde ayarlayın. Yaralı epitelden, göç eden hemositleri içeren hücre dışı boşluğa kadar tarayın. Ardından, yazılımı pupa kanadı boyunca her üç mikronda bir veya daha da sıkı aralıklarla z-dilimleri kaydedecek şekilde ayarlayın.
Hızlandırılmış görüntüleme için, en az bir saat boyunca en az 30 saniyede bir z yığınlarını kaydedin. Görüntüleme sırasında bir hücre alt kümesini seçici olarak foto dönüştürmek ve etiketlemek için foto dönüştürülebilir probları kullanırken, fotoğraf dönüştürmeyi gerçekleştirmek ve 405 nanometre lazeri etkinleştirmek için görüntüleme yazılımı içindeki uygun modülleri açın. Ardından, bir seçim aracı kullanarak FRAP yazılımı içinde fotoğrafa dönüştürülecek hücreleri seçin.
Ardından, fotoğraf dönüştürme için zaman rotasını tek bir yineleme karesine ayarlayın ve 405 nanometre lazeri %20 lazer gücüne ayarlayın. Ardından, fotoğraf dönüştürme işlemini gerçekleştirmek için Denemeyi Başlat'ı tıklayın. Tamamlandığında, FRAP modülünden çıkın ve orijinal görüntüleme ekranına dönün.
Lazerleri kullanılan floroforlara göre ayarlayın ve hızlandırılmış kayıtları kullanarak foto dönüştürülmüş ve foto dönüştürülmüş olmayan hücreleri görüntüler. Puparium oluşumundan 18 saat sonra Drosophila pupae'nin yaralı kanatları konfokal zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak görüntülendi. Pupa kanat epitelinin lazere bağlı yaralanması, hemosit adı verilen Drosophila doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin yara bölgesine hızlı bir şekilde göç etmesini uyardı.
Hemositler, sırasıyla morfolojilerinin izlenmesine ve görüntülenmesine izin vermek için hem bir nükleer belirteç hem de bir sitoplazmik veya hücre iskeleti belirteci ile etiketlendi. Hemosit nükleer yörüngelerinin izlenmesi, inflamatuar yanıtın karmaşık uzaysal-zamansal dinamiklerini gösterir. Yaralamadan sonraki 30 dakika içinde, yaralanma bölgesine en yakın bulunan hemositler yaraya doğru yönlendirilmiş göçe başlamıştır.
Sonunda, yaralanmadan giderek daha uzakta bulunan hemositler yaraya doğru göç etmeye başlar. Foto dönüştürülebilir florofor Kaede kullanılarak, bu göçmen kanat hemositlerinin alt popülasyonları seçici olarak etiketlendi. Bu yöntem, ilk yaraya alınan hemositlerin, 90 dakika sonra oluşan ikinci bir yaraya geçici olarak duyarsızlaştığını göstermek için kullanılmıştır.
E-kaderini GFP ile hücresel adherens bağlantıları içinde etiketleyerek, yara kenarı kolayca tanımlanabilir ve bu, yara iyileşme dinamiklerinin analizine izin verir. Çoğu yara, yaralanmadan sonraki bir saat içinde yeniden epitelize olmaya başlar. Yara kenarı içe doğru ilerler ve yaralar sonuçta üç saat içinde iyileşir.
Bu tekniğe hakim olduktan sonra, sadece 10 dakika içinde canlı görüntüleme için birden fazla pupa hazırlanabilir, ancak bu prosedürü denerken, pupa vakalarından bir kez diseke edildiğinde, Drosophila pupalarının hasara ve dehidrasyona karşı son derece savunmasız olduğunu hatırlamak önemlidir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, doğuştan gelen bağışıklık alanındaki araştırmacıların, hesaplamalı biyologlarla işbirliği yapmalarının ve enflamatuar hücre alımından sorumlu olan yara çekici sinyallerin davranışını keşfetmek için daha karmaşık matematiksel modelleme uygulamalarının yolunu açmıştır. Ve daha da yakın zamanlarda, alternatif hücre tipleri de lazerin neden olduğu yaralanmalara verdikleri tepkiyi takip etmek için etiketlendi ve bu, adiposit hücrelerinin, Drosophila yağ gövdesi hücrelerinin, bu sistemdeki yaralara da yanıt verdiğini ortaya çıkardı.
Genel Bakış
Bu makale, Drosophila pupalarında yara onarımının ve inflamatuar yanıtın canlı görüntülemesi için bir protokol sunmaktadır. Bu yöntem, spesifik hücre popülasyonlarının uzun süreli görüntülenmesine ve takibine olanak tanıyarak yara iyileşmesi ve doğuştan gelen bağışıklık çalışmalarını geliştirmektedir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- İmmünoloji
Arka Plan
- Drosophila, biyolojik süreçlerin incelenmesi için genetik olarak işlenebilirlik sunar.
- Pupa evresi, geleneksel modellere kıyasla daha uzun süreli görüntüleme imkanı sağlar.
- Hemosit varlığı pupa evresinde daha fazladır, bu da bağışıklık tepkisi çalışmalarını kolaylaştırır.
- RNAi aracılı gen inaktivasyonu pupalarda daha verimlidir.
Çalışmanın Amacı
- Yara iyileşmesinin yüksek çözünürlüklü görüntülemesi için bir protokol geliştirmek.
- Yara onarımı sırasında hemosit göçünün dinamiklerini incelemek.
- Drosophila'daki doğuştan gelen bağışıklık mekanizmalarına ilişkin anlayışı artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Görüntüleme için Drosophila pupalarının toplanması ve hazırlanması.
- Gerçek zamanlı gözlem için pupa kanatlarının lazerle yaralanması.
- Yaralanma sonrası hücresel yanıtları yakalamak için zaman ayarlı (time-lapse) görüntüleme.
- Belirli hücre popülasyonlarını işaretlemek için foto-konvertibıl probların kullanımı.
Ana Sonuçlar
- Hemositlerin yara bölgelerine göçünün başarılı şekilde görüntülenmesi.
- Yara onarımını incelemek için pupa modelinin etkinliğinin kanıtlanması.
- Enflamatuar yanıtla ilişkili temel hücresel dinamiklerin belirlenmesi.
- Yara iyileşmesi üzerine yapılacak gelecek çalışmalar için ayrıntılı bir protokol sunulması.
Sonuçlar
- Drosophila'nın pupa evresi, canlı görüntüleme çalışmaları için avantajlıdır.
- Bu yöntem, yara iyileşme süreçlerinin anlaşılmasına önemli katkılarda bulunabilir.
- Gelecekteki araştırmalar, bağışıklık sistemindeki çeşitli genetik faktörleri incelemek için bu protokolü temel alabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Sektör Uyumluluğu
Bu protokol, genetik olarak manipüle edilebilir bir modelde inflamatuar hücre dinamiklerinin yüksek çözünürlüklü ve uzun süreli görüntülenmesine olanak tanıyarak, doğal bağışıklık yolakları için hedef doğrulama ve assay geliştirme süreçlerindeki mekanistik risklerin azaltılmasını destekler. Gerçek zamanlı hemosit göçü ve yara iyileşme dinamiklerini yakalayarak, erken keşif aşamalarında öngörü güvenilirliğini artıran kantitatif ve tekrarlanabilir veriler sağlar. Bu yaklaşım, terapötik müdahale ile ilgili yara çekici sinyalleri ve hücresel davranışları araştırmak amacıyla, keşif biyolojisi ile hesaplamalı modelleme ekipleri arasındaki fonksiyonlar arası iş birliğini kolaylaştırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Doku hasarına yanıt olarak doğuştan gelen bağışıklık hücresi göçünü ve davranışını izleyerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Hemosit göç dinamiklerinin ve RNAi aracılığıyla genetik perturbasyonlara verilen yanıtın görselleştirilmesi yoluyla fonksiyonel hedef doğrulamasını destekler.
- Öngörücü Değer: Hedef güvenilirliği ve yolak ilgisi hakkında bilgi veren inflamatuar yanıtlara ilişkin spatio-temporal veriler sağlayarak portföy önceliklendirmesini geliştirir.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: Sayısal olarak belirlenebilir bağışıklık hücresi göçü ile standardize edilmiş yara modelleri oluşturarak, valide edilmiş biyolojik sistemleri sonraki tarama aşamaları için hazırlar.
- Operasyonel Değer: Birden fazla pupa üzerinde tutarlı lazer kaynaklı yaralama ve zaman ayarlı görüntüleme protokolleri aracılığıyla analiz tekrarlanabilirliği sorununu çözer.
- Ölçeklenebilirlik: Yöntemde uzmanlaştıktan sonra 10 dakika içerisinde birden fazla örneğin hazırlanmasına olanak tanıyarak orta ölçekli tarama hazırlığını destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Hastalığa özgü bir sistemde korunan inflamatuar süreçleri modelleyerek, keşif gözlemlerini preklinik doğrulamaya bağlar.
- Mekanistik Risk Azaltma: Hemosit yörüngelerinin ve yara re-epitelizasyon dinamiklerinin ayrıntılı analizi yoluyla öngörücü risk azaltmaya odaklanır.
- Biyobelirteç Uyumu: Belirli bağışıklık hücresi alt kümelerini zaman içinde izlemek için Kaede gibi foto-konvertibl floroforlar aracılığıyla translasyonel biyobelirteç araştırmalarını destekler.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hedef doğrulamadan öncü bileşik belirlemeye kadar olan keşif sürecine uyum sağlayarak, erken aşama programlardaki devam/durdurma kararlarına temel oluşturan mekanistik içgörüler sunar.
- Keşif Biyolojisi: Doku hasarı sonrası doğuştan gelen bağışıklık hücresi dinamiklerinin gerçek zamanlı gözlemlenmesini sağlayarak hipotez testlerini ve yolakların aydınlatılmasını destekler.
- Tarama: Standartlaştırılmış yara oluşturma ve hemosit göçü ile temizlenmesinin nicel görüntülemesi yoluyla analiz hazır bulunuşluğu sunar.
- Analitik: Karşılaştırmalı durum analizleri için migrasyon yörüngeleri, yara kapanma hızları ve fotokonversiyon kinetiği dahil olmak üzere ölçülebilir çıktılar üretir.
- Translasyonel Araştırma: İnsan yara iyileşmesi ve inflamasyon yolaklarına uygulanabilir bağışıklık hücresi davranışlarını modelleyerek preklinik süreklilikle bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: İnflamasyonun genetik ve farmakolojik modifikatörlerinin boylamsal çalışmaları için yeniden kullanılabilir bir görüntüleme platformu oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: İnflamatuar hücre göçü ve çözünülmesindeki mekanistik belirsizliği azaltarak, hedef doğrulamadaki öngörü güvenilirliğini artırır.
- Operasyonel Değer: Tanımlanmış pupa hazırlama, yaralama ve görüntüleme iş akışları aracılığıyla standardizasyon, tekrarlanabilirlik ve ölçeklenebilirlik sağlar.
- Stratejik Değer: İmmünomodülatör hedeflerin biyolojik risklerinin erken aşamada azaltılmasını sağlayarak, karar verme süreçlerini ve sermaye verimliliğini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Yolak aktivitesinin ve hücresel yanıt dinamiklerinin nicel değerlendirmesi yoluyla, riske göre ayarlanmış önceliklendirmeyi destekler.
Uygulama Hususları
- Pupal disseksiyonu ve montajının başarılı bir şekilde gerçekleştirilmesi için Drosophila tutma, mikrocerrahi ve konfokal mikroskopi konularında uzmanlık gerektirir.
- Hassas ve tekrarlanabilir yara indüksiyonu için lazer ablasyon sistemlerine ve ayarlanabilir UV lazerlere bağımlıdır.
- Tutarlı yara boyutu, görüntüleme aralıkları ve fotokonversiyon protokolleri için ekipler arasında standardizasyon gerektirir.
- Hemositler ve epitel dışındaki diğer hücre tiplerine veya genetik arka planlara genişletildiğinde adaptasyon değerlendirmeleri içerir.
- Disseksiyon sonrası pupa kırılganlığı vedehidratasyon riski gibi, dikkatli taşıma ve çevresel kontroller gerektiren pratik sınırlamalar içerir.
