İnflamatuar hücre dinamiği Drosophila pupa içinde uzun vadeli Vivo içinde izleme
June 14th, 2018
Burada yüksek spatio-zamansal çözünürlük vivo içindecanlı görüntüleme yara onarım ve ilişkili inflamatuar yanıt için bir iletişim kuralı mevcut. Bu yöntem uzun vadeli görüntüleme ve belirli hücre popülasyonlarının zaman içinde izleme etkinleştirmek için Drosophila geliştirme pupa aşaması kullanır ve verimli RNAi aracılı gen inactivation ile uyumludur.
Bu yeni pupa modelinin uzun vadeli görüntüleme potansiyelini, Drosophila'nın genetik izlenebilirliği ile birlikte kullanarak, bu yöntem yara iyileşmesi ve doğuştan gelen bağışıklık alanlarındaki temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir. Pupa aşaması, daha geleneksel Drosophila yara iyileşme modellerine göre canlı görüntüleme için bazı belirgin avantajlar sunar. Örneğin, pupalar çok daha uzun süreler boyunca görüntülenebilir, deneysel manipülasyon için daha fazla doku alanı mevcuttur ve bu aşamada daha fazla hemosit bulunur.
Ek olarak, RNAi aracılı gen inaktivasyonunun etkinliği, bu pupa aşamaları sırasında önemli ölçüde iyileştirilir ve birçok genin dokuya veya zamana özgü bir şekilde parçalanmasına izin verir. Pupa koleksiyonunu kurmak için 20 bakire dişi ve 20 erkekten oluşan şişeler ayarlayın. Daha sonra görüntüleme seansından 18 saat önce şişelerden en az 10 yeni oluşturulmuş beyaz prepupa toplayın.
Bir pupa toplamak için, iç şişe yüzeyinden çıkarmak için forseps veya ince bir boya fırçası kullanın ve dikkatlice yeni bir sinek şişesinin yanına aktarın. Pupalar istenen zaman noktasına geldikten sonra, bunları bir cam slayt üzerine monte edilmiş çift taraflı yapışkan bant parçasına aktarın. Şimdi parlak bir alan diseksiyon mikroskobu altında, pupaları kılıflarından dikkatlice çıkarın.
Pupaları, ventral tarafları banda sıkıca yapışacak şekilde konumlandırın. Forseps kullanarak pupariumun en ön bölgesinde ilk kesiyi yapın. Bu bölgedeki pupa kılıfının içi boş ve pupa dokusundan yoksun olduğundan emin olun çünkü erken pupa gelişimi sırasında pupa kılıf içinde küçülmüş olacaktır.
Daha sonra, pupa kahverengi opak kırılgan kılıftan tamamen kurtulana kadar pupa kılıfını forseps veya mikromakas kullanarak önden arkaya doğru dikkatlice yırtın veya kesin. Dikkatli olun, bu pupalar çok kırılgandır. Şimdi bu adımda forseps ve mikromakasın pupa yüzeyini delmemesi çok önemlidir.
Çevredeki kılıfı çıkarırken pupa'nın kendisine dokunmaktan kaçının. Şimdi hasar görmemiş pupaları heptan tutkalı kullanarak bir cam alt tabağa monte edin. İlk önce 10 mikrolitrelik bir alikottan bir satır hazırlanmış heptan tutkal bırakın.
Daha sonra, beş saniye kuruduktan sonra, disseke edilmiş pupaları tutkal üzerine dikkatlice aktarmak için forseps kullanın. Öğrenirken, beş pupaya kadar sıralayın. Kazanılan deneyim ile daha fazlası hazırlanabilir.
Pupaları monte etmek için forseps kullanarak pupaları yuvarlayın, böylece kanat kapak camı üzerinde düz olur ve kanat yüzeyinin çoğu kapak camı ile doğrudan temas halinde olur. Son olarak, dehidrasyonu önlemek için, cam alt tabağın yan tarafına damıtılmış suya batırılmış bir parça emici filtre kağıdı ekleyin. Ardından tabağı örtün ve lazerle indüklenen yaralama prosedürüne devam edin.
Monte edilmiş pupaları, ayarlanabilir bir lazer ablasyon sistemi ile donatılmış geniş bir alan mikroskobuna aktarın. Darbeli UV hava soğutmalı nitrojen pompalı ablasyon lazerini uygun boya hücresini kullanarak istenen dalga boyuna ayarlayın. Optimum yaralama için nabız tekrarlama oranını 40 hertz'e ayarlayın.
Şimdi 40 kez veya 63 kez objektif ve parlak alan kullanarak, yaralanacak ilk pupa'nın pupa kanadını bulmak için mikroskop aşama kontrollerini ayarlayın. Cam kapak kaymasına en yakın pupa kanat epitelinin düzlemine odaklanın. Yaralanacak alanı ablasyon lazerinin bilinen hedef alanı ile hizalayın.
Bunu yapmak için, mikroskop merceğindeki artı işareti işaretleyicisinden yararlanın. Ardından, mikroskopta enerji yoğunluğu zayıflatıcı slaytını ayarlayarak lazerin gücünü ayarlayın. Ayarı tekrarlanabilir hale getirmek için tıklama duraklarından yararlanın.
Şimdi bir yara yapmak için, hızlı bir manuel kontrol tıklaması ile ablasyon lazerini etkinleştirin. Ardından, yaralanma ile normal olan ablasyon bölgesinde geçici hava kabarcığının görünümünü kontrol edin. Yaralama başarısız olursa, odak düzlemini değiştirmeyi deneyin.
Alternatif olarak, istenen yara boyutlarına ulaşılana kadar zayıflatıcı sürgüyü kullanarak lazer gücünü kademeli olarak artırın. Pupa kanat kenarlarını yaraladıktan sonra, cam tabanlı çanağı hızlandırılmış görüntüleme için hızlı bir şekilde uygun bir mikroskoba aktarın. Ardından uygun görüntü yakalama yazılımını açın.
Yazılımda, uygun lazerleri açın ve piksel doygunluğu olmadan yeterli floresan sinyali elde etmek için güçlerini ve kazançlarını/ofsetlerini ayarlayın. Genel olarak, %5 ila %20 aralığındaki mümkün olan en düşük lazer gücü, foto ağartmayı en aza indirmek için en iyi sonucu verir. Yara onarımını araştırmak için düşük büyütme altında tüm pupa kanadına odaklanın veya yüksek büyütme altında yaraya odaklanın.
Hem onarıcı epiteli hem de enflamatuar hücre alımını yakalamak için, önce mikroskobu, kontrol panelindeki ince odak ayarını kullanarak bir z-yığını kaydedecek şekilde ayarlayın. Yaralı epitelden, göç eden hemositleri içeren hücre dışı boşluğa kadar tarayın. Ardından, yazılımı pupa kanadı boyunca her üç mikronda bir veya daha da sıkı aralıklarla z-dilimleri kaydedecek şekilde ayarlayın.
Hızlandırılmış görüntüleme için, en az bir saat boyunca en az 30 saniyede bir z yığınlarını kaydedin. Görüntüleme sırasında bir hücre alt kümesini seçici olarak foto dönüştürmek ve etiketlemek için foto dönüştürülebilir probları kullanırken, fotoğraf dönüştürmeyi gerçekleştirmek ve 405 nanometre lazeri etkinleştirmek için görüntüleme yazılımı içindeki uygun modülleri açın. Ardından, bir seçim aracı kullanarak FRAP yazılımı içinde fotoğrafa dönüştürülecek hücreleri seçin.
Ardından, fotoğraf dönüştürme için zaman rotasını tek bir yineleme karesine ayarlayın ve 405 nanometre lazeri %20 lazer gücüne ayarlayın. Ardından, fotoğraf dönüştürme işlemini gerçekleştirmek için Denemeyi Başlat'ı tıklayın. Tamamlandığında, FRAP modülünden çıkın ve orijinal görüntüleme ekranına dönün.
Lazerleri kullanılan floroforlara göre ayarlayın ve hızlandırılmış kayıtları kullanarak foto dönüştürülmüş ve foto dönüştürülmüş olmayan hücreleri görüntüler. Puparium oluşumundan 18 saat sonra Drosophila pupae'nin yaralı kanatları konfokal zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak görüntülendi. Pupa kanat epitelinin lazere bağlı yaralanması, hemosit adı verilen Drosophila doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin yara bölgesine hızlı bir şekilde göç etmesini uyardı.
Hemositler, sırasıyla morfolojilerinin izlenmesine ve görüntülenmesine izin vermek için hem bir nükleer belirteç hem de bir sitoplazmik veya hücre iskeleti belirteci ile etiketlendi. Hemosit nükleer yörüngelerinin izlenmesi, inflamatuar yanıtın karmaşık uzaysal-zamansal dinamiklerini gösterir. Yaralamadan sonraki 30 dakika içinde, yaralanma bölgesine en yakın bulunan hemositler yaraya doğru yönlendirilmiş göçe başlamıştır.
Sonunda, yaralanmadan giderek daha uzakta bulunan hemositler yaraya doğru göç etmeye başlar. Foto dönüştürülebilir florofor Kaede kullanılarak, bu göçmen kanat hemositlerinin alt popülasyonları seçici olarak etiketlendi. Bu yöntem, ilk yaraya alınan hemositlerin, 90 dakika sonra oluşan ikinci bir yaraya geçici olarak duyarsızlaştığını göstermek için kullanılmıştır.
E-kaderini GFP ile hücresel adherens bağlantıları içinde etiketleyerek, yara kenarı kolayca tanımlanabilir ve bu, yara iyileşme dinamiklerinin analizine izin verir. Çoğu yara, yaralanmadan sonraki bir saat içinde yeniden epitelize olmaya başlar. Yara kenarı içe doğru ilerler ve yaralar sonuçta üç saat içinde iyileşir.
Bu tekniğe hakim olduktan sonra, sadece 10 dakika içinde canlı görüntüleme için birden fazla pupa hazırlanabilir, ancak bu prosedürü denerken, pupa vakalarından bir kez diseke edildiğinde, Drosophila pupalarının hasara ve dehidrasyona karşı son derece savunmasız olduğunu hatırlamak önemlidir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, doğuştan gelen bağışıklık alanındaki araştırmacıların, hesaplamalı biyologlarla işbirliği yapmalarının ve enflamatuar hücre alımından sorumlu olan yara çekici sinyallerin davranışını keşfetmek için daha karmaşık matematiksel modelleme uygulamalarının yolunu açmıştır. Ve daha da yakın zamanlarda, alternatif hücre tipleri de lazerin neden olduğu yaralanmalara verdikleri tepkiyi takip etmek için etiketlendi ve bu, adiposit hücrelerinin, Drosophila yağ gövdesi hücrelerinin, bu sistemdeki yaralara da yanıt verdiğini ortaya çıkardı.
Genel Bakış
Bu makale, Drosophila pupalarında yara onarımı ve enflamatuar tepkiyi canlı görüntüleme için bir protokol sunmaktadır. Yöntem, uzun süreli görüntüleme ve spesifik hücre popülasyonlarının izlenmesini sağlayarak, yara iyileşmesi ve doğuştan gelen bağışıklık çalışmalarını geliştirmektedir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Immunoloji
Arka Plan
- Drosophila, biyolojik süreçlerin incelenmesi için genetik uygulanabilirliği sunar.
- Pupa aşaması, geleneksel modellere kıyasla daha uzun süreli görüntüleme sağlar.
- Pupa aşamasında hemoksit varlığı daha fazladır, bu da bağışıklık tepkisi çalışmalarını kolaylaştırır.
- RNAi ile genetik inaktivasyon pupalarda daha etkilidir.
Çalışmanın Amacı
- Yara iyileşmesinin yüksek çözünürlüklü görüntüleme protokolünü geliştirmek.
- Yara onarımı sırasında hemoksit migrasyonunun dinamiklerini araştırmak.
- Drosophila'da doğuştan gelen bağışıklık mekanizmalarının anlaşılmasına katkıda bulunmak.
Kullanılan Yöntemler
- Görüntüleme için Drosophila pupalarının toplanması ve hazırlanması.
- Gerçek zamanlı gözlem için pupal kanatların lazerle yapılan yaralandırılması.
- Yara sonrası hücresel tepkileri yakalamak için zaman aşımı görüntüleme.
- Spesifik hücre popülasyonlarını etiketlemek için foto-dönüştürülebilir probların kullanımı.
Ana Sonuçlar
- Yara bölgelerine hemoksit migrasyonunun başarılı görüntülemesini sağladı.
- Pupa modelinin yara onarımını incelemede etkinliğini gösterdi.
- Enflamatuar tepkiyle ilgili önemli hücresel dinamikleri tanımladı.
- Yara iyileşmesinde gelecekteki çalışmalar için detaylı bir protokol sağladı.
Sonuçlar
- Drosophila'nın pupa aşaması, canlı görüntüleme çalışmaları için avantajlıdır.
- Bu yöntem, yara iyileşme süreçlerinin anlaşılmasına önemli katkıda bulunabilir.
- Gelecekteki araştırmalar, bu protokole dayanarak bağışıklıktaki çeşitli genetik faktörleri keşfedebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol enables high-resolution, long-term imaging of inflammatory cell dynamics in a genetically tractable model, supporting mechanistic de-risking in target validation and assay development for innate immunity pathways. By capturing real-time hemocyte migration and wound healing dynamics, it provides quantitative, reproducible data that enhances predictive confidence in early discovery stages. The approach facilitates cross-functional collaboration between discovery biology and computational modeling teams to explore wound attractant signals and cellular behavior relevant to therapeutic intervention.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by tracking innate immune cell recruitment and behavior in response to tissue damage.
- Operational Value: Supports functional target validation through visualization of hemocyte migration dynamics and response to genetic perturbations via RNAi.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by providing spatio-temporal data on inflammatory responses that inform target confidence and pathway relevance.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing standardized wound models with quantifiable immune cell recruitment.
- Operational Value: Addresses assay reproducibility through consistent laser-induced wounding and time-lapse imaging protocols across multiple pupae.
- Scalability: Enables preparation of multiple samples within 10 minutes post-mastery, supporting medium-throughput screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery observations to preclinical validation by modeling conserved inflammatory processes in a disease-relevant system.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive de-risking through detailed analysis of hemocyte trajectories and wound re-epithelialization dynamics.
- Biomarker Alignment: Supports translational biomarker exploration via photo-convertible fluorophores like Kaede to track specific immune cell subsets over time.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing mechanistic insights that inform go/no-go decisions in early-stage programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling real-time observation of innate immune cell dynamics following tissue injury.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized wound generation and quantitative imaging of hemocyte recruitment and clearance.
- Analytics: Generates measurable outputs including migration trajectories, wound closure rates, and photo-conversion kinetics for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling immune cell behavior applicable to human wound healing and inflammation pathways.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for longitudinal studies of genetic and pharmacological modifiers of inflammation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in inflammatory cell recruitment and resolution.
- Operational Value: Delivers standardization, reproducibility, and scalability through defined pupal preparation, wounding, and imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early biological de-risking of immunomodulatory targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantitative assessment of pathway activity and cellular response dynamics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila handling, microsurgery, and confocal microscopy for successful pupal dissection and mounting.
- Dependent on laser ablation systems and tunable UV lasers for precise, reproducible wound induction.
- Necessitates standardization across teams for consistent wound size, imaging intervals, and photo-conversion protocols.
- Involves adaptation considerations when extending to other cell types or genetic backgrounds beyond hemocytes and epithelium.
- Includes practical limitations such as pupal fragility post-dissection and dehydration risk, requiring careful handling and environmental controls.
