Pro-enflamatuar Sitokinlerin İntraserebral Enjeksiyonu ile İndüklenen Yaygın Serebral Kortikal Demiyelinasyonun Sıçan Modeli

Bu prosedürün genel amacı, miyelin oligodendrosit glikoproteine karşı alt klinik bağışıklama kullanarak bir sıçan modelinde her iki serebral yarımkürenin korteksinin yaygın bir demiyelinasyonunu oluşturmak ve ardından implante edilmiş bir kateter aracılığıyla sitokinlerin ilgisel serebral enjeksiyonunu oluşturmaktır. Bu yöntem, multipl skleroz gibi beynin enflamatuar demyelinerasyon hastalıklarında önemli soruların cevaplanabilmesine yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, beyaz madde tıkaçlarına yol açmadan her iki serebral yarımkürenin korteksinde iltihap kaynaklı gri madde demiyelinasyonu oluşturabilmesidir.

Bu tekniğin etkileri, çoğunlukla ilerleyici multipl skleroz tiplerinde gözlenen kortikal demyelinasyon mekanizmalarının daha iyi anlaşılmasına doğru uzanır. Bu prosedüre başlamak için kateteri ve kateter kapağını girişle birleştirin. Daha sonra, kateteri neşterle iki milimetre uzunluğa kesin.

Daha sonra elektrikli tıraş makinesini kullanarak kulaklar arasında uyuşturulmış bir sıçanın başını tıraş edin. Sıçanı stereotaktik çerçeveye yerleştirin ve kulak çubuklarını ve ısırık plakasını kullanarak başını sabitleyin. Başın yatay olduğundan emin olun ve parmak veya forseps ile üzerine basınç uygulayarak stabilitesini kontrol edin.

Daha sonra, ameliyat sırasında kornea kuruluğunu önlemek için yağlama damlaları uygulayın, herhangi bir cerrahi ışığa maruz kalmayı önlemek için gözleri opak bir malzeme ile kapatın. Daha sonra, %70 etanol ve %10 povidon iyot kompleksi uygulamasını değiştirerek tıraşlı bölgeyi temizleyin. Kateteri yerleştirmek için, orta hat boyunca yaklaşık iki santimetre uzunluğunda uzunlamasına bir kesi yapın.

Daha sonra cildi yanlara tutmak için bulldog kelepçeleri kullanın. Pamuk ucu aplikatörü kullanarak kanı çıkarın. Daha sonra periosteumu çıkarın, dokuyu pamuk ucu aplikatörü ile temizleyin, kafatasını ortaya çıkarın ve yaklaşık bir dakika kurumasını bekleyin.

Daha sonra anatomik yer işaretlerini, lambda, bregma ve medial dikişi tanımlayın. Matkap stereotaktik çerçeveye monte edilmişken, matkap ucunun ucunu başlangıç noktası olarak bregma'ya yerleştirin. Bregma'dan iki milimetre posterior ve yanal olarak 2,4 milimetre ortanca dikişe taşıyın.

Ardından, kateter için bu konumda 0,5 milimetre çapında bir delik açın. İlk delikten birkaç milimetre uzakta çapa vidaları için 1,3 milimetre çapında üç delik daha açın. Kemik tozunu yaklaşık bir ila iki mililitre steril PBS ile sulama ile temizleyin ve kafatasını temizleyin.

Daha sonra, çapa vidalarını iki ila üç tam dönüş sıkın. Kafatası yüzeyine dik ilk delikten iki milimetre uzunluğunda bir kateter yerleştirin. Kateteri tutarken, biraz diş çimentosu uygulayın ve kateteri stabilize etmek için diş kürleme ışığına kısa bir süre maruz kalarak polimerize olmasını bırakın.

Daha sonra kateterin etrafına daha fazla diş çimentosu uygulayın, vidaları tuttuurun ve diş çimentosuz diş kürleme ışığıyla yaklaşık 15 ila 30 saniye katılaştırın, çimentonun sertleştiğini onaylayın. İmplantasyondan sonra, cildi resorbable dikiş ön ve katetere posterior ile kapatın. Daha sonra panzehir karışımını deri altından enjekte edin.

Daha sonra profilaktik antibiyotik tedavisi için deri altı enjeksiyonu ile %2,5 enrofloksasin uygulanır. Hayvanı değiştirilmiş kafese geri döndürün ve hipotermiyi önlemek için kızılötesi ışık uygulamasıyla bir ila üç saat gözlem altında tutun. Enrofloksasin tedavisini tekrarlayın ve ameliyattan bir gün sonra enjeksiyonla ağrı kesici için mililitre başına bir miligramda carprofen verin.

Bağışıklama karışımını hazırlamak için, iki adet 10 mililitrelik alt kilit ucu cam şırınnayı üç yönlü bir stopcock'un kısa kollarına bağlayın ve üçüncü çıkışı uzun kolla kapatın. Daha sonra, pipet bir mililitre IFA ve 50 mikrogram rMOG birlikte. Ve karışımı steril PBS ile iki mililitrelik son hacme ayarlayın.

Seyreltilmiş IFA ve rMOG karışımını açık şırınna yerleştirin, ardından karşı piston üzerinde gevşek bir basınç korurken pistona hafifçe yerleştirin. Inoculumu bir şırıngamdan diğerine sürerek, pistonları beyaz ve viskoz olana kadar ileri geri iterek emülsifiye edin. Daha sonra, bir mililitrelik bir alt kilit şırıncısını üç yönlü stopcock'un açık kısa koluna sabitleyin ve inoculum ile doldurun.

Tüm inoculum'u bir mililitre şırıngama dağıtın ve enjeksiyona kadar buzda tutun. Daha sonra, 21 kalibrelik bir iğne kullanarak geçici bir izofluran anestezisi altında kuyruk tabanına 200 mikrolitre IFA ve rMOG karışımını deri altından enjekte edin. İntraserebral sitokin enjeksiyonu için, konektörlü damarın uzunluğunu iki milimetreye ayarlayın.

Bir mililitre şırındını sitokin karışımı ile doldurun. Ardından şırındıcıyı konektörlü kanolaya bağlayın. Daha sonra, canülleri sitokin karışımıyla doldurun, herhangi bir kabarcık oluşturmaktan kaçının.

Ardından şırıngayı programlanabilir şırınga pompasına monte edin ve dakikada 0,2 mikrolitre hızında enjekte etmek üzere programlayın. Pompayı başlatın ve canül ucunda bir hava kabarcığı oluşumunu önlemek için çalışmaya devam edin. Daha sonra kateter kapağını girişle birlikte çıkarın.

Konektörlü cannulayı katetere yerleştirin, vidalayın ve sıkın. Ardından pompayı durdurmadan önce enjeksiyonun 10 dakika devam etmesine izin verin. Enjekte edilen hacmin tamamen yayılması için kanı kateterin içinde 20 dakika bekletin.

Daha sonra, konektör kanülünü sökün ve vakum etkisini önlemek için yavaşça çıkarın. Kateter kapağını girişle birlikte yeniden takın ve vidalayın. Hayvanın anesteziden bir kafeste iyileşmesine izin verin.

Kortikal demiyelinasyon PLP için immün histokimya ile sitokin enjeksiyonundan sonra farklı zaman noktalarında değerlendirilebilir. Şekil 6A, implante kateter aracılığıyla sadece steril PBS alan moggy aşılanmış bir kontrol hayvanında 15. Sitokin enjeksiyonundan sonraki ilk günde, MOG prime hayvanlarında demiyelinasyon zaten tespit edilebilir.

Her ne kadar, sadece kateterize alanın yakın çevresinde olsa da. PLP immünoreaktivitesi, sitokin enjeksiyonundan sonra bir gün kontralteral kortekste bozulmadan kalır. Üçüncü günde, ipsilateral kortekste yayılan PLP immün reaktivite kaybında kademeli bir artış gözlenebilir.

Kontrallateral kortikal demiyelinasyon üçüncü günde de tespit edilebilir, ancak çapa vidalarının altındaki alanla oldukça sınırlıdır. Dokuz ila 15 gün arasında, demyelinasyon her iki yarımkürenin korteksinin büyük kısımlarını etkiler. Kortikal demyelinasyon, her iki yarımkürede de sitokin enjeksiyonu sonrası 30 güne kadar sadece kısmi bir remyelinasyon ile sürdürülür.

Şekil 6J, intraserebral sitokin enjeksiyonundan sonra kortikal gri maddede PLP kaybının nicelliğini göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, miyelin proteinlerine karşı subklinik bağışıklama kullanarak gri maddenin demiyelinasyonunun nasıl üretilme olduğunu iyi anlamalısınız, ardından implante kateterden intraserebral sitokin enjeksiyonu. Bu hayvan modeli, araştırmacılara progresif multipl skleroz türlerinin incelenmesinde yardımcı olabilir, katman gri madde demiyelinasyonu bütün bir işarettir.

İmplantlı kateter, enjeksiyon kaynaklı travmaya neden olmadan preklinik incelemeden potansiyel terapötik ilaçların birden fazla demyelinasyon veya interserebral doğumunu sağlar.