Microsomes ilişkili Alpha-synuclein toplamları için birincil nöronlar eksojen yönetim olarak güçlü hücre modeli liflerinde oluşumu

Bu yöntem, alfa-sinükleinin in vivo olarak agregasyon, yayılma mekanizması ve toksisitesi gibi alfa-sinüklein alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, alfa-sinüklein önceden oluşturulmuş fibrillerin zaman alıcı saflaştırılmasını gerektirmemesidir. Prosedürü göstermek, COLA Laboratuvarı'ndan bir yüksek lisans öğrencisi olan Lucia Rota olacak.

Prosedüre başlamak için homojenizasyon tamponunu hazırlayın ve buz üzerinde tutun. Daha sonra, taze veya donmuş dokuyu 10 ila 15 vuruşlu bir Teflon havaneli homojenizatör kullanarak bir ila 10 hacim buz gibi soğuk homojenizasyon tamponunda homojenize edin. Daha sonra, ilk homojenatın tamamını bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve elde edilen peletteki çekirdekleri ve kırılmamış hücreleri çıkarmak için dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 1.000 kez G'de santrifüjleyin.

Daha sonra, sonuç peletini atın. Daha sonra, süpernatanı temiz bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve ikinci süpernatanı ve peleti elde etmek için soğutmalı bir santrifüj kullanarak dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 10.000 kez G'de santrifüjleyin. Daha sonra bu süpernatanı bir polikarbonat şişeye aktarın ve bir ultrasantrifüj ve sabit açılı bir rotor kullanarak dört santigrat derecede bir saat boyunca 100.000 kez G'de santrifüjleyin.

P100 ham peletini 500 mikrolitre homojenizasyon tamponu ile tekrar süspanse edin. P100 ham peletini temiz bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve soğutmalı bir santrifüjde dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 10.000 kez G'de santrifüjleyin. 20 dakika sonra, süpernatanı atın ve P100'ü 100 mikrolitre homojenizasyon tamponu ile yeniden süspanse edin.

Ardından, numuneyi buz üzerinde iki saniye boyunca sonikasyon yapın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Western Blot gerçekleştirmek için, dikey bir elektroforez aparatı üzerine dört ila %20 tris-glisin poliakrilamid jel gradyanı dökün. Bir mikrogram mikrozomla ilişkili alfa-sinüklein fraksiyonlarını denatüre eden numune tamponunda çözün ve jel üzerine yükleyin.

Farklı bir kuyucuğa, beş mikrolitre protein standardı işaretleyici yükleyin. Jeli, protein markörü jelin sonuna ulaşana kadar bir tris-glisin SDS çalışma tamponunda 100 voltta çalıştırın. Daha sonra, proteinleri bazik bir karbonat tamponu kullanarak bir nitroselüloz membrana aktarın.

Numuneyi gece boyunca 200 miliampere ayarlanmış sabit bir güçle soğuk odada tutun. Ertesi gün, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca orbital çalkalayıcı üzerinde %5 yağsız kuru süt ile membranı PBS-T ile bloke edin. Daha sonra, membranı PBS-T ile kısa bir süre durulayın.

Membranı bir ila 5.000'de SIN-1 ile veya bir ila 5.000'de P-Ser129 alfa-sinüklein antikoru ile PBS-T'de% 2.5 yağsız kuru sütte gece boyunca soğuk odada veya buzdolabında bir orbital çalkalayıcı üzerinde dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, membranı bir orbital çalkalayıcı üzerinde PBS-T ile oda sıcaklığında 10 dakika yıkayın. Membranı, bir orbital çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında bir saat boyunca PBS-T'de% 2.5 yağsız kuru sütte bir ila 3.000'de anti-fare veya tavşan karşıtı HRP konjuge ikincil antikor ile inkübe edin.

Ardından, membranı oda sıcaklığında PBS-T ile üç kez orbital çalkalayıcı ile 10 dakika yıkayın. Sinyali normal kemilüminesans kiti aracılığıyla elde edin. Nöronları tedavi etmek için, orijinal homojenizasyon tamponu ile seyreltilmiş mikrolitre başına bir mikrogram çözeltiye sahip olmak için üç farklı hastalıklı transgenik farenin omuriliğinden elde edilen mikrozomlarla ilişkili alfa-sinüklein agregatlarını çekin.

Daha sonra, ortamın üçte birini çıkarın ve yavaşça taze nöronlar ortamıyla değiştirin. Hücre ortamına bir mikrogram havuzlanmış mikrozomlarla ilişkili alfa-s agregatları ekleyin. İnkübatördeki nöronları 37 santigrat derecede geri getirin.

Ortamı bir hafta boyunca her üç günde bir değiştirmeden numuneye taze ortamın üçte birini ekleyin. Bir haftalık tedaviden sonra, ortamın üçte birini çıkarın ve% 2 B27, mililitre başına 10 mikrogram gentamisin ve iki milimolar glutamin içeren taze ortamla nazikçe değiştirin. Hücreleri sabitlemeden önce bir hafta boyunca her üç günde bir tekrarlayın.

İmmünofloresan yapmak için, kimyasal bir davlumbazda nöronları %2 paraformaldehit ve PBS ile %5 sükroz çözeltisi içinde oda sıcaklığında 15 dakika çalkalamadan sabitleyin. 15 dakika sonra, sabitleme solüsyonunu çıkarın ve nöronları PBS ile üç kez kısaca yıkayın. Daha sonra, oda sıcaklığında beş dakika boyunca PBS'de% 0.3 iyonik olmayan yüzey aktif madde ile nöronlara geçirgenlik geçirin.

Ardından, nöronları PBS ile üç kez kısaca yıkayın. Spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloke etmek için nöronları oda sıcaklığında bir orbital çalkalayıcı üzerinde 30 dakika boyunca% 3 FBS ve PBS ile inkübe edin. Daha sonra, nöronları gece boyunca soğuk odada veya buzdolabında bir orbital çalkalayıcı üzerinde dört santigrat derecede gece boyunca% 3 FBS ve PBS içinde çözünmüş uygun birincil antikor ile inkübe edin.

Ertesi gün, antikor çözeltisini çıkarın ve hücreleri üç kez PBS ile kısa bir süre yıkayın. Daha sonra, nöronları% 3 FBS ve PBS içinde çözünmüş uygun floresan ikincil antikor ile karanlıkta bir orbital çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Antikor çözeltisini çıkarın ve PBS ile üç kez kısa bir süre yıkayın.

Daha sonra, nöronları bir orbital çalkalayıcı üzerinde karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika boyunca DAPI çözeltisi ile boyayın. 15 dakika sonra, antikor çözeltisini çıkarın ve PBS ile üç kez kısa bir süre yıkayın. Lamellerin solmasını önleyici montaj ortamı kullanarak lamel üzerine monte edin.

Bu çalışmada, hastalıklı A53T transgenik farelerden bir mikrogram havuzlanmış mikrozomlarla ilişkili alfa-sinüklein agregatlarının kortikal veya hipokampal nöronların kültür ortamına uygulanması, agregaya özgü alfa-sinüklein antikorları için pozitif, zamana bağlı bir alfa-sinüklein inklüzyonu oluşumunu indükler. İki günlük tedaviden sonra, bu agregalar daha sonraki zaman noktalarında daha bol hale gelecek olan küçük dağınık punkta olarak görünür. İki hafta sonra, alfa-sinüklein inklüzyonları uzun ve olgun boncuk benzeri yapılara benzer, nöronal kültürler boyunca yoğun bir şekilde yayılır, bir nörit paterni izler ve presinaptik ve nörit belirteçleri ile kısmen birlikte lokalize olur.

Bu prosedürü denerken, mikrozomla ilişkili alfa-sinüklein agregatlarının mikrogramlarının kaplanan nöronların yoğunluğuna oranını ayarlamayı ve mikrozomla ilişkili alfa-sinüklein agregatlarını alfa-sinüklein inklüzyonları açısından zengin dokudan izole etmeyi unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, alfa-sinüklein inklüzyonları oluşumunu indüklemek için birincil nöronların tedavisi olarak kullanılmak üzere hastalıklı transgenik farelerden mikrozomla ilişkili alfa-sinüklein agregatlarının nasıl saflaştırılacağını iyi anlamış olmalısınız.